本發(fā)明涉及熒光探針領(lǐng)域，具體涉及一種化合物、熒光團(tuán)簇、免疫熒光團(tuán)簇及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、免疫熒光染色技術(shù)是指利用熒光分子等發(fā)光劑對(duì)抗體進(jìn)行標(biāo)記后，借助熒光顯微鏡等儀器，對(duì)細(xì)胞等生物樣品的特征抗原進(jìn)行定量分析或定位研究的技術(shù)，在微生物學(xué)、免疫學(xué)、病理學(xué)及免疫組織化學(xué)等領(lǐng)域具有重要意義。納米抗體(nanobody,nb)是一種來(lái)源于駝科動(dòng)物的新型抗體，是目前具有完整抗原識(shí)別功能的最小分子片段。其相對(duì)分子質(zhì)量為12-15kd，僅為傳統(tǒng)抗體的十分之一，可特異性地結(jié)合傳統(tǒng)抗體難以識(shí)別接近的細(xì)胞表面隱藏抗原，有助于實(shí)現(xiàn)高靈敏的免疫熒光染色。

2、納米抗體表面標(biāo)記熒光分子的信號(hào)強(qiáng)度是決定其熒光成像的質(zhì)量與分析結(jié)果的重要因素。傳統(tǒng)熒光分子依靠于特定的熒光基團(tuán)發(fā)射熒光，在激發(fā)次數(shù)過多、激發(fā)時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，其熒光團(tuán)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生不可逆變化，無(wú)法再發(fā)出熒光，導(dǎo)致光漂白現(xiàn)象，嚴(yán)重影響樣品熒光信號(hào)的分析。花菁型、吡咯硼型熒光分子具有一定的抗光漂白能力，但其疏水性較強(qiáng)，將其偶聯(lián)在小尺寸納米抗體表面時(shí)易引發(fā)抗體變性、失活。碳量子點(diǎn)、上轉(zhuǎn)換納米材料、稀土配合物等熒光材料具有良好的抗光漂白能力，但也存在各種不足，比如熒光信號(hào)不穩(wěn)定、量子產(chǎn)率低、檢測(cè)成本高昂、制備過程復(fù)雜。

3、聚集誘導(dǎo)發(fā)光(aie，aggregation?induced?emission)材料是一種新型熒光材料，其特性在于通過可分子聚集的方式限制分子內(nèi)部運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的熱能，進(jìn)而促使光能輸出比例，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)。aie材料聚集態(tài)產(chǎn)生的熒光信號(hào)具有穩(wěn)定性好、抗光漂白能力強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，在生物成像領(lǐng)域廣受期待。四苯基乙烯是一種廉價(jià)易得的aie分子母體，可在聚集態(tài)下發(fā)射熒光信號(hào)。但是四苯基乙烯疏水性極強(qiáng)，僅溶解于有機(jī)溶劑。也就是說(shuō)，只有在含乙醇、dmso等有機(jī)溶劑的反應(yīng)環(huán)境中，aie分子母體才能與納米抗體進(jìn)行偶聯(lián)。但是，有機(jī)溶劑會(huì)破壞納米抗體結(jié)構(gòu)，從而影響納米抗體活性，進(jìn)而影響免疫熒光染色的效果。因此，aie分子母體雖具有上述優(yōu)勢(shì)，但其非水溶性阻礙了其在免疫熒光染色的應(yīng)用。

4、發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)aie分子能在非有機(jī)溶劑依賴的反應(yīng)環(huán)境中實(shí)現(xiàn)與納米抗體偶聯(lián)，才能真正實(shí)現(xiàn)aie分子在納米抗體免疫熒光染色應(yīng)用。為達(dá)此目標(biāo)，發(fā)明人嘗試探索如何解決具有疏水特性的aie分子與納米抗體偶聯(lián)時(shí)必須依賴有機(jī)溶劑環(huán)境的問題。諸如在水環(huán)境下實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)，水環(huán)境如純水、磷酸鹽緩沖液(pbs)、2-(n-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液(mes)、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液(tris)，則可避免有機(jī)試劑對(duì)納米抗體結(jié)構(gòu)破壞，保證納米抗體活性，從而實(shí)現(xiàn)高靈敏的免疫熒光染色。

5、為實(shí)現(xiàn)上述在水環(huán)境下進(jìn)行與納米抗體偶聯(lián)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可通過將aie分子改性為完全水溶性，則可實(shí)現(xiàn)上述目的。文獻(xiàn)(acs?appl.mater.interfaces?2021,13,17,19625–19632)通過引入磺酸基(-so3)增加了四苯基乙烯的水溶性，雖提高了分子的親水性，但也無(wú)法實(shí)現(xiàn)其在100％純水溶劑中的溶解，不是完全水溶性的aie分子。因此，將其或者其團(tuán)簇與納米抗體偶聯(lián)，仍必須在含有有機(jī)溶劑的反應(yīng)環(huán)境中，將不能實(shí)現(xiàn)aie分子在納米抗體免疫熒光染色中應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明為解決將aie分子或者其團(tuán)簇與納米抗體偶聯(lián)而不使用有機(jī)溶劑作為反應(yīng)環(huán)境，以在水環(huán)境實(shí)現(xiàn)，從而避免有機(jī)溶劑在偶聯(lián)中對(duì)納米抗體結(jié)構(gòu)破壞的現(xiàn)象，避免該偶聯(lián)影響納米抗體活性，導(dǎo)致難以染色的問題。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明第一方面提供一種化合物(utps2)，其中，所述化合物如式(ⅰ)所示：

3、

4、本發(fā)明第二方面提供一種化合物的制備方法，其中，包括以下步驟：

5、s110.將乙醇鈉及乙醇的混合溶液加入第一混合溶液中得第二混合溶液；

6、將1,4-丁磺酸內(nèi)酯及乙醇的混合溶液加入所述第二混合溶液中進(jìn)行第一反應(yīng)；

7、再進(jìn)行第一純化得第一中間產(chǎn)物，第一中間產(chǎn)物如式(?、?所示：

8、

9、其中，所述第一混合溶液為惰性氣氛下的[1,1-二(4-溴苯基)-2-二(4-羥基苯基)]乙烯及乙醇的混合溶液；

10、s120.將4-吡啶基硼酸、氫氧化鉀、四(三苯基膦)鈀加入所述第一中間產(chǎn)物及乙腈的混合溶液中進(jìn)行第二反應(yīng)；

11、再進(jìn)行第二純化得第二中間產(chǎn)物，第二中間產(chǎn)物如式(ⅰ?、?所示：

12、

13、s130.惰性氣氛下將所述第二中間產(chǎn)物與5-氯甲基尿嘧啶溶解在n,n-二甲基甲酰胺中進(jìn)行第三反應(yīng)；

14、再進(jìn)行第三純化后得上述第一方面所述的化合物。

15、本發(fā)明第三方面提供一種熒光團(tuán)簇的制備方法，其中，包括將上述第一方面所述化合物、單鏈dna、溶劑進(jìn)行混合制得所述熒光團(tuán)簇。

16、本發(fā)明第四方面提供上述第三方面所述制備方法制得的熒光團(tuán)簇(utps2/ssdna)。

17、本發(fā)明第五方面提供一種免疫熒光團(tuán)簇的制備方法，其中，在所述水環(huán)境下將上述第四方面所述熒光團(tuán)簇與納米抗體偶聯(lián)。

18、本發(fā)明第六方面提供上述第五方面所述制備方法制得的免疫熒光團(tuán)簇(egfr?nb-utps2/ssdna)。

19、本發(fā)明第七方面提供上述第一方面所述化合物、上述第四方面所述熒光團(tuán)簇或上述第六方面所述免疫熒光團(tuán)簇在制備免疫熒光染色試劑上的應(yīng)用。

20、相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：

21、在第一方面上，本發(fā)明制備化合物utps2是一種具備完全水溶性的aie分子，由其制備的熒光團(tuán)簇可在純水條件下與納米抗體偶聯(lián)，與現(xiàn)有技術(shù)的aie分子必須使用有機(jī)溶劑作為偶聯(lián)環(huán)境才能與納米偶聯(lián)相比，避免了有機(jī)試劑對(duì)納米抗體結(jié)構(gòu)破壞的現(xiàn)象，從而避免降低納米抗體活性的問題，能夠真正實(shí)現(xiàn)aie分子用于免疫熒光染色。

22、在第二方面上，本發(fā)明制備化合物熒光發(fā)射峰與吸收峰之間存在較大斯托克斯位移，有利于提高熒光成像的信噪比。

23、在第三方面上，本發(fā)明利用a-u堿基互補(bǔ)配對(duì)的精準(zhǔn)識(shí)別作用制備熒光團(tuán)簇，提供的末端修飾的utps2/ssdna熒光團(tuán)簇不僅具有完全的水溶性，且活性官能團(tuán)明確可控，可以任意偶聯(lián)在目標(biāo)抗體表面而不影響其活性，具有通用性。同時(shí)，其還具有熒光亮度高、抗光漂白能力強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。

24、在第四方面上，本發(fā)明提供的nb-utps2/ssdna免疫熒光團(tuán)簇在免疫熒光染色應(yīng)用方面，具有具有水溶性好、抗光漂白、熒光信號(hào)穩(wěn)定、簡(jiǎn)便易得的優(yōu)勢(shì)，從而實(shí)現(xiàn)靈敏、穩(wěn)定的免疫熒光染色及分析。

技術(shù)特征：

1.一種化合物，其特征在于，所述化合物如式(ⅰ)所示：

2.一種化合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，

4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其特征在于，

5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，

6.一種熒光團(tuán)簇的制備方法，其特征在于，包括將權(quán)利要求1所述化合物、單鏈dna、溶劑進(jìn)行混合制得所述熒光團(tuán)簇；

7.權(quán)利要求6所述制備方法制得的熒光團(tuán)簇。

8.一種免疫熒光團(tuán)簇的制備方法，其特征在于，在所述水環(huán)境下將權(quán)利要求7所述熒光團(tuán)簇與納米抗體偶聯(lián)。

9.權(quán)利要求8所述制備方法制得的免疫熒光團(tuán)簇。

10.權(quán)利要求1所述化合物、權(quán)利要求7所述熒光團(tuán)簇或權(quán)利要求9所述免疫熒光團(tuán)簇在制備免疫熒光染色試劑上的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及熒光探針領(lǐng)域，具體涉及一種化合物、熒光團(tuán)簇、免疫熒光團(tuán)簇及其制備方法和應(yīng)用，該化合物如式(Ⅰ)所示，化合物具備完全水溶性，具有高熒光成像的信噪比，由化合物制備的熒光團(tuán)簇也具有完全水溶性，且活性官能團(tuán)明確可控，熒光亮度高、抗光漂白能力強(qiáng)，熒光團(tuán)簇還能夠在純水條件下與納米抗體偶聯(lián)得到免疫熒光團(tuán)簇而不影響抗體活性，可用于細(xì)胞免疫熒光染色探針。

技術(shù)研發(fā)人員：姜文寧
受保護(hù)的技術(shù)使用者：遼寧警察學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6