本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地說，是一種靶向降解ctgf的溶酶體靶向嵌合體自組裝膠束及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、三陰性乳腺癌(tnbc)侵襲性強(qiáng)、易復(fù)發(fā)、預(yù)后差。一線化療效果不佳且易耐藥，新興免疫治療響應(yīng)率低，亟需探索有效的靶向治療策略。多項分析揭示了tnbc高異質(zhì)性腫瘤微環(huán)境與癌癥進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和治療響應(yīng)之間的復(fù)雜關(guān)系。研究表明細(xì)胞外基質(zhì)蛋白結(jié)締組織生長因子(ctgf)在tnbc組織中過度表達(dá)，并與tnbc的生長和轉(zhuǎn)移高度相關(guān)。ctgf作為一種多功能蛋白，能夠與腫瘤微環(huán)境中的功能蛋白質(zhì)相互作用，促進(jìn)腫瘤增殖、遷移、血管生成和轉(zhuǎn)移，因此靶向ctgf的拮抗劑在抗tnbc治療中極具價值。目前，ctgf的單克隆抗體fg-3019/pamrevlumab聯(lián)合化療已完成i期臨床試驗。然而，由于ctgf的柔性鉸鏈區(qū)易被水解，且其水解后的結(jié)構(gòu)域仍可分別發(fā)揮促癌功能，僅靶向ctgf單一結(jié)構(gòu)域的抗體藥物難以完全抑制ctgf活性，限制了抗體藥物的療效。

2、近年來，靶向蛋白降解(targeted?protein?degradation，tpd)技術(shù)已成為一種頗具潛力的腫瘤治療手段，該技術(shù)能夠特異性地識別并降解目標(biāo)致病蛋白，實現(xiàn)蛋白功能的完全抑制。其中，溶酶體靶向嵌合體(lysosome-targeting?chimera，lytac)技術(shù)是一種用于靶向降解胞外蛋白與膜蛋白的新型策略，已逐漸應(yīng)用于新藥研發(fā)?；趌ytac策略開發(fā)靶向ctgf的新型藥物能夠克服抑制劑或抗體藥物面臨的挑戰(zhàn)，具有重要應(yīng)用前景。此外，相比于抗體為靶頭的lytac，基于多肽靶頭的lytac具有易于設(shè)計合成、分子量小且生物安全性高的優(yōu)勢，然而多肽藥物在生理環(huán)境下穩(wěn)定性較低，半衰期較短，限制了其體內(nèi)應(yīng)用。

3、納米遞藥系統(tǒng)具有改善多肽藥物體內(nèi)穩(wěn)定性和生物分布、延長包封藥物的體內(nèi)循環(huán)時間、降低藥物毒副作用從而提高其治療效果等優(yōu)點，目前廣泛地應(yīng)用于腫瘤藥物的靶向遞送。由于腫瘤微環(huán)境中谷胱甘肽的濃度(2-10mm)比正常組織高100倍，將藥物與膠束材料通過谷胱甘肽響應(yīng)性的二硫鍵連接，其能夠?qū)崿F(xiàn)藥物在腫瘤部位的選擇性釋放，減少全身毒副作用，增強(qiáng)療效。

4、因此，本發(fā)明基于降解ctgf的lytac，設(shè)計構(gòu)建具有還原響應(yīng)性的自組裝膠束nanocly，該膠束能夠在體內(nèi)長效循環(huán)，并特異性蓄積在三陰性乳腺癌腫瘤部位，在腫瘤微環(huán)境相對高濃度谷胱甘肽的條件下釋放多肽lytac?cl8-m6p3，實現(xiàn)ctgf降解，高效抑制三陰性乳腺癌的體內(nèi)生長、肺轉(zhuǎn)移與骨轉(zhuǎn)移。目前還未見類似的報道。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種降解ctgf的溶酶體靶向嵌合體自組裝膠束及其制備方法和應(yīng)用，所述的這種降解ctgf的溶酶體靶向嵌合體自組裝膠束及其制備方法和應(yīng)用要解決現(xiàn)有技術(shù)中的藥物治療三陰性乳腺癌的效果不佳的技術(shù)問題。

2、本發(fā)明提供了一種多肽類的降解ctgf蛋白的溶酶體靶向嵌合體，其結(jié)構(gòu)式如下所示，

3、

4、本發(fā)明還提供了上述的多肽類的降解ctgf蛋白的溶酶體靶向嵌合體的制備方法，包括如下步驟：

5、(1)依據(jù)固相合成法，以rink?amide?mbha氨基樹脂作為載體，2-肟氰乙酸乙酯/n,n’-二異丙基碳二亞胺為縮合體系，得到連接多肽cl8-(pβa)3的樹脂；

6、所述的cl8-(pβa)3的氨基酸序列為：

7、h-cpsaahyl-peg3-pra-βala-pra-βala-pra-βala；其中

8、pra-βala-pra-βala-pra-βala重復(fù)序列提供炔基用于后續(xù)進(jìn)行點擊化學(xué)反應(yīng)，實現(xiàn)甘露糖-6-磷酸修飾；

9、(2)通過銅催化點擊化學(xué)反應(yīng)，以硫酸亞銅/三(芐基三唑基甲基)胺/抗壞血酸鈉為催化劑體系，將連接多肽cl8-(pβa)3的樹脂、疊氮化甘露糖-6-磷酸、硫酸亞銅、三(芐基三唑基甲基)胺與抗壞血酸鈉加入n,n-二甲基甲酰胺和純水的混合溶劑中，室溫避光攪拌反應(yīng)(20～30h)，進(jìn)行切割、純化、凍干得到多肽多肽類的降解ctgf蛋白的溶酶體靶向嵌合體lytac?cl8-m6p3；

10、所述的多肽lytac?cl8-m6p3的氨基酸序列為：

11、h-cpsaahyl-peg3-pra(m6p)-βala-pra(m6p)-βala-pra(m6p)-βala-nh2；

12、結(jié)構(gòu)式如下所示，

13、

14、進(jìn)一步的，所述的cl8-(pβa)3、疊氮化甘露糖-6-磷酸、硫酸亞銅、三(芐基三唑基甲基)胺與抗壞血酸鈉的摩爾比為1：4.5：4.5：4.5：5。

15、本發(fā)明提供了一種降解ctgf蛋白的溶酶體靶向嵌合體自組裝膠束，其結(jié)構(gòu)如下：

16、

17、進(jìn)一步的，上述的自組裝膠束為雙層結(jié)構(gòu)，內(nèi)層是十二烷基，外層是通過二硫鍵連接權(quán)利要求1所述的多肽lytac。

18、本發(fā)明還提供了上述的一種降解ctgf的溶酶體靶向嵌合體自組裝膠束的制備方法，包括如下步驟：

19、(1)依據(jù)固相合成法，以rink?amide?mbha氨基樹脂作為載體，2-肟氰乙酸乙酯/n,n’-二異丙基碳二亞胺為縮合體系，得到連接多肽cl8-(pβa)3的樹脂；

20、所述的cl8-(pβa)3的氨基酸序列為：

21、h-cpsaahyl-peg3-pra-βala-pra-βala-pra-βala；其中

22、pra-βala-pra-βala-pra-βala重復(fù)序列提供炔基用于后續(xù)進(jìn)行點擊化學(xué)反應(yīng)，實現(xiàn)甘露糖-6-磷酸修飾；

23、(2)通過銅催化點擊化學(xué)反應(yīng)，以硫酸亞銅/三(芐基三唑基甲基)胺/抗壞血酸鈉為催化劑體系，將連接多肽cl8-(pβa)3的樹脂、疊氮化甘露糖-6-磷酸、硫酸亞銅、三(芐基三唑基甲基)胺與抗壞血酸鈉加入n,n-二甲基甲酰胺和純水的混合溶劑中，室溫避光攪拌反應(yīng)(20～30h)，進(jìn)行切割、純化、凍干得到多肽多肽類的降解ctgf蛋白的溶酶體靶向嵌合體lytac?cl8-m6p3；

24、所述的多肽lytac?cl8-m6p3的氨基酸序列為：

25、h-cpsaahyl-peg3-pra(m6p)-βala-pra(m6p)-βala-pra(m6p)-βala-nh2；

26、結(jié)構(gòu)式如下所示，

27、

28、(3)將2,2'-二硫二吡啶溶于甲醇中，在攪拌的條件下，滴加1-十二烷硫醇溶液，室溫避光攪拌反應(yīng)3，純化去除過量的2,2'-二硫二吡啶，凍干得到1-十二烷

29、-硫吡啶純品；

30、(4)將1-十二烷-硫吡啶溶于n,n-二甲基甲酰胺中，在攪拌的條件下，滴加多肽lytac?cl8-m6p3水溶液，室溫避光攪拌反應(yīng)，萃取去除過量的1-十二烷-硫吡啶，隨后凍干得到1-十二烷-cl8-m6p3純品；

31、(5)將1-十二烷-cl8-m6p3溶于磷酸鹽緩沖鹽水中，室溫超聲，得到降解ctgf蛋白的lytac自組裝膠束。

32、進(jìn)一步的，所述的cl8-(pβa)3、疊氮化甘露糖-6-磷酸、硫酸亞銅、三(芐基三唑基甲基)胺與抗壞血酸鈉的摩爾比為1：4.5：4.5：4.5：5。

33、進(jìn)一步的，所述的1-十二烷硫醇和2,2'-二硫二吡啶的摩爾比為1：2。

34、進(jìn)一步的，所述的lytac?cl8-m6p3和1-十二烷-硫吡啶的摩爾比為1：2。

35、本發(fā)明還提供了上述的降解ctgf的溶酶體靶向嵌合體自組裝膠束在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

36、本發(fā)明還提供了上述的降解ctgf的溶酶體靶向嵌合體自組裝膠束聯(lián)合紫杉醇在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

37、具體的，所述的腫瘤為三陰性乳腺癌。

38、本發(fā)明的多肽lytac?cl8-m6p3由三部分氨基酸序列組成：(1)靶向ctgf的多肽序列；(2)連接鏈；(3)非陽離子的甘露糖-6-磷酸受體(ci-m6pr)的糖肽序列。

39、多肽lytac?cl8-m6p3中的靶向ctgf多肽序列(h-cpsaahyl-nh2)能夠與ctgf特異性結(jié)合，源自文獻(xiàn)報道[kawaki,harumi?et?al.“design?and?utility?of?ccn2anchorpeptide?aptamers.”biochimie，2010，92，1010-1015]。中間連接鏈為聚乙二醇(peg3)；非陽離子的甘露糖-6-磷酸受體(ci-m6pr)糖肽配體序列(h-pra(m6p)-βala-pra(m6p)-βala-pra(m6p)-βala-nh2)能夠與ci-m6pr特異性結(jié)合，ci-m6pr作為轉(zhuǎn)運體，可介導(dǎo)帶有甘露糖-6-磷酸(m6p)的蛋白質(zhì)進(jìn)入溶酶體，啟動內(nèi)吞-溶酶體途徑實現(xiàn)靶蛋白降解，其中m6p與ci-m6pr特異性結(jié)合源自文獻(xiàn)報道[banik,steven?m?et?al.“l(fā)ysosome-targeting?chimaerasfor?degradation?of?extracellular?proteins.”nature，2020，584，291-297]。

40、本發(fā)明是將親水性的多肽lytac?cl8-m6p3與疏水性的十二烷基通過二硫鍵連接，形成自組裝膠束，構(gòu)建新型納米藥物降解ctgf的lytac自組裝膠束nanocly，以達(dá)到在三陰性乳腺癌腫瘤部位特異性降解ctgf的目的。本發(fā)明可高效降解三陰性乳腺癌腫瘤組織中的ctgf，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。

41、本發(fā)明優(yōu)點在于：

42、1、本發(fā)明的降解ctgf的溶酶體靶向嵌合體自組裝膠束nanocly可降解細(xì)胞外蛋白ctgf，在三陰性乳腺癌細(xì)胞系bt549和mda-mb-231中展現(xiàn)抗增殖與抗遷移活性。

43、2、本發(fā)明的降解ctgf的溶酶體靶向嵌合體自組裝膠束nanocly在腫瘤組織的蓄積相比游離藥物顯著提高。

44、3、本發(fā)明的降解ctgf的溶酶體靶向嵌合體自組裝膠束nanocly可顯著抑制balb/c裸鼠原位三陰性乳腺癌移植瘤的生長與轉(zhuǎn)移，發(fā)揮出比陽性藥ctgf抗體fg-3019更顯著的抗腫瘤作用。

45、4、本發(fā)明的降解ctgf的溶酶體靶向嵌合體自組裝膠束nanocly可顯著下調(diào)炎性腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的激活，抑制炎性細(xì)胞因子與趨化因子的分泌，調(diào)控炎性腫瘤微環(huán)境。

46、5、本發(fā)明的降解ctgf的溶酶體靶向嵌合體自組裝膠束nanocly可協(xié)同化療藥物紫杉醇，顯著增強(qiáng)的抗腫瘤藥效。

47、6、本發(fā)明實現(xiàn)腫瘤組織特異性的ctgf靶向降解，同時實現(xiàn)直接抗腫瘤活性與抑制腫瘤炎性微環(huán)境，具有較好的應(yīng)用前景。