本發(fā)明涉及一種用于mrna遞送的含二硫鍵脂質(zhì)分子及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：

1、基于信使rna(mrna)的藥物技術(shù)在過去幾年中引起了廣泛關(guān)注，因其所具有的優(yōu)越性，這項技術(shù)在蛋白質(zhì)替代療法、癌癥免疫療法和基因編輯等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。當(dāng)下，利用mrna進(jìn)行疾病治療領(lǐng)域的相關(guān)研究發(fā)展的十分迅速。許多相關(guān)方法正在進(jìn)入臨床試驗。因此基于mrna療法(mrna-based?therapeutics)在臨床方面的應(yīng)用具有極大的潛力，可以徹底改變一些疾病的治療前景。

2、與基于質(zhì)粒dna(pdna)或小干擾rna療法相比，基于mrna療法具有很多潛在的優(yōu)點(diǎn)：1)mrna直接在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)功能蛋白，不需要像pdna一樣進(jìn)入細(xì)胞核，因此mrna治療少了穿過細(xì)胞核膜這一障礙，也可以在非分裂細(xì)胞或者分裂很慢的細(xì)胞，如樹枝狀細(xì)胞中高效發(fā)揮作用；2)mrna無需整合進(jìn)細(xì)胞的染色體，可以避免插入性基因突變的危險；3)與rna干擾相比，mrna翻譯目標(biāo)蛋白的過程更加簡單直接，沒有類似sirna的脫靶問題。此外，與相應(yīng)的重組蛋白質(zhì)相比，高電荷密度、柔性的mrna在載體中的負(fù)載效率更高；mrna的制備相對簡單，生物安全性風(fēng)險低。

3、由于脂質(zhì)載體和外源mrna分子的免疫原性，其治療應(yīng)用受到阻礙。雖然脂質(zhì)載體與靶細(xì)胞外的免疫細(xì)胞相互作用，但mrna主要暴露于免疫系統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)組分會產(chǎn)生細(xì)胞因子和干擾素炎癥反應(yīng)，阻止mrna翻譯。因此mrna藥物臨床應(yīng)用所面對的一個主要問題是尋找一種有效且安全的載體。病毒和非病毒載體作為現(xiàn)在被廣泛應(yīng)用的兩種基因遞送載體被人們熟知，雖然病毒載體在遞送效率方面具有明顯優(yōu)勢，但其安全性具有上的顧慮(比如插入性基因突變、癌變或者免疫反應(yīng))大大降低了其直接在人體使用的可能性。由于mrna無法在血液中保持活力，并且非特異性蛋白吸附率過高以及會被免疫相關(guān)細(xì)胞的清除識別等一系列問題的存在，因此其需要合適的非病毒載體輸送載體。

4、作為目前主要的mrna非病毒輸送載體材料，陽離子脂質(zhì)/類脂質(zhì)(lipidoid)分子和陽離子聚合物與膽固醇、peg脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)分子(如dope)混合孵育能夠自組裝形成載體，再負(fù)載mrna就形成了脂質(zhì)納米粒子(lipid?nanoparticle，lnp)。在熟知的mrna輸送體系中其發(fā)展空間廣闊、效果最佳。根據(jù)其他文獻(xiàn)所述，可電離陽離子脂質(zhì)分子遞送mrna的效率是由親疏水平衡關(guān)系、胺的種類和輔助脂質(zhì)的種類三者共同決定的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種用于mrna遞送的含二硫鍵脂質(zhì)分子及其制備方法和用途，本發(fā)明公開了一種能夠有效結(jié)合的mrna的同時并顯著提高其穩(wěn)定性和體內(nèi)外表達(dá)效率的脂質(zhì)分子。

2、所述的一種用于mrna遞送的含二硫鍵脂質(zhì)分子，其結(jié)構(gòu)選自下列之一：

3、(i)

4、

5、(ii)

6、

7、(iii)

8、

9、(iv)

10、

11、(v)

12、

13、所述的一種用于mrna遞送的含二硫鍵脂質(zhì)分子的制備方法，包括以下步驟：

14、1)以2-羥乙基二硫化物，三乙胺，丙烯酰氯為原料溶解于反應(yīng)溶劑中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，冰水浴攪拌反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后得到黃色液體粗產(chǎn)物，先進(jìn)行抽濾，過濾掉白色結(jié)晶，依次用二氯甲烷-飽和食鹽水體系、二氯甲烷-水體系萃取，產(chǎn)物溶解在二氯甲烷中。加熱濃縮，濃縮殘留物經(jīng)硅膠柱層析純化得到原料2,2-二硫二乙醇二丙烯酸酯。

15、2)以2,2-二硫二乙醇二丙烯酸酯(標(biāo)記為dsda)和親水胺為原料，溶解于反應(yīng)溶劑中，并在體系中加入阻聚劑bht，保持反應(yīng)溫度在53-60℃之間持續(xù)反應(yīng)90-100小時，最后得到中間體粗產(chǎn)物，其物理特征為黃色油狀物，使用乙酸乙酯-水體系將黃色油狀物進(jìn)行萃取，中間體粗產(chǎn)物萃取至乙酸乙酯相，經(jīng)硅膠柱層析法純化中間體；

16、3)以純化后的中間體和疏水胺為原料，溶解于反應(yīng)溶劑中，在阻聚劑bht存在下，反應(yīng)溫度為50～60℃，反應(yīng)時間為80-120小時，反應(yīng)結(jié)束后得到黃色油狀物為終產(chǎn)物，最后經(jīng)硅膠柱層析法純化終產(chǎn)物即制備完成；制備本發(fā)明脂質(zhì)分子的反應(yīng)式如下：

17、

18、其中，親水胺(r1-nh2)的結(jié)構(gòu)式為4a1、4a2、4a3中的一種：

19、

20、疏水胺的結(jié)構(gòu)式為c18、2c8、2c10中的一種；

21、

22、具有一條烷烴鏈并且含碳數(shù)為18的稱為c18。具有兩條烷烴鏈并且每條鏈含碳數(shù)為8的稱為2c8。具有兩條烷烴鏈并且每條鏈含碳數(shù)為10的稱為2c10。對于c18來說疏水胺中的r2為一個甲基而r3為c18的直鏈烷基，2c8來說疏水胺中的r2和r3為c8的直鏈烷基，而2c10的r2和r3為c10的直鏈烷基。

23、從上述結(jié)構(gòu)式中可以清晰的了解脂質(zhì)分子中親水胺和疏水胺的具體結(jié)構(gòu)，例如脂質(zhì)分子4a1s-2c10制備的原料親水胺和疏水胺分別為4a1和2c10。

24、所述的一種用于mrna遞送的含二硫鍵脂質(zhì)分子的制備方法，其特征在于步驟1)中，2-羥乙基二硫化物與丙烯酰氯的投料固液比是1g:1-3ml，優(yōu)選為1g:1.5-2ml，2-羥乙基二硫化物與三乙胺的投料固液比是1g:1.5-4ml，優(yōu)選為1g:2-2.5ml，反應(yīng)溶劑為thf；反應(yīng)時間為20-30h，進(jìn)行硅膠柱層析法純化的洗脫溶劑是體積比20-40:1的正己烷-乙酸乙酯混合液。

25、所述的一種用于mrna遞送的含二硫鍵脂質(zhì)分子的制備方法，其特征在于步驟2)中，親水胺與2,2-二硫二乙醇二丙烯酸酯的投料質(zhì)量比是1:10-30，優(yōu)選為1:14-28；2,2-二硫二乙醇二丙烯酸酯與阻聚劑bht的質(zhì)量比是15-30:1，優(yōu)選為20-25:1，反應(yīng)溶劑為dmso。

26、所述的一種用于mrna遞送的含二硫鍵脂質(zhì)分子的制備方法，其特征在于步驟2)中，反應(yīng)溫度為55-56℃，反應(yīng)時間95-96h，以體積比40～50:1的乙酸乙酯-甲醇混合液或者是體積比0.5～2:1的正己烷-乙酸乙酯混合液作為洗脫劑進(jìn)行硅膠柱層析法純化。

27、所述的一種用于mrna遞送的含二硫鍵脂質(zhì)分子的制備方法，其特征在于步驟3)中，純化后的中間體和疏水胺的投料質(zhì)量比是1:1.5-3，優(yōu)選為1:1.8-2.2，中間體和阻聚劑bht的質(zhì)量比是1:0.005-0.015，優(yōu)選為1:0.009-0.01，反應(yīng)溶劑為無水thf。

28、所述的一種用于mrna遞送的含二硫鍵脂質(zhì)分子的制備方法，其特征在于步驟3)中，反應(yīng)溫度為53-60℃，反應(yīng)時間為96-100小時，硅膠柱層析法純化的洗脫劑為乙酸乙酯或者體積比1:10-10:1的正己烷-乙酸乙酯混合液。

29、本發(fā)明提供的脂質(zhì)分子在遞送mrna分子中具有很好的用途。

30、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明涉及的脂質(zhì)分子的突出特點(diǎn)是：

31、1)本發(fā)明合成的脂質(zhì)分子材料中包括關(guān)鍵的胺和疏水單元，研究證明它們是高效的mrna輸送載體必須具備的基團(tuán)。在親水胺選擇上，本發(fā)明分別采用4a1、4a2、4a3，有效調(diào)控材料的親水性和陽離子密度、疏水鏈數(shù)目。在疏水胺方面，本發(fā)明分別采用疏水胺c18、2c8、2c10有效調(diào)控材料的疏水性。

32、2)本發(fā)明合成的脂質(zhì)分子產(chǎn)物結(jié)構(gòu)中帶有多個能質(zhì)子化的n，能有效結(jié)合帶負(fù)電荷的核酸，提高核酸負(fù)載率；帶有適當(dāng)數(shù)目、長度的疏水烷烴鏈，能形成穩(wěn)定性高的納米粒。

33、3)與現(xiàn)有的發(fā)明相比，本發(fā)明合成的脂質(zhì)分子產(chǎn)物結(jié)構(gòu)中將中間碳鏈部分的兩個碳替換成了兩個硫，引入了具有氧化還原響應(yīng)的基團(tuán)，能夠加速材料在細(xì)胞中的解散更好的發(fā)生內(nèi)體逃逸進(jìn)而提高遞送效率。