本發(fā)明涉及大規(guī)模淋巴細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域。本發(fā)明特別地涉及一種特定的細(xì)胞微隔室、其制備方法及其用途。

背景技術(shù)：

1、在最近幾十年間所實(shí)現(xiàn)的進(jìn)展已突顯了細(xì)胞療法在治療寬泛范圍的病狀中的益處。

2、細(xì)胞療法被定義為以預(yù)防、治療或減輕病狀為目標(biāo)而向患者施用活細(xì)胞。目標(biāo)是通過注射治療性細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)久的效果。

3、可設(shè)想多種細(xì)胞療法方法，諸如：

4、-自體方法，在該方法中，患者為他們自己的供體。

5、-同種異體方法，在該方法中，供體與患者不同。

6、細(xì)胞療法涵蓋寬泛范圍的治療領(lǐng)域，并且適用于從多能細(xì)胞到具有代謝功能(例如肝細(xì)胞)或機(jī)械功能(例如成肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞)的特化成體細(xì)胞以及造血譜系諸如單核血細(xì)胞(例如t淋巴細(xì)胞或nk淋巴細(xì)胞)的多種細(xì)胞類型。

7、迄今為止最具有前景的療法中的一種療法為car(嵌合抗原受體)細(xì)胞療法。car-t細(xì)胞為表達(dá)嵌合抗原受體的t淋巴細(xì)胞，嵌合抗原受體為被設(shè)計(jì)成識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面上存在的抗原的人工受體。car-t細(xì)胞引導(dǎo)免疫系統(tǒng)靶向并根除癌細(xì)胞。該方法被認(rèn)為是免疫療法中的重大進(jìn)步，并且當(dāng)前正在開發(fā)許多car-t細(xì)胞以擴(kuò)展它們的用途。通常使用自體方法來產(chǎn)生car-t細(xì)胞。然而，形成同種異體car-t細(xì)胞也是可能的。

8、還存在使用nk(自然殺傷)淋巴細(xì)胞的替代形式。nk淋巴細(xì)胞為具有經(jīng)證實(shí)的抗腫瘤效果的高效能細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞。

9、為了開發(fā)使用淋巴細(xì)胞的基于細(xì)胞的療法(特別是car-t或car-nk療法)的潛力，必要的是能夠依賴于大規(guī)模淋巴細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。

10、免疫細(xì)胞(諸如t或nk淋巴細(xì)胞)的離體生產(chǎn)(尤其是大規(guī)模生產(chǎn))是特別復(fù)雜的。實(shí)際上，迄今為止所開發(fā)的體外培養(yǎng)方法壓力太大并且迅速引起細(xì)胞耗竭，使得大規(guī)模生產(chǎn)淋巴細(xì)胞變得不可能。體內(nèi)免疫細(xì)胞增殖主要發(fā)生在機(jī)械上穩(wěn)定的環(huán)境(諸如實(shí)體組織)中。由于生物反應(yīng)器環(huán)境充滿非生理性剪切應(yīng)力，因此與體內(nèi)擴(kuò)增能力相比，所獲得的擴(kuò)增速率通常仍然不足。

11、目前，尚不存在針對(duì)功能性淋巴細(xì)胞(特別是car-t或car-nk細(xì)胞)的快速大規(guī)模生產(chǎn)的令人滿意的解決方案。

12、對(duì)于car細(xì)胞擴(kuò)增主要使用以下幾種培養(yǎng)方法：靜態(tài)燒瓶培養(yǎng)、靜態(tài)透氣袋培養(yǎng)和搖擺運(yùn)動(dòng)生物反應(yīng)器培養(yǎng)(vormittag?p,gunn?r,ghorashian?s,veraitch?fs.curr?opinbiotechnol.2018)、平臺(tái)(ludwig等人“methods?and?process?optimization?forlarge-scale?car?t?expansion?using?the?g-rex?cell?culture?platform”methods?molbiol?2020；2086:165-177)。

13、然而，由于細(xì)胞暴露于多個(gè)處置步驟增加了污染的風(fēng)險(xiǎn)、細(xì)胞暴露于過度應(yīng)力和/或所使用的平臺(tái)和方法的開發(fā)和能力方面的約束，這些培養(yǎng)方法不適用于大規(guī)模淋巴細(xì)胞生產(chǎn)。此外，培養(yǎng)和儲(chǔ)存中所涉及的工作對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)而言將過于苛刻。

14、為了解決該問題，現(xiàn)有技術(shù)提出在培養(yǎng)淋巴細(xì)胞之前活化淋巴細(xì)胞，以便實(shí)現(xiàn)快速的淋巴細(xì)胞增殖。

15、然而，早期淋巴細(xì)胞活化引起細(xì)胞耗竭的生理過程。耗盡對(duì)應(yīng)于原初t細(xì)胞早期成熟為效應(yīng)t細(xì)胞亞群，限制了移植物體內(nèi)持續(xù)性。

16、現(xiàn)有技術(shù)提出的另一種解決方案是使用懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)基中的水凝膠和藻酸鹽微型管。該方法報(bào)告了在培養(yǎng)14天時(shí)為320的淋巴細(xì)胞擴(kuò)增速率(lin等人adv.healthcaremater.2018,1701297)。

17、然而，盡管該方法提供了令人滿意的擴(kuò)增速率，但其不適用于大規(guī)模培養(yǎng)。該方法將需要開發(fā)專用培養(yǎng)系統(tǒng)，并且將過于復(fù)雜而在大規(guī)模下不適用。

18、另一方面，該方法不能保證淋巴細(xì)胞的功能表型，并且因此不能保證淋巴細(xì)胞的作用是長(zhǎng)久的。

19、每個(gè)淋巴細(xì)胞亞群的分化和功能的復(fù)雜性意味著對(duì)增殖期間的表型的分析對(duì)于任何基于淋巴細(xì)胞的療法(特別是使用car-t或car-nk細(xì)胞的那些療法)的成功而言是必不可少的。

20、較低分化的t-細(xì)胞亞群諸如原初t淋巴細(xì)胞和tscm(干細(xì)胞樣記憶t細(xì)胞)淋巴細(xì)胞看起來在確保在患者中的長(zhǎng)久效果方面是特別重要的(vita?golubovskaya和lijun?wu(cancers?2016,8,36)。而且，記憶樣nk亞群使得臨床應(yīng)答能夠持續(xù)(romee等人“cytokineactivation?induces?human?memory-like?nk?cells”blood?2012年12月6日；120(24):4751-60)。

21、另一方面，我們還知道效應(yīng)t淋巴細(xì)胞亞群對(duì)于保證對(duì)靶細(xì)胞的顯著效果是必不可少的。

22、因此，看起來有必要在大規(guī)模淋巴細(xì)胞培養(yǎng)期間控制細(xì)胞亞群以獲得持續(xù)性與體內(nèi)功效之間的最佳比率。

23、當(dāng)前涉及淋巴細(xì)胞的生產(chǎn)方法非常昂貴且難以按比例放大，引起混合質(zhì)量的淋巴細(xì)胞和減小的持續(xù)性。

24、因此，迫切需要一種使得能夠大規(guī)模生產(chǎn)具有功能表型的淋巴細(xì)胞以滿足對(duì)于基于淋巴細(xì)胞的細(xì)胞療法的急切需求的解決方案。

25、因此，本發(fā)明的目標(biāo)是滿足所有這些需要并克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和限制。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了滿足該目的，本發(fā)明提出使用一種特定的微隔室來獲得適用于細(xì)胞療法中的淋巴細(xì)胞的大規(guī)模生產(chǎn)。

2、為此，本發(fā)明的目標(biāo)是一種卵形、圓柱形、球狀體或球形形狀或基本上卵形、圓柱形、球狀體或球形形狀的封閉三維細(xì)胞微隔室，該封閉三維細(xì)胞微隔室的最小尺寸介于200μm與400μm之間，該封閉三維細(xì)胞微隔室包括界定內(nèi)部部分的外水凝膠層，所述內(nèi)部部分包含在培養(yǎng)基中的形成聚集的三維培養(yǎng)物的介于500個(gè)與5000個(gè)之間的淋巴細(xì)胞并且具有小于100ng/ml培養(yǎng)基的內(nèi)源性腫瘤壞死因子(tnfα)含量。

3、優(yōu)選地，微隔室的內(nèi)部部分包含小于0.5μg/ml培養(yǎng)基的穿孔素含量、和/或小于1μg/ml培養(yǎng)基的顆粒酶b含量、和/或小于0.5μg/ml培養(yǎng)基的il6含量、和/或小于0.5μg/ml培養(yǎng)基的gm-csf含量。

4、有利地，根據(jù)本發(fā)明的微隔室使得能夠生產(chǎn)具有功能表型的淋巴細(xì)胞，同時(shí)保證快速大規(guī)模生產(chǎn)。

5、根據(jù)特別合適的實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明的微隔室包含淋巴細(xì)胞，該淋巴細(xì)胞形成沒有內(nèi)腔的聚集的三維培養(yǎng)物。

6、根據(jù)本發(fā)明的微隔室可在添加或未添加細(xì)胞外基質(zhì)的情況下以及根據(jù)變體在添加或未添加細(xì)胞外基質(zhì)元素的情況下封裝淋巴細(xì)胞之后獲得。

7、有利地，在淋巴細(xì)胞封裝時(shí)未添加細(xì)胞外基質(zhì)或基質(zhì)元素改善了它們?cè)谂囵B(yǎng)3天之后的擴(kuò)增速率。

8、根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選目標(biāo)，在封裝先前活化的淋巴細(xì)胞之后已獲得根據(jù)本發(fā)明的微隔室。淋巴細(xì)胞活化有利地刺激根據(jù)本發(fā)明的微隔室的內(nèi)部部分中的淋巴細(xì)胞增殖。根據(jù)一個(gè)變體，可在封裝之后在微隔室中進(jìn)行淋巴細(xì)胞活化。

9、根據(jù)另一個(gè)特別合適的實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明的微隔室包含表達(dá)嵌合抗原受體的淋巴細(xì)胞。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的微隔室包含t淋巴細(xì)胞時(shí)，其優(yōu)選地包含濃度大于20％，甚至更優(yōu)選地大于40％的原初和/或tscm淋巴細(xì)胞。

10、有利地，此類高濃度的原初和/或tscm淋巴細(xì)胞保證了長(zhǎng)久的效果并且避免了早期淋巴細(xì)胞耗竭的現(xiàn)象。

11、根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選目標(biāo)，本發(fā)明涉及一組微隔室。

12、根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種用于制備微隔室或一組微隔室的方法，該方法包括至少實(shí)現(xiàn)以下步驟：培育、封裝和培養(yǎng)步驟。最終，本發(fā)明的目標(biāo)是根據(jù)本發(fā)明的微隔室，該微隔室用于作為藥物進(jìn)行使用，優(yōu)選地用于預(yù)防或治療自身免疫疾病、免疫缺陷綜合征、癌癥、病毒性疾病或炎性疾病。

13、其它特征和優(yōu)點(diǎn)將從本發(fā)明的具體實(shí)施方式和以下實(shí)施例顯現(xiàn)出來。