本發(fā)明屬于免疫治療，具體涉及一種nk細(xì)胞特異性的嵌合抗原受體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、近年來，嵌合抗原受體t細(xì)胞(chimeric?antigenreceptor?t，car-t)在血液惡性腫瘤治療中取得了巨大的成就。但是car-t細(xì)胞在臨床應(yīng)用中仍存在一系列挑戰(zhàn)，例如，在實(shí)體瘤的治療中顯示出很低的療效；腫瘤通過丟失抗原的免疫逃逸機(jī)制使得car-t細(xì)胞治療出現(xiàn)脫靶效應(yīng)和耐藥。car-t細(xì)胞需要自體過繼細(xì)胞移植，否則異基因t細(xì)胞可能導(dǎo)致移植物抗宿主病(gvhd)；易產(chǎn)生細(xì)胞因子風(fēng)暴、神經(jīng)毒性等不良反應(yīng)，對(duì)患者的生命造成危害。最新的研究表明，car-nk細(xì)胞可能會(huì)克服car-t細(xì)胞的上述缺陷，并顯示出顯著的抗腫瘤作用。

2、不同于t細(xì)胞，nk細(xì)胞不表達(dá)某一主要識(shí)別受體，而是表達(dá)一系列抑制性受體和激活性受體，nk細(xì)胞的狀態(tài)取決于抑制性信號(hào)和激活性信號(hào)的平衡。抑制性受體主要包括殺傷免疫球蛋白受體(killer?cell?immunoglobulin-like?receptors,kirs)和nkg2a，它們與mhc-i類分子結(jié)合形成免疫耐受從而避免nk細(xì)胞攻擊自身健康組織。激活性受體可分為三類，第一類受體與包含免疫受體酪氨酸激活基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif，itam)的適配分子非共價(jià)結(jié)合，包括cd16、nkp44、nkp46、nkp30、nkg2c和部分激活型kir；第二類受體不通過itam傳遞激活信號(hào)，包括以2b4為代表的淋巴細(xì)胞激活分子相關(guān)受體家族(lymphocytic?activation?molecule(slam)-related?receptorfamily)、nkg2d、dnam-1；第三類是以lfa-1為代表的黏附分子。已有研究表明，對(duì)于靜息狀態(tài)下的nk細(xì)胞來說，除了cd16，沒有哪一個(gè)受體可以單獨(dú)介導(dǎo)nk細(xì)胞脫顆粒發(fā)揮細(xì)胞毒作用，對(duì)于經(jīng)il-2激活的nk細(xì)胞來說，2b4、nkg2d、lfa-1等大多數(shù)激活性受體可以單獨(dú)介導(dǎo)nk細(xì)胞脫顆粒，且nk細(xì)胞不同激活受體之間存在協(xié)同作用。

3、嵌合抗原受體包括三部分：胞外段、跨膜段和胞內(nèi)段，胞外段通常為識(shí)別靶點(diǎn)的單克隆抗體的單鏈可變區(qū)片段(single-chainfragmentvariable，scfv)，跨膜段連接胞外段和胞內(nèi)段，胞內(nèi)段包括共刺激結(jié)構(gòu)域和傳遞激活信號(hào)的結(jié)構(gòu)域。car-nk是指在nk細(xì)胞上裝載嵌合抗原受體，目前，car-nk的設(shè)計(jì)主要沿襲car-t的構(gòu)造，即以cd28/4-1bb的胞內(nèi)段作為共刺激分子，以cd3ζ傳遞激活信號(hào)的第二代car分子，雖然在臨床前模型和臨床試驗(yàn)中驗(yàn)證了其有效性，但nk細(xì)胞激活方式和生物學(xué)特性與t細(xì)胞大有不同，不適宜直接沿用car-t的方式設(shè)計(jì)激活car-nk細(xì)胞。

4、深入理解免疫細(xì)胞的激活方式對(duì)car分子設(shè)計(jì)具有重要意義，對(duì)于t細(xì)胞來說，由tcr-cd3復(fù)合體傳遞的第一信號(hào)和cd28傳遞的第二信號(hào)構(gòu)成的t細(xì)胞雙信號(hào)激活理論奠定了cd28/4-1bb-cd3ζ二代car分子在car-t中的核心地位。如前所述，對(duì)于靜息狀態(tài)下的nk細(xì)胞來說，cd16是唯一可以單獨(dú)激活nk細(xì)胞的受體，因此，了解cd16的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制對(duì)于設(shè)計(jì)nk細(xì)胞特異性的car分子至關(guān)重要。cd16識(shí)別免疫球蛋白lgg的恒定鏈，介導(dǎo)nk細(xì)胞的adcc(抗體依賴的細(xì)胞毒作用)，cd16胞內(nèi)段本身不具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，需通過與ζζ或γγ同二聚體或ζγ異二聚體非共價(jià)配對(duì)傳遞激活信號(hào)，γ亞基是指高親和力免疫球蛋白ε受體亞基γ(fcer1γ)，它是高親和力免疫球蛋白e受體的一個(gè)組成部分。盡管共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明γ或ζ鏈均可以支持cd16的表達(dá)，ζζ,γγ和ζγ二聚體也可以在共轉(zhuǎn)染體系中檢測到，但在生理情況下，cd16更傾向于與γγ同二聚體配對(duì)，因此相較于ζ鏈，γ鏈可能更適合car-nk，實(shí)際上，已有研究表明，以γ鏈作為胞內(nèi)段的car-nk殺傷效果比ζ鏈強(qiáng)，此外，nk細(xì)胞不同激活受體之間存在協(xié)同作用，例如，2b4可以通過降低cd16介導(dǎo)脫顆粒的閾值而發(fā)揮協(xié)同作用，nkg2d和cd16在nk細(xì)胞鈣離子內(nèi)流和脫顆粒方面也有協(xié)同作用，2b4和nkg2d具有協(xié)同脫顆粒的作用，但是其在殺傷方面的表現(xiàn)一般。因此，根據(jù)nk細(xì)胞的激活方式設(shè)計(jì)car分子有望得到更高效能的car-nk。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種nk細(xì)胞特異性的嵌合抗原受體及其應(yīng)用，所述特異性嵌合抗原受體更適合nk細(xì)胞激活，具有更好的殺傷靶細(xì)胞的能力。

2、本發(fā)明提供了一種nk細(xì)胞的特異性嵌合抗原受體，包括依次連接的nkg2d跨膜段、2b4胞內(nèi)段結(jié)構(gòu)域和fcer1g的胞內(nèi)段結(jié)構(gòu)域。

3、本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述nkg2d跨膜段的氨基酸序列如seq?id?no.1所示；所述2b4胞內(nèi)段結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列如seq?id?no.2所示；所述fcer1g的胞內(nèi)段結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列如seq?id?no.3所示。

4、本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述特異性嵌合抗原受體的氨基酸序列如seq?idno.4所示。

5、本發(fā)明提供了一種核酸分子，包括編碼上述特異性嵌合抗原受體的基因。

6、本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列如seq?id?no.5所示。

7、本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體，攜帶上述核酸分子。

8、本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因免疫細(xì)胞，包括表達(dá)上述特異性嵌合抗原受體，或者攜帶上述核酸分子或上述表達(dá)載體。

9、本發(fā)明還提供了上述轉(zhuǎn)基因免疫細(xì)胞的構(gòu)建方法，包括以下步驟：將上述表達(dá)載體導(dǎo)入至免疫細(xì)胞中，得到所述轉(zhuǎn)基因免疫細(xì)胞。

10、本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述免疫細(xì)胞包括nk細(xì)胞。

11、本發(fā)明還提供了上述特異性嵌合抗原受體、上述核酸分子、上述表達(dá)載體、上述轉(zhuǎn)基因免疫細(xì)胞在制備預(yù)防和/或治療腫瘤藥物中的用途。

12、有益效果：本發(fā)明提供了一種nk細(xì)胞的特異性嵌合抗原受體，包括依次連接的nkg2d跨膜段、2b4胞內(nèi)段結(jié)構(gòu)域和fcer1g的胞內(nèi)段結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明提供了一種如圖1所示的nk細(xì)胞特異性的嵌合抗原受體：nkg2d(tm)-2b4-fcer1g，nkg2d是一種ii型跨膜蛋白，為保證嵌合抗原受體的方向性，將nkg2d跨膜段(tm)的氨基酸序列倒置用于連接，將2b4胞內(nèi)段結(jié)構(gòu)域作為共刺激序列，將fcer1g的胞內(nèi)段結(jié)構(gòu)域作為信號(hào)傳遞序列。本發(fā)明實(shí)施例中通過細(xì)胞耦聯(lián)形成、顆粒極化、脫顆粒、體外殺傷實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞因子分泌實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明所述特異性嵌合抗原受體具有良好的功能表現(xiàn)。

技術(shù)特征：

1.一種nk細(xì)胞的特異性嵌合抗原受體，其特征在于，包括依次連接的nkg2d跨膜段、2b4胞內(nèi)段結(jié)構(gòu)域和fcer1g的胞內(nèi)段結(jié)構(gòu)域。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述特異性嵌合抗原受體，其特征在于，所述nkg2d跨膜段的氨基酸序列如seq?id?no.1所示；所述2b4胞內(nèi)段結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列如seq?id?no.2所示；所述fcer1g的胞內(nèi)段結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列如seq?idno.3所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述特異性嵌合抗原受體，其特征在于，所述特異性嵌合抗原受體的氨基酸序列如seq?id?no.4所示。

4.一種核酸分子，其特征在于，包括編碼權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述特異性嵌合抗原受體的基因。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如seq?idno.5所示。

6.一種表達(dá)載體，其特征在于，攜帶權(quán)利要求4或5所述核酸分子。

7.一種轉(zhuǎn)基因免疫細(xì)胞，其特征在于，包括表達(dá)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述特異性嵌合抗原受體，或者攜帶權(quán)利要求4或5所述核酸分子或權(quán)利要求6所述表達(dá)載體。

8.權(quán)利要求7所述轉(zhuǎn)基因免疫細(xì)胞的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：將權(quán)利要求6所述表達(dá)載體導(dǎo)入至免疫細(xì)胞中，得到所述轉(zhuǎn)基因免疫細(xì)胞。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述構(gòu)建方法，其特征在于，所述免疫細(xì)胞包括nk細(xì)胞。

10.權(quán)利要求1～3任一所述特異性嵌合抗原受體、權(quán)利要求4或5所述核酸分子、權(quán)利要求6所述表達(dá)載體、權(quán)利要求7所述轉(zhuǎn)基因免疫細(xì)胞在制備預(yù)防和/或治療腫瘤藥物中的用途。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種NK細(xì)胞特異性的嵌合抗原受體及其應(yīng)用，屬于免疫治療技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種NK細(xì)胞的特異性嵌合抗原受體，包括依次連接的NKG2D跨膜段、2B4胞內(nèi)段結(jié)構(gòu)域和FCER1G的胞內(nèi)段結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明還公開了所述特異性嵌合抗原受體的編碼基因和包含所述編碼基因的表達(dá)載體，以及基因編輯免疫細(xì)胞和在制備預(yù)防和/或治療腫瘤藥物中的用途。本發(fā)明通過細(xì)胞耦聯(lián)形成、顆粒極化、脫顆粒、體外殺傷實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞因子分泌實(shí)驗(yàn)證明所述特異性嵌合抗原受體具有良好的功能表現(xiàn)。

技術(shù)研發(fā)人員：張偉,潘長青,翟優(yōu),李冠璋,王晨,江濤
受保護(hù)的技術(shù)使用者：北京市神經(jīng)外科研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9