本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種長(zhǎng)白落葉松snp分子標(biāo)記及其制備的全基因組液相芯片及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、長(zhǎng)白落葉松(larix?olgensis?henry)為松科(pinaceae)落葉松屬(larix)。其樹(shù)干通直、抗逆性強(qiáng)，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值，是重要的鄉(xiāng)土用材和造林樹(shù)種。目前，對(duì)長(zhǎng)白落葉松的研究主要集中在遺傳進(jìn)化和優(yōu)良家系選擇等方面，利用選擇優(yōu)良無(wú)性系和家系及雜交獲得優(yōu)良種質(zhì)，并取得了不同程度的發(fā)展。但由于落葉松生周期漫長(zhǎng)，在進(jìn)行種質(zhì)改良中成為一個(gè)主要的限制因素，同時(shí)落葉松樹(shù)種還存在產(chǎn)量不均及種子質(zhì)量較低的問(wèn)題。而利用分子標(biāo)記育種進(jìn)行遺傳圖譜的構(gòu)建、建立與表型性狀關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，可以縮短育種周期和降低育種成本，并提高育種的精準(zhǔn)度。針對(duì)種質(zhì)資源的特定性狀開(kāi)展遺傳多樣性的評(píng)價(jià)，可以更好的挖掘和利用優(yōu)良種質(zhì)，提高育種效率。

2、近年來(lái)，落葉松研究中應(yīng)用較多的分子標(biāo)記有rapd、rflp、snp等，這些標(biāo)記具有遺傳穩(wěn)定、特異性高等特點(diǎn)。其中snp是全基因組中數(shù)量最多的變異類型，相比于其他標(biāo)記具有密度高、遺傳穩(wěn)定性高和易分析的特點(diǎn)，全基因組育種芯片是一種基于高通量分子標(biāo)記技術(shù)的育種工具，可以覆蓋整個(gè)基因組的snp位點(diǎn)，具有覆蓋范圍廣、靈敏度高、通量高和精準(zhǔn)度高等特點(diǎn)。snp液相芯片具有檢測(cè)方便、成本低、通量高、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)。利用全基因組育種芯片對(duì)長(zhǎng)白落葉松種質(zhì)資源基因型分析、遺傳多樣性以及功能基因發(fā)掘等進(jìn)行全方面評(píng)價(jià)，有助于加速落葉松種質(zhì)資源優(yōu)異種質(zhì)發(fā)掘、新型功能基因鑒定，推動(dòng)落葉松從常規(guī)育種到分子設(shè)計(jì)育種和智能育種的轉(zhuǎn)變。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明旨在至少解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題之一。為此，本發(fā)明提出一種長(zhǎng)白落葉松snp分子標(biāo)記。

2、本發(fā)明還提出一種用于檢測(cè)上述長(zhǎng)白落葉松snp分子標(biāo)記的全基因組液相芯片。

3、本發(fā)明還提出一種用于檢測(cè)上述長(zhǎng)白落葉松snp分子標(biāo)記的試劑盒。

4、本發(fā)明還提出一種長(zhǎng)白落葉松snp分子標(biāo)記的篩選方法。

5、本發(fā)明還提出一種上述長(zhǎng)白落葉松snp分子標(biāo)記、全基因組液相芯片或試劑盒的應(yīng)用。

6、本發(fā)明還提出一種長(zhǎng)白落葉松的育種方法。

7、根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提出了一種長(zhǎng)白落葉松snp分子標(biāo)記，包括61,680個(gè)snp分子標(biāo)記中的至少一種，所述61,680個(gè)snp分子標(biāo)記的物理位置是基于日本落葉松參考基因組gca_027924585.1進(jìn)行序列比對(duì)確定的，位點(diǎn)信息具體如下表1所示。

8、表1

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79、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述snp分子標(biāo)記的位置信息采用染色體編號(hào)：物理位置的形式進(jìn)行表示，具體的染色體編號(hào)為bsbm0100+表格中“:”前的染色體編號(hào)。

80、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述snp分子標(biāo)記0826.1:5022779g/-，“-”表示為插入gaaaccgagtcgaatgagccggagaaaagcaaaaccgagtcgaatgagccgaagaaaagca。

81、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述alt為“.”表示其具有多種突變可能。

82、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中當(dāng)ref為a時(shí)，alt為“.”，表示突變可以為t、g、c或n；

83、當(dāng)ref為t時(shí)，alt為“.”表示突變可以為a、g、c或n；

84、當(dāng)ref為g時(shí)，alt為“.”表示突變可以為t、a、c或n；

85、當(dāng)ref為c時(shí)，alt為“.”表示突變可以為t、a、g或n，其中，n為缺失。

86、在本發(fā)明的第二方面，提出了一種全基因組液相芯片，所述全基因組液相芯片包括用于檢測(cè)上述的長(zhǎng)白落葉松snp分子標(biāo)記的引物組和/或探針。

87、在本發(fā)明的第三方面，提出了一種試劑盒，所述試劑盒包含用于檢測(cè)上述的長(zhǎng)白落葉松snp分子標(biāo)記的引物組和/或探針。

88、在本發(fā)明的第四方面，提出了上述長(zhǎng)白落葉松snp分子標(biāo)記的篩選方法，所述篩選方法包括以下步驟：以長(zhǎng)白落葉松全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，挖掘并篩選靶位點(diǎn)snp，再針對(duì)靶位點(diǎn)snp設(shè)計(jì)探針，篩選探針?lè)弦蟮膕np，最終作為長(zhǎng)白落葉松snp分子標(biāo)記。

89、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述挖掘并篩選靶位點(diǎn)snp包括以下步驟：收集長(zhǎng)白落葉松樣本，測(cè)序得到全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)；將所述全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)至日本落葉松參考基因組gca_027924585.1，采用gatk軟件來(lái)進(jìn)行snp的檢測(cè)和過(guò)濾；將過(guò)濾得到的標(biāo)記，進(jìn)行篩選得到靶位點(diǎn)snp；所述篩選參數(shù)為：maf≥0.05、檢出率≥90％、雜合≤0.3、depth≥5。

90、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，過(guò)濾的標(biāo)準(zhǔn)如下：qd<2.0||fs>60.0||mq<35.0||mqranksum<-12.5||read?posranksum<-8.0||dp>6950。

91、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述探針的長(zhǎng)度為80-120bp。

92、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述探針的長(zhǎng)度約為100bp。

93、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述探針的gc含量在20％-80％之間。

94、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，篩選探針?lè)弦蟮膕np包括以下步驟：對(duì)探針進(jìn)行測(cè)序，去除在基因組上無(wú)法唯一比對(duì)、側(cè)翼序列中包含重復(fù)序列的探針。

95、在本發(fā)明的第五方面，提出了上述長(zhǎng)白落葉松snp分子標(biāo)記、全基因組液相芯片和試劑盒中的至少一種的應(yīng)用，所述應(yīng)用為在長(zhǎng)白落葉松的基因分型檢測(cè)中的應(yīng)用。

96、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述應(yīng)用為在長(zhǎng)白落葉松的種質(zhì)資源鑒定的應(yīng)用。

97、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述應(yīng)用為在長(zhǎng)白落葉松的全基因組關(guān)聯(lián)分析中的應(yīng)用。

98、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述應(yīng)用為在長(zhǎng)白落葉松的聚類分析及親緣關(guān)系鑒定中的應(yīng)用。

99、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述應(yīng)用為在長(zhǎng)白落葉松的遺傳圖譜和基因定位中的應(yīng)用。

100、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述應(yīng)用為在長(zhǎng)白落葉松的遺傳多樣性鑒定中的應(yīng)用。

101、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述應(yīng)用為在長(zhǎng)白落葉松的分子設(shè)計(jì)育種中的應(yīng)用。

102、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述應(yīng)用具體可以通過(guò)以下方法實(shí)現(xiàn)：

103、s1、采用長(zhǎng)白落葉松snp分子標(biāo)記、全基因組液相芯片和試劑盒中的至少一種對(duì)待測(cè)試的樣本進(jìn)行基因型分型，獲得基因型分型結(jié)果；

104、s2、對(duì)步驟s1獲得的基因型分型結(jié)果進(jìn)行分析。

105、在本發(fā)明的第六方面，提出了一種長(zhǎng)白落葉松的育種方法，包括如下步驟：利用上述長(zhǎng)白落葉松snp分子標(biāo)記、全基因組液相芯片和試劑盒中的至少一種對(duì)待測(cè)長(zhǎng)白落葉松的dna進(jìn)行檢測(cè)，選擇長(zhǎng)白落葉松進(jìn)行后續(xù)育種。

106、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述檢測(cè)基于液相探針捕獲測(cè)序分型技術(shù)進(jìn)行。

107、本發(fā)明至少具有以下有益效果：

108、本發(fā)明的長(zhǎng)白落葉松snp分子標(biāo)記可用于特異性鑒定長(zhǎng)白落葉松樹(shù)。將長(zhǎng)白落葉松snp分子標(biāo)記用于制備長(zhǎng)白落葉松樹(shù)種全基因組液相芯片，可以實(shí)現(xiàn)低成本基因分型，主要是對(duì)長(zhǎng)白落葉松具有專屬性，還可以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)白落葉松遺傳多樣性評(píng)估、種質(zhì)資源和親緣關(guān)系鑒定、分子設(shè)計(jì)育種、遺傳圖譜構(gòu)建及功能基因定位、全基因組關(guān)聯(lián)分析和智慧育種，在長(zhǎng)白落葉松育種的多個(gè)領(lǐng)域具有較高的應(yīng)用價(jià)值；且該全基因組液相芯片還包括生長(zhǎng)和抗逆性狀位點(diǎn)256個(gè)，可用于重要性狀基因的挖掘利用和分子標(biāo)記輔助選育。

109、同時(shí)，本發(fā)明制備得到的長(zhǎng)白落葉松樹(shù)種全基因組液相芯片可用于長(zhǎng)白落葉松低成本且大規(guī)模的基因分型檢測(cè)，因落葉松參考基因組較大(高達(dá)13gb)，利用重測(cè)序獲得基因型分型結(jié)果的費(fèi)用較高，60k液相芯片與重測(cè)序(10×)分型相比費(fèi)用降低90％以上；且基于液相芯片原理，位點(diǎn)靈活，后期可隨時(shí)增加新的功能標(biāo)記位點(diǎn)。這款芯片還包含256個(gè)性狀關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，更適合長(zhǎng)白落葉松品種生長(zhǎng)和抗逆基因的挖掘與研究，有利于長(zhǎng)白落葉松種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)利用與新品種創(chuàng)制。

110、本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的說(shuō)明書(shū)中闡述，并且，部分地從說(shuō)明書(shū)中變得顯而易見(jiàn)，或者通過(guò)實(shí)施本發(fā)明而了解。