本發(fā)明屬于微生物檢測領(lǐng)域，涉及一種特異性檢測解淀粉芽孢桿菌的引物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、芽孢桿菌(bacillus)作為醬香白酒高溫大曲中高豐度的釀造功能微生物，因其可產(chǎn)淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、乳酸、丙酸、乙偶姻、吡嗪類物質(zhì)等而受到廣泛關(guān)注。其中解淀粉芽孢桿菌(bacillus?amyloliquefaciens)可以水解不同動物和植物產(chǎn)品、合成不同酶、蛋白和碳水化合物以及可以發(fā)揮益生元和益生菌作用，其在不同環(huán)境中的廣泛存在以及其形成芽孢的能力使其能夠承受極端條件，這也賦予了其在食品加工中的巨大價值。解淀粉芽孢桿菌作為白酒生產(chǎn)中重要的產(chǎn)酶、產(chǎn)吡嗪微生物，準(zhǔn)確鑒定解淀粉芽孢桿菌并將之應(yīng)用于白酒生產(chǎn)中，對白酒品質(zhì)提升具有重要意義。

2、目前對于解淀粉芽孢桿菌的鑒別及定量檢測主要通過選擇培養(yǎng)基的篩選、生理生化鑒定以及16s?rrna測序鑒定和純培養(yǎng)分離計數(shù)的方式。但芽孢桿菌屬的有些種之間親緣關(guān)系較近，具有相似的表型和極高的16s?rrna基因序列同源性，難以進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分。傳統(tǒng)培養(yǎng)計數(shù)的方法培養(yǎng)時間長，易受外界環(huán)境影響，檢測結(jié)果缺乏穩(wěn)定性和可靠性。

3、實(shí)時熒光定量pcr(qpcr)又名熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，被廣泛用于醫(yī)學(xué)、食品等領(lǐng)域的核酸檢測?，F(xiàn)有的一些關(guān)于檢測并定量解淀粉芽孢桿菌的方法有普通pcr法、arms-qpcr(擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)pcr)，或針對其他基因如gyra設(shè)計的特異性引物進(jìn)行qpcr檢測。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、一方面，本發(fā)明提供了一種引物，包括如seq?id?no：1和seq?id?no：2所示的引物對。

2、一方面，本發(fā)明提供了所述的引物的應(yīng)用，為以下a1-a8中的任意一種：

3、a1.鑒別gyrb基因；

4、a2.制備用于鑒別gyrb基因的產(chǎn)品；

5、a3.鑒定待測菌株是否具有g(shù)yrb基因；

6、a4.制備用于鑒定待測菌株是否具有g(shù)yrb基因的產(chǎn)品；

7、a5.鑒定待測樣本中是否存在具有g(shù)yrb基因的菌株；

8、a6.制備用于鑒定待測樣本中是否存在具有g(shù)yrb基因的菌株的產(chǎn)品；

9、a7.鑒定待測菌株是否為解淀粉芽孢桿菌；

10、a8.制備用于鑒定待測菌株是否為解淀粉芽孢桿菌的產(chǎn)品；

11、a9.檢測待測樣本中是否存在解淀粉芽孢桿菌；

12、a10.制備檢測樣本中的解淀粉芽孢桿菌的產(chǎn)品。

13、一方面，本發(fā)明提供了一種含有所述的引物的試劑，所述試劑的用途為以下b1-b5中的任意一種：

14、b1.鑒別gyrb基因；

15、b2.鑒定待測菌株是否具有g(shù)yrb基因；

16、b3.鑒定待測樣本中是否存在具有g(shù)yrb基因的菌株；

17、b4.鑒定待測菌株是否為解淀粉芽孢桿菌；

18、b4.鑒定待測菌株是否為解淀粉芽孢桿菌；

19、b5.檢測樣本中的解淀粉芽孢桿菌。

20、一方面，本發(fā)明提供了一種特異性檢測解淀粉芽孢桿菌的試劑，包含所述的引物。

21、一方面，本發(fā)明提供了一種鑒定待測菌株或待測樣本中是否或疑似是否為，或存在解淀粉芽孢桿菌的方法，包括以下步驟：

22、以待測菌株或待測樣本的核酸為模板，將所述核酸與所述的引物，或所述的試劑接觸，進(jìn)行pcr反應(yīng)后進(jìn)行如下評判：

23、如果擴(kuò)增曲線呈s曲線，且ct值<24，則待測菌株是或疑似是解淀粉芽孢桿菌；或待測樣本中存在或疑似存在解淀粉芽孢桿菌；

24、如果無擴(kuò)增，或

25、擴(kuò)增曲線呈s曲線，且ct值>28，則待測菌株不是或疑似不是解淀粉芽孢桿菌；或待測樣本中不存在或疑似不存在解淀粉芽孢桿菌。

26、在一些實(shí)施方案中，所述待測樣本包括菌株，大曲，酒醅，土壤，豆粕，培養(yǎng)基中的一種或多種。

27、一方面，一種鑒定待測菌株或待測樣本是否或疑似是否為，或存在解淀粉芽孢桿菌的檢測系統(tǒng)，所述檢測系統(tǒng)包含以下構(gòu)件：

28、1)gyrb基因的檢測構(gòu)件；

29、2)數(shù)據(jù)處理構(gòu)件；

30、3)結(jié)果輸出構(gòu)件；

31、所述gyrb基因的檢測構(gòu)件含有所述的引物，或所述的試劑。

32、在一些實(shí)施方案中，所述檢測構(gòu)件包含檢測儀器，所述檢測儀器為熒光定量pcr儀和/或測序儀。

33、在一些實(shí)施方案中，所述數(shù)據(jù)處理構(gòu)件被配置為：

34、根據(jù)檢測構(gòu)件檢測的待測菌株的gyrb基因的檢出與否，判斷待測菌株或待測樣本是否或疑似是否為，或存在解淀粉芽孢桿菌。

35、在一些實(shí)施方案中，所述數(shù)據(jù)處理構(gòu)件的判斷方式為：

36、如果擴(kuò)增曲線呈s曲線，且ct值<24，則待測菌株是或疑似是解淀粉芽孢桿菌；或待測樣本中存在或疑似存在解淀粉芽孢桿菌；

37、如果無擴(kuò)增，或

38、擴(kuò)增曲線呈s曲線，且ct值>28，則待測菌株不是或疑似不是解淀粉芽孢桿菌；或待測樣本中不存在或疑似不存在解淀粉芽孢桿菌。

39、傳統(tǒng)培養(yǎng)法根據(jù)菌落形態(tài)結(jié)合16s測序?qū)獾矸垩挎邨U菌進(jìn)行鑒定，無法區(qū)分解淀粉芽孢桿菌及其親緣性較近的芽孢桿菌，且傳統(tǒng)培養(yǎng)法至少需要24h生長時間。熒光定量檢測法靈敏度高，檢測時間縮短至3h內(nèi)，能夠特異性檢測解淀粉芽孢桿菌，達(dá)到準(zhǔn)確區(qū)分的目的。本發(fā)明可準(zhǔn)確檢測的菌落數(shù)為4.5×107cfu/ml至23cfu/ml，檢測最小限值為23cfu/ml，有極高的靈敏度。

技術(shù)特征：

1.一種引物，包括如seq?id?no：1和seq?id?no：2所示的引物對。

2.如權(quán)利要求1所述的引物的應(yīng)用，為以下a1-a10中的任意一種：

3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述待測樣本包括菌株，大曲，酒醅，土壤，豆粕，培養(yǎng)基中的一種或多種。

4.一種含有如權(quán)利要求1所述的引物的試劑，所述試劑的用途為以下b1-b5中的任意一種：

5.一種特異性檢測解淀粉芽孢桿菌的試劑，其特征在于，包含如權(quán)利要求1所述的引物。

6.一種鑒定待測菌株或待測樣本中是否或疑似是否為，或存在解淀粉芽孢桿菌的方法，其特征在于，包括以下步驟：

7.一種鑒定待測菌株或待測樣本是否或疑似是否為，或存在解淀粉芽孢桿菌的檢測系統(tǒng)，其特征在于，所述檢測系統(tǒng)包含以下構(gòu)件：

8.如權(quán)利要求7所述的檢測系統(tǒng)，其特征在于，所述檢測構(gòu)件包含檢測儀器，所述檢測儀器為熒光定量pcr儀和/或測序儀。

9.如權(quán)利要求7所述的檢測系統(tǒng)，其特征在于，所述數(shù)據(jù)處理構(gòu)件被配置為：

10.如權(quán)利要求7所述的檢測系統(tǒng)，其特征在于，所述數(shù)據(jù)處理構(gòu)件的判斷方式為：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于微生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種特異性檢測解淀粉芽孢桿菌的引物及其應(yīng)用。本發(fā)明針對解淀粉芽孢桿菌gyrB基因設(shè)計特異性引物，利用qPCR技術(shù)，建立解淀粉芽孢桿菌的qPCR檢測方法，實(shí)現(xiàn)特異性檢測樣品中解淀粉芽孢桿菌。經(jīng)特異性、檢出限驗(yàn)證，表明利用本發(fā)明可快速、準(zhǔn)確的鑒定樣品中的解淀粉芽孢桿菌，且相較于傳統(tǒng)鑒定方法有誤差、效率低的缺點(diǎn)，本發(fā)明具有反應(yīng)快速、能實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的定性、定量鑒定的特點(diǎn)。

技術(shù)研發(fā)人員：汪地強(qiáng),李柔,姚尚杰,胡建鋒,胡峰
受保護(hù)的技術(shù)使用者：貴州習(xí)酒股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6