本發(fā)明屬于生物工程，具體涉及一種β-1,4-甘露聚糖酶及其應用。

背景技術：

1、刺槐豆膠也被稱為槐豆膠、角豆膠，通常為白色無味粉末，融水后呈透明度較高的凝膠狀，是產自地中海一帶的刺槐樹種子經過分離精制出的一種植物膠，低溫下部分溶解，需要持續(xù)加熱并保溫才能溶解充分。其含有非常豐富的異甘露聚糖，即半乳甘露聚糖，主鏈由甘露聚糖構成，甘露糖殘基與半乳糖作為結構單元以1,6-α-糖苷鍵連接形成支鏈，因其吸水后粘度較大，可被用作增稠劑、絮凝劑和持水劑，運用于食品、醫(yī)藥、飼料等行業(yè)。刺槐豆膠的降解過程中發(fā)揮主要作用的酶就是β-1,4-甘露聚糖酶，降解后可以降低刺槐豆膠的粘性，生產和提取甘露寡糖進一步利用。

2、β-甘露聚糖酶屬于半纖維素酶類，是一類內切水解酶，是水解甘露聚糖β-1,4-連接骨架的主要酶，能夠水解甘露聚糖和半乳甘露聚糖中主鏈的β-1,4-甘露糖苷鍵。依據(jù)氨基酸序列相似性及結構特性，β-甘露聚糖酶來自gh5家族，催化結構域的空間結構均為(β/α)8-ti?m桶狀結構。當水解甘露聚糖時，該酶可隨機水解其主鏈上的β-1,4-糖苷鍵，使甘露聚糖主鏈被截斷，從而降解為低聚糖混合物，酶解產生的低聚糖也具有豐富的利用價值，其中甘露寡糖因其內源結構具有特殊生物調節(jié)功能和保健功能，例如抗過敏、激活巨噬細胞活性等，可以生產用作食品添加劑和營養(yǎng)素，因此被廣泛運用于食品、醫(yī)藥等領域。目前，市面上存在的β-甘露聚糖酶耐熱性往往達不到工業(yè)要求，導致其在生產運輸過程中生物活性不穩(wěn)定，嚴重限制該酶應用。因此，開發(fā)具有優(yōu)良耐熱性的β-甘露聚糖酶具有重要工業(yè)意義和經濟價值。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決上述技術中的技術問題之一。為此，本發(fā)明提出了一種β-1,4-甘露聚糖酶突變體，其在不降低酶的催化活力的前提下，提高酶的熱穩(wěn)定性，為β-1,4-甘露聚糖酶更好應用于甘露寡糖的制備提供理論依據(jù)。

2、為此，在本發(fā)明的第一個方面中，提供一種β-1,4-甘露聚糖酶突變體，所述突變體是將β-1,4-甘露聚糖酶第325位的glu突變?yōu)閙et，突變體e325m的氨基酸序列如seq?id?no：1所示。

3、根據(jù)本發(fā)明的一種β-1,4-甘露聚糖酶突變體，所述突變體是將野生型β-1,4-甘露聚糖酶的第325位的谷氨酸突變?yōu)榈鞍彼幔c野生型β-1,4-甘露聚糖酶相比，所述突變體的酶活力提高約31％；在60℃處理60min后，突變體e325m的殘余活力比野生型高出17％左右，從而使該熱穩(wěn)定性提高的β-1,4-甘露聚糖酶突變體在甘露寡糖工業(yè)生產中具有良好的應用前景。

4、在本發(fā)明的第二方面中，提供了一種編碼上述β-1,4-甘露聚糖酶突變體的基因，突變體e325m的核苷酸序列如seq?id?no：2所示。

5、在本發(fā)明的第三個方面中，提供了一種構建體，其包含編碼上述β-1,4-甘露聚糖酶突變體的基因。

6、在本發(fā)明的第四個方面中，提供了一種制備上述的β-1,4-甘露聚糖酶突變體的制備方法，包括：

7、利用fireprot在線服務器進行β-1,4-甘露聚糖酶折疊自由能δδg變化分析顯示，結合foldx和rosetta預測β-1,4-甘露聚糖酶熱穩(wěn)定性提高的突變位點，再結合序列保守性分析篩選鑒定得酶活和熱穩(wěn)定性均提高的突變體；

8、將野生型β-1,4-甘露聚糖酶在其第325位的突變位點進行突變，得到所述β-1,4-甘露聚糖酶突變體。

9、根據(jù)本發(fā)明的，通過理性設計的方法對β-1,4-甘露聚糖酶的折疊自由能進行改造來提高酶的熱穩(wěn)定性；采用定點突變技術，以β-1,4-甘露聚糖酶的基因為模板，構建了e325m突變體，與野生型β-1,4-甘露聚糖酶(wt)相比，突變體e325m的酶活力提高約31％，同時突變體e325m的熱穩(wěn)定性大幅提高，在60℃處理60min后，與野生型β-1,4-甘露聚糖酶相比，突變體e325m保留了51％的殘余酶活力，而野生型酶保留了33％的殘余酶活力，突變體e325m的殘余活力比野生型高出17％左右；對突變體e325m進行酶學性質研究，發(fā)現(xiàn)該酶的最適反應溫度和最適ph與野生型一致，分別為60℃、5.0，能專一性降解刺槐豆膠，ph穩(wěn)定性無明顯變化；基于折疊自由能變化的理性設計策略能夠為工業(yè)酶的熱穩(wěn)定性改造提供思路，并對刺槐豆膠的高值化利用及分子改造具有重要意義。

10、在本發(fā)明的第五個方面中，提供了上述β-1,4-甘露聚糖酶突變體在酶解刺槐豆膠制備甘露寡糖中的應用。

11、本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。

技術特征：

1.一種β-1,4-甘露聚糖酶突變體，其特征在于，包括以下步驟：所述突變體是將β-1,4-甘露聚糖酶第325位的glu突變?yōu)閙et，突變體e325m的氨基酸序列如seq?id?no：1所示。

2.一種編碼權利要求1所述的β-1,4-甘露聚糖酶突變體的基因，其特征在于，突變體e325m的核苷酸序列如seq?id?no：2所示。

3.一種構建體，其特征在于，包含如權利要求2所述的基因。

4.一種制備權利要求1所述的β-1,4-甘露聚糖酶突變體的制備方法，其特征在于，包括：

5.如權利要求1所述的β-1,4-甘露聚糖酶突變體在酶解刺槐豆膠制備甘露寡糖中的應用。

技術總結
本發(fā)明提供了一種β?1,4?甘露聚糖酶及其應用，該突變體是將β?1,4?甘露聚糖酶第325位的Glu突變?yōu)镸et，該突變體的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。與野生型β?1,4?甘露聚糖酶相比，所述突變體的酶活力提高約31％；在60℃處理60min后，突變體的殘余活力比野生型高出17％左右，從而使該熱穩(wěn)定性提高的β?1,4?甘露聚糖酶突變體在甘露寡糖工業(yè)生產中具有良好的應用前景。

技術研發(fā)人員：朱艷冰,周婕,倪輝,姜澤東,王興華,鄭明靜,洪濤,李志朋,杜希萍,陳艷紅,楊遠帆
受保護的技術使用者：集美大學
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/1/6