本發(fā)明屬于生物，具體涉及轉(zhuǎn)錄組測序，更具體涉及單菌轉(zhuǎn)錄組測序方法。

背景技術(shù)：

1、現(xiàn)有技術(shù)smrandom-seq(專利申請?zhí)枺篶n202210174619.9)，先對分離的微生物樣本進(jìn)行固定，4％多聚甲醛固定細(xì)菌過夜，以交聯(lián)細(xì)菌內(nèi)部的rna、dna和蛋白質(zhì)。使用溶菌酶消化細(xì)胞壁，對固定的細(xì)菌進(jìn)行透化，以便進(jìn)行下一步原位逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。將微生物作為反應(yīng)容器進(jìn)行原位反應(yīng)，加入隨機(jī)引物與細(xì)菌內(nèi)的rna結(jié)合，逆轉(zhuǎn)錄捕獲總rna合成cdna，通過末端轉(zhuǎn)移酶(tdt)將poly(da)尾巴原位添加到cdna的3’端。前述流程每一步完成后都需要使用緩沖液清洗3-5次左右，防止試劑殘留對后續(xù)反應(yīng)的影響。使用微流控裝置將單個(gè)細(xì)菌與標(biāo)記微珠封裝到液滴中。通過酶切將poly(t)引物從微珠上釋放出來，消化細(xì)菌中的rna使cdna從細(xì)菌中釋放出來，poly(t)引物與cdna末端的poly(a)尾結(jié)合，隨后延伸給cdna加上特定編碼，并給每個(gè)cdna上添加分子標(biāo)簽(umi)。破乳后收集純化cdna，擴(kuò)增并添加測序接頭構(gòu)建測序文庫，用cas9消解rrna的cdna產(chǎn)物，富集mrna的cdna產(chǎn)物。對處理后的樣本進(jìn)行高通量測序，以分析單個(gè)微生物的轉(zhuǎn)錄組消息。

2、現(xiàn)有微生物單細(xì)菌測序技術(shù)：smrandom-seq(專利申請?zhí)枺篶n202210174619.9)；microsplit(microbial?split-pool?ligation?transcriptomics,kuchina?a,brettnerlm,paleologu?l,roco?cm,rosenberg?ab,carignano?a,et?al.microbial?single-cellrna?sequencing?by?split-pool?barcoding.science?2021；371(6531):eaba5257.)；petri-seq(prokaryotic?expression?profiling?by?tagging?rna?in?situ?andsequencing,blattman?sb,jiang?w,oikonomou?p,tavazoie?s.prokaryotic?single-cellrna?sequencing?by?in?situ?combinatorial?indexing.nat?microbiol?2020；5(10):1192–201.)。

3、微生物比較小，離心時(shí)需要較高的離心速度(～4000g)，多次離心清洗容易導(dǎo)致微生物的丟失，同時(shí)高速離心會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌粘連，粘連的微生物會(huì)導(dǎo)致雙菌污染?，F(xiàn)有技術(shù)對微生物單菌分析的起始量要求較高。臨床采集的微生物往往量比較少，且培養(yǎng)擴(kuò)增可能影響微生物組成和狀態(tài)，所以往往不能進(jìn)行微生物單菌分析。

4、petri-seq和microsplit是基于組合索引的技術(shù)，在細(xì)菌固定和滲透化后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(rt)。在petri-seq中，使用隨機(jī)引物來逆轉(zhuǎn)錄；而在microsplit中，在逆轉(zhuǎn)錄之前先對轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行聚腺苷酸化處理(加poly(a))。用ploy(t)引物進(jìn)行rt。兩種方法都是在rt后進(jìn)行多輪索引標(biāo)簽連接(先將細(xì)菌分配到不同的反應(yīng)孔中連接上孔特異的標(biāo)簽，再收集細(xì)菌，混勻后再分配到不同的反應(yīng)孔中連接上孔特異的標(biāo)簽，重復(fù)多次)，在cdna上連接上特異順序的條形碼標(biāo)記(條形碼順序即某個(gè)細(xì)菌在多輪分配中的位置順序)，為每個(gè)單獨(dú)的細(xì)菌賦予一個(gè)獨(dú)特的身份。該流程也存在大量離心清洗過程，包括rt和每一輪的標(biāo)簽連接(2-3輪)。對樣本起始量有較大要求(～1千萬微生物)，而本發(fā)明起始量少(～10萬微生物)，能夠滿足更多的微生物單菌分析場景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明首先將微生物樣本進(jìn)行固定，使用可逆多孔材料(具有可逆特性，在不同條件下可以呈現(xiàn)固態(tài)或液體；多孔，材料內(nèi)部多孔隙，允許生物大分子通過)對固定后的細(xì)菌樣本進(jìn)行包裹，包裹使用的材料可以是天然生物高分子(如瓊脂糖、明膠、海藻酸鈉、透明質(zhì)酸中的至少一種)或人工合成材料(如聚乙二醇、聚丙烯酰胺中的至少一種)等。將微生物和包裹材料混合，置于模具中，凝固形成果凍狀半固體。包裹材料中間有孔隙，可以允許大分子酶、鹽離子、水等通過，但可以將微生物單菌鎖定在包裹材料中。包裹完成后將包裹體轉(zhuǎn)移到離心管或特質(zhì)芯片中進(jìn)行清洗和反應(yīng)。由于微生物已經(jīng)被鎖定在包裹體中，清洗不需要使用離心機(jī)。使用溶菌酶對細(xì)胞壁進(jìn)行消化，透化細(xì)菌。加入逆轉(zhuǎn)錄試劑和隨機(jī)引物，對細(xì)菌內(nèi)的總rna進(jìn)行捕獲合成cdna，通過末端轉(zhuǎn)移酶(tdt)將poly(da)尾巴原位添加到cdna的3’端。前述流程每一步完成后都需要使用緩沖液清洗3次左右，防止試劑殘留對后續(xù)反應(yīng)的影響。將包裹材料溶解，釋放出單菌，清洗后使用微流控裝置將單個(gè)細(xì)菌與標(biāo)記微珠封裝到液滴中。通過酶切將poly(t)引物從微珠上釋放出來，消化細(xì)菌中的rna使cdna從細(xì)菌中釋放出來，poly(t)引物與cdna末端的poly(a)尾結(jié)合，隨后延伸給cdna加上特定編碼，并給每個(gè)cdna上添加分子標(biāo)簽(umi)。破乳后收集純化cdna，擴(kuò)增并添加測序接頭構(gòu)建測序文庫，用cas9消解rrna的cdna產(chǎn)物，富集mrna的cdna產(chǎn)物。對處理后的樣本進(jìn)行高通量測序，以分析單個(gè)微生物的轉(zhuǎn)錄組信息。

2、本發(fā)明提供單菌轉(zhuǎn)錄組測序方法，其包括如下步驟：

3、將微生物固定后使用可逆凝固多孔材料將其包裹起來形成包裹體，在包裹體中完成細(xì)菌rna的捕獲和接頭添加，再釋放出單菌，經(jīng)處理后的樣本進(jìn)行高通量測序，以分析單個(gè)微生物的轉(zhuǎn)錄組信息；

4、所述包裹材料中間有孔隙，可允許大分子酶、鹽離子、水通過，但微生物單菌被鎖定在包裹材料中。

5、具體地，包括如下步驟：

6、s1將微生物樣本進(jìn)行固定，使用可逆多孔材料對固定后的細(xì)菌樣本進(jìn)行包裹，包裹使用的材料選自天然生物高分子或人工合成材料；

7、s2包裹完成后將包裹體進(jìn)行清洗，使用溶菌酶對細(xì)胞壁進(jìn)行消化，透化細(xì)菌；

8、s3對微生物中的rna進(jìn)行標(biāo)記，具體是將包裹體樣本浸泡在標(biāo)記試劑中，標(biāo)記試劑包括核苷酸鏈、工具酶和反應(yīng)緩沖液，通過核苷酸鏈與rna片段結(jié)合，核苷酸結(jié)合到rna鏈后發(fā)生聚合反應(yīng)或連接反應(yīng)，使核苷酸鏈攜帶rna信息和捕獲接頭；完成后進(jìn)行清洗；

9、s4將包裹材料溶解，釋放出單菌，清洗后采用微流控液滴或微孔板系統(tǒng)進(jìn)行單菌分割,得到單液滴；

10、s5對單菌分割后的單液滴進(jìn)行延伸反應(yīng)，將單液滴破碎，純化cdna，進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

11、s6構(gòu)建測序文庫，并進(jìn)行測序，以分析單個(gè)微生物的轉(zhuǎn)錄組信息。

12、優(yōu)選地，所述可逆多孔材料具有可逆特性，在不同條件下可以呈現(xiàn)固態(tài)或液體；且所述可逆多孔材料內(nèi)部多孔隙，允許生物大分子通過。具體地，所述天然生物高分子選自瓊脂糖、明膠、海藻酸鈉、透明質(zhì)酸中的至少一種；所述人工合成材料選自聚乙二醇或聚丙烯酰胺中的至少一種。

13、進(jìn)一步優(yōu)選地，s3步驟中，通過逆轉(zhuǎn)錄酶實(shí)現(xiàn)對微生物樣本的rna進(jìn)行標(biāo)記，具體是通過添加逆轉(zhuǎn)錄酶、核苷酸鏈、反應(yīng)緩沖液進(jìn)行rna標(biāo)記，通過添加末端轉(zhuǎn)移酶和一種脫氧核糖核苷三磷酸進(jìn)行捕獲接頭添加。

14、在具體實(shí)施方式中，s4步驟中，采用微流控液滴系統(tǒng)進(jìn)行單菌分割步驟如下：將微生物樣本、延伸反應(yīng)試劑、編碼微球、油相分別與微流控芯片的對應(yīng)入液口連接，形成包含單菌、單個(gè)編碼微球、延伸反應(yīng)試劑的油包水單液滴，收集單液滴，形成單個(gè)腔室包含單個(gè)細(xì)菌的分隔；

15、在具體實(shí)施方式中，s5步驟中，將收集的單液滴進(jìn)行延伸反應(yīng)，以在單液滴中合成帶條形碼標(biāo)記的cdna第二條鏈；延伸反應(yīng)結(jié)束后將單液滴破碎，純化提取管中的cdna，進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

16、s6步驟中，將s5步中擴(kuò)增后的cdna采用ta克隆連接接頭建庫法進(jìn)行末端修復(fù)和加a尾，用建庫試劑盒連接上接頭構(gòu)建測序文庫，用cas9消解rrna的cdna產(chǎn)物，富集mrna的cdna產(chǎn)物；構(gòu)建好的文庫用illumina測序平臺(tái)進(jìn)行高通量測序，以分析單個(gè)微生物的轉(zhuǎn)錄組信息。

17、優(yōu)選地，所述清洗不需要離心，優(yōu)選地，所述清洗是用緩沖液進(jìn)行清洗，防止試劑殘留對后續(xù)反應(yīng)的影響；具體操作是用pbst清洗2-4次。

18、任選地，還包括數(shù)據(jù)分析步驟，具體是對檢測的微生物數(shù)據(jù)進(jìn)行分群聚類。

19、具體地，所述微生物樣本是環(huán)境微生物樣本或生物體排泄物、體液中的微生物樣本。

20、本發(fā)明方法的優(yōu)勢如下：本發(fā)明通過將微生物用可逆多孔材料包裹起來，形成一個(gè)包裹體，將離心清洗轉(zhuǎn)變?yōu)榉请x心清洗，微生物在包裹體中完成清洗和rna捕獲標(biāo)記反應(yīng)，提高了微生物的回收效率，降低了微生物的粘連比例，降低了微生物的起始投入量，實(shí)現(xiàn)對少量(～10萬)微生物樣本進(jìn)行的單細(xì)菌分析。并且非離心清洗對于自動(dòng)化實(shí)現(xiàn)難度更低。本發(fā)明在對微生物進(jìn)行操作前先使用可逆凝固多孔材料將微生物包裹起來，允許在包裹體中完成細(xì)菌rna的捕獲和接頭添加。從而將反應(yīng)間的離心清洗轉(zhuǎn)變成非離心清洗，防止高速離心導(dǎo)致的微生物結(jié)團(tuán)，減少離心導(dǎo)致的微生物丟失，減少離心導(dǎo)致的細(xì)菌比例變化。本發(fā)明可以對起始量較少的微生物樣本進(jìn)行單細(xì)菌分析。