本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵，特別涉及一株高產(chǎn)iaa及蛋白酶的枯草芽孢桿菌shan-1及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、芽孢桿菌屬于厚壁菌門(firmicutes)，是能形成芽孢(內(nèi)生孢子)的桿菌，它們對外界有害因子抵抗力強。目前，研究最多的芽孢桿菌有：枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)、蠟樣芽孢桿菌(bacillus?cereus)、蘇云金芽孢桿菌(bacillusthuringiensis)、炭疽桿菌(bacillus?anthracis)、嗜堿芽孢桿菌(bacillusalcalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(bacillus?amyloliquefaciens)、地衣芽孢桿菌(bacillus?licheniformis)等。其中，枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)，是一種多功能的微生物，具有利用蛋白質(zhì)、脂肪、多種糖及淀粉等多種活性。在飼料工業(yè)、污水處理、生物防治、微生物發(fā)酵技術(shù)等領(lǐng)域中具有廣泛應(yīng)用。

2、生長素(吲哚乙酸，iaa)是調(diào)節(jié)植物生長的重要激素，其化學(xué)本質(zhì)為吲哚乙酸，是最早發(fā)現(xiàn)的促進植物生長的激素。iaa影響植物細胞的分裂，伸長和分化，控制植物的生根和萌發(fā)，并影響植物器官的生長，成熟和衰老。由于植物內(nèi)源激素含量低，因此不可能大量提取它們并將其用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。因此通過其他途徑生成或者合成已成為當(dāng)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展趨勢。蛋白酶是最重要的一種工業(yè)酶制劑，能催化蛋白質(zhì)和多肽水解，廣泛存在于動物內(nèi)臟、植物莖葉、果實和微生物中。工業(yè)上生產(chǎn)蛋白酶制劑主要利用枯草桿菌、棲土曲霉等微生物發(fā)酵制備。

3、在現(xiàn)有研究中，公開號為cn113549575a的中國發(fā)明專利公開了一種可高產(chǎn)蛋白酶的枯草芽孢桿菌fm-20并將其應(yīng)用于禽類飼料研制中，具有良好的抑制有害菌活動、耐受胃酸及高溫等效果。公開號為cn112980739a的中國發(fā)明專利公開了一種可高產(chǎn)iaa及纖維素酶的枯草芽孢桿菌，并發(fā)現(xiàn)其在生物防治辣椒灰霉病上具有良好的應(yīng)用價值。目前，已報道的枯草芽孢桿菌多應(yīng)用于生物防治和飼料研制中，鮮有有研究報道可高產(chǎn)iaa、蛋白酶的枯草芽孢桿菌在花生麩、大豆粕等蛋白農(nóng)副產(chǎn)品發(fā)酵上的應(yīng)用，因此，枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用還有待開發(fā)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一株耐鹽的、高產(chǎn)iaa及蛋白酶的枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)菌株shan-1。

2、本發(fā)明的第二目的在于提供含有上述枯草芽孢桿菌shan-1和/或其發(fā)酵產(chǎn)物的菌劑。

3、本發(fā)明的第三目的在于提供上述枯草芽孢桿菌shan-1或菌劑的應(yīng)用。

4、本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

5、一株枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)shan-1，于2023年03月03日保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為cgmcc?no.26729。

6、菌劑，含有上述枯草芽孢桿菌shan-1和/或枯草芽孢桿菌shan-1的發(fā)酵產(chǎn)物。

7、進一步地，所述的發(fā)酵產(chǎn)物中含有蛋白酶；更進一步地，所述的蛋白酶為中性蛋白酶。

8、進一步地，所述的發(fā)酵產(chǎn)物中還含有生長素；所述的生長素活性高；更進一步地，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)物中還含有生長素時，發(fā)酵前的底物中含有l(wèi)-色氨酸。

9、進一步地，所述的發(fā)酵產(chǎn)物由枯草芽孢桿菌shan-1發(fā)酵花生麩得到。

10、進一步地，所述的發(fā)酵產(chǎn)物由枯草芽孢桿菌shan-1和釀酒酵母菌發(fā)酵花生麩得到。

11、進一步地，所述菌劑還含有藥物可接受的輔料。

12、上述枯草芽孢桿菌shan-1的發(fā)酵產(chǎn)物的制備包括以下步驟：

13、將上述枯草芽孢桿菌shan-1接種到發(fā)酵底物中發(fā)酵。

14、進一步地，所述的發(fā)酵底物包括氮源、碳源和金屬離子，所述氮源包括脫脂奶粉和硫酸銨中的至少一種，所述的碳源包括葡萄糖和麥芽糖中的至少一種，所述的金屬離子包括mg2+、zn2+和ca2+中的至少一種；更進一步地，所述氮源包括脫脂奶粉，所述的碳源包括葡萄糖，所述的金屬離子包括mg2+；再更進一步地，所述的所述氮源包括濃度為10g·l-1的脫脂奶粉，所述的碳源包括濃度為5g·l-1的葡萄糖，所述的金屬離子包括1g·l-1的mg2+。

15、進一步地，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)物中含有生長素時，所述的發(fā)酵底物中含有l(wèi)-色氨酸。

16、更進一步地，所述的發(fā)酵底物包括花生麩；再更進一步地，所述的花生麩為堿解后并酶解后的花生麩。

17、進一步地，枯草芽孢桿菌shan-1的發(fā)酵產(chǎn)物的制備包括以下步驟：

18、(1)花生麩加入水和堿，堿解，得到堿解產(chǎn)物；

19、(2)取堿解產(chǎn)物，調(diào)節(jié)ph至10以上，加入酶，酶解，得到酶解產(chǎn)物；

20、(3)取酶解產(chǎn)物，調(diào)節(jié)ph至6.5～7.5，加入菌懸液和培養(yǎng)基，發(fā)酵。

21、更進一步地，步驟(1)中所述的堿解的條件為：50～70℃、300～400rpm條件下振蕩培養(yǎng)10～15h；再更進一步為60℃、350rpm條件下振蕩培養(yǎng)12h。

22、更進一步地，步驟(2)中所述的酶包括堿性蛋白酶和脂肪酶中的至少一種。

23、更進一步地，步驟(2)中所述的酶的濃度為3～10g/l。

24、更進一步地，步驟(2)中所述的酶解的條件為：25～75℃、250～350rpm條件下振蕩培養(yǎng)15～25h；再更進一步為50℃、300rpm條件下振蕩培養(yǎng)20h。

25、更進一步地，步驟(3)中所述的菌懸液包括枯草芽孢桿菌shan-1菌懸液；在更進一步還包括釀酒酵母菌懸液；

26、所述的枯草芽孢桿菌shan-1菌懸液的制備包括以下步驟：將枯草芽孢桿菌shan-1接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃和180rpm的條件下振蕩培養(yǎng)48h；液體發(fā)酵培養(yǎng)基包括l-色氨酸200mg·l-1、脫脂奶粉6.0～10.0g·l-1，葡萄糖5.0g·l-1、nacl?4.0g·l-1、mgso4·7h2o1g·l-1和k2hpo4?1g·l-1。

27、所述的釀酒酵母菌懸液的制備包括以下步驟：將釀酒酵母接種至pdb培養(yǎng)基中，28℃、180rpm條件下振蕩培養(yǎng)24h。

28、更進一步地，步驟(3)中所述的培養(yǎng)基包括液體發(fā)酵培養(yǎng)基；再更進一步還包括pdb培養(yǎng)基；液體發(fā)酵培養(yǎng)基包括l-色氨酸200mg·l-1、脫脂奶粉6.0～10.0g·l-1，葡萄糖5.0g·l-1、nacl?4.0g·l-1、mgso4·7h2o?1g·l-1和k2hpo4?1g·l-1。

29、更進一步地，步驟(3)中所述的發(fā)酵的條件為：溫度為20～40℃，轉(zhuǎn)速為300～400rpm，發(fā)酵40～60h；再更進一步為：溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為350rpm，發(fā)酵48h。

30、上述枯草芽孢桿菌shan-1或上述菌劑在制備蛋白酶中的應(yīng)用。

31、上述枯草芽孢桿菌shan-1或上述菌劑在制備生長素中的應(yīng)用。

32、上述枯草芽孢桿菌shan-1在制備促進植物生長的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

33、上述枯草芽孢桿菌shan-1或上述菌劑在促進植物生長中的應(yīng)用。

34、上述枯草芽孢桿菌shan-1在制備促進種子萌發(fā)的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

35、上述枯草芽孢桿菌shan-1或上述菌劑在促進種子萌發(fā)中的應(yīng)用。

36、上述枯草芽孢桿菌shan-1在制備抗氧化產(chǎn)品中的應(yīng)用。

37、上述枯草芽孢桿菌shan-1或上述菌劑在抗氧化中的應(yīng)用。

38、上述枯草芽孢桿菌shan-1在制備提高植物果實糖含量的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

39、上述枯草芽孢桿菌shan-1或上述菌劑在提高植物果實糖含量中的應(yīng)用。

40、上述枯草芽孢桿菌shan-1在制備降低植物果實酸含量的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

41、上述枯草芽孢桿菌shan-1或上述菌劑在降低植物果實酸含量中的應(yīng)用。

42、上述枯草芽孢桿菌shan-1在制備降低植物果實酸含量的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

43、上述枯草芽孢桿菌shan-1或上述菌劑在降低植物果實酸含量中的應(yīng)用。

44、所述的生長素為吲哚乙酸。

45、進一步地，所述的植物包括十字花科植物和蕓香科中的至少一種；更進一步為菜心和柑橘中的至少一種。

46、進一步地，所述的植物果實包括蕓香科植物果實；更進一步包括柑橘果實。

47、進一步地，所述的制備蛋白酶的應(yīng)用包括蛋白酶純化的步驟，所述蛋白酶純化采用硫酸銨分級沉淀法純化枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)shan-1所產(chǎn)蛋白酶；更進一步包括以下步驟：將枯草芽孢桿菌shan-1的發(fā)酵產(chǎn)物在磁力攪拌條件添加硫酸銨飽和溶液，待硫酸銨晶體完全溶解后，靜置離心，收集沉淀置于磷酸緩沖溶液中并用透析袋透析即得純化后的蛋白酶。

48、更進一步地，所述硫酸銨飽和溶液的濃度為0～30％、30％～50％、50％～70％或70％～90％；再更進一步為30％～50％。

49、更進一步地，所述的離心條件為：溫度為4℃，轉(zhuǎn)速為8000rpm，離心10min。

50、更進一步地，所述的磷酸緩沖溶液為ph為7.0濃度為20mmol/l的磷酸緩沖溶液。

51、更進一步地，所述用透析袋透析為：4kda分子量透析袋透析36h。

52、本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：

53、本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)shan-1可耐鹽，且具有較強的產(chǎn)iaa和蛋白酶能力。將枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)shan-1應(yīng)用到微生物菌肥中，對植物的生長具有促進作用。在微生物發(fā)酵技術(shù)方面，枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)shan-1可利用花生麩等物質(zhì)作為發(fā)酵底物，其發(fā)酵產(chǎn)物可促進植物的生長，并促進植物果實尤其是柑橘果實的糖分累積。