本文討論的實施方案一般涉及酵母的基因工程菌株和產生重組蛋白、細胞產品或培養(yǎng)肉的改進方法。本文討論的實施方案一般還涉及使用生長因子進行細胞生長和蛋白質表達的改進方法。

背景技術：

1、動物肉類的蛋白質高，提供了構建用于支持身體功能的蛋白質所需的所有氨基酸。食用肉類傳統(tǒng)上是從農場飼養(yǎng)的動物或魚類中獲取的。然而，用于生產動物肉類的農業(yè)和水產養(yǎng)殖業(yè)需要大量的能量和資源，并且碳足跡高。因為該生產方法可使肉類接觸到疾病、污染物和毒素，所以通過農業(yè)或水產養(yǎng)殖業(yè)生產的肉類可會造成公共健康風險。而諸如人口增長、肉類需求增加、環(huán)境問題、土地資源和水資源有限、生物多樣性喪失以及與動物屠宰相關的負面看法等許多問題促使科學家開發(fā)通過替代方法來生產肉類的技術。

2、體外肉類生產是利用細胞培養(yǎng)技術在實驗室中培養(yǎng)動物的肌肉組織或器官組織以制造肉和肉制品的過程。除了肉類等食品外，體外細胞培養(yǎng)還可用于生產各種產品的活性成分或產品本身(包括但不限于膳食補充劑、護發(fā)、護膚、傷口護理、化妝品、補充劑、藥物和其他藥用應用)。如本文所使用的體外肉類和肉類制品包括動物蛋白制品以及包括可溶形式和固體形式的非肉類制品。雖然仍處于早期開發(fā)階段，但體外肉類和肉類制品可提供優(yōu)于傳統(tǒng)肉類制品的許多優(yōu)勢，如健康和環(huán)境優(yōu)勢、以及對動物福利的好處。這是下一代新興技術，屬于更廣闊的細胞農業(yè)或從細胞培養(yǎng)物制造農產品的領域的一部分。

3、用于生產體外肉類的細胞可以是從動物活檢中獲取的細胞(例如肌細胞、體細胞、干細胞等)，所述細胞然后可以在生物反應器或其它類型的無菌受控環(huán)境中的培養(yǎng)基內與動物分離開生長。所述細胞可以通過附著于放在生物反應器中的可食三維支架上而生長成模擬動物器官的半固體或固體。起始細胞可以是從動物組織直接獲得的原代細胞、或連續(xù)細胞系。如果在適當的培養(yǎng)基中在正確的條件下生長，原代細胞會生長和增殖，但只能生長和增殖與細胞dna末端的端粒長度相關的有限次數。另一方面，連續(xù)細胞系可以在體外長期培養(yǎng)。細胞生物學研究已經建立了將原代細胞轉變?yōu)橛郎倪B續(xù)細胞系的程序。利用病毒癌基因、化學處理或端粒酶逆轉錄酶過表達來防止端?？s短，從而可以將原代細胞轉化為連續(xù)細胞系。

4、培養(yǎng)基可含有細胞增殖所必需的成分，例如氨基酸、鹽、維生素、生長因子和控制ph值的緩沖體系。目前的方法通常是在使用前向培養(yǎng)基中添加外源動物產品，例如胎牛血清(fbs)或重組哺乳動物生長因子或細胞因子，以提供維持細胞增殖和增加細胞產量的重要大分子、生長因子和免疫分子。但是，這種方法有幾個缺點。第一，在無動物組分的培養(yǎng)基中生長細胞是從事體外肉類生產研究的科學家考慮的一個重要因素。fbs來源于未出生的小牛，因此與不含動物產品的目標不相符。

5、第二，通常超過95％的培養(yǎng)基成本都歸因于蛋白質成分。重組人類生長因子(例如胰島素生長因子1(igf-1))、人血清白蛋白(hsa)、牛血清(fbs)通常都是研究級或藥物級，并且通常會以過量形式添加到基礎培養(yǎng)基中，這會增加培養(yǎng)基成本，而且在大多數工業(yè)應用中是不必要的。

6、第三，雖然這些補充成分能有效促進人類細胞的生長和分化，但它們對跨物種細胞(即來自遠種的細胞，如魚類、鳥類)的生物活性較低。這導致培養(yǎng)周期長和細胞質量低。為了彌補非人類細胞的低生物活性，在生長培養(yǎng)基中添加了過高水平的人類蛋白質因子或fbs，這導致成本高昂。由于非哺乳動物生長因子的商業(yè)來源有限，非哺乳動物細胞(例如魚類)的體外細胞培養(yǎng)情況比哺乳動物細胞更差。使用哺乳動物生長因子來促進非哺乳動物細胞的生長是無效的，因為哺乳動物生長因子可能不會與非哺乳動物細胞上的細胞受體結合或對其作用較差；以這種方式制造的產品也可能引起消費者對安全性和潛在過敏反應的擔憂。

7、第四，大多數行業(yè)實踐都使用天然生長因子來培養(yǎng)細胞，這可能是低效的，因為天然生長因子可能不穩(wěn)定或在其天然形式下固有生物活性較低。因此，需要大劑量或頻繁喂養(yǎng)生長因子來彌補這些問題。

8、上述不足不僅導致體外肉類生產成本高，而且增加了最終產品的消費者的健康風險。為了解決此類不足，并提供更經濟高效但更簡單的方式提高體外細胞培養(yǎng)中細胞生長和蛋白質表達的改進方法，本發(fā)明提供了新型酵母菌株，其可以產生重組天然或改造的生長因子以增強細胞生長。在一些實施方案中，將重組生長因子引入待培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基中，從而提高培養(yǎng)細胞的生長率或蛋白質表達率。

9、在一些實施方案中，要補充到培養(yǎng)細胞中的重組生長因子與培養(yǎng)細胞類型具有相似的物種來源和/或其氨基酸序列經過改造，與天然序列相比具有更好的生物活性和穩(wěn)定性。

10、通過提供與培養(yǎng)細胞類型具有相似物種來源的生長因子和/或具有改進的生物活性和穩(wěn)定性特征的改造生長因子，本發(fā)明顯著減少了需要補充的生長因子的量以及對消費者造成的風險。本發(fā)明不需要復雜的設置，并且使用本發(fā)明生產的產品可以大規(guī)模生產，并且易于在大多數應用中使用，而無需額外的繁瑣純化程序。此外，本發(fā)明的酵母菌株可用于生產各種哺乳動物和非哺乳動物生長因子，因此其應用范圍廣泛。總體而言，本發(fā)明提供了新型酵母菌株和改進的重組蛋白生產方法，這些重組蛋白促進體外培養(yǎng)中的細胞生長，并且能夠以較低的成本和簡化的方式生產體外肉制品和其他類型的細胞產品。所得產品適用于各種應用，包括細胞農業(yè)、化妝品、藥物和生物技術。

技術實現思路

1、本公開的實施方案提供了酵母的基因工程菌株和在體外細胞培養(yǎng)中增加細胞生長和蛋白質表達的改進方法。

2、本發(fā)明的目的是提供新的基因工程酵母菌株和一種替代方法來生產重組蛋白，例如用于體外細胞培養(yǎng)的重組生長因子。在一些實施方案中，將重組生長因子引入待培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基中，以增加培養(yǎng)細胞的生長速率或蛋白質表達速率。

3、本發(fā)明的目的是提供一種使用物種-特異性或屬-特異性生長因子培養(yǎng)細胞的替代方法。這種方法不僅通過降低生長因子的使用量來降低培養(yǎng)基成本，而且還通過增強細胞反應來縮短培養(yǎng)時間并改善細胞質量。使用物種-特異性或屬-特異性生長因子可有助于增強細胞反應(例如，生長和分化)并打破使用非物種-特異性或非屬-特異性生長因子時遇到的最大細胞反應。本發(fā)明的另一個目的是提供一種使用生長因子培養(yǎng)細胞的替代方法，與使用天然生長因子相比，這些生長因子具有改造的、用于改善穩(wěn)定性和/或生物活性的氨基酸。

4、本發(fā)明的目的是提供一種生產重組生長因子的方法，所述重組生長因子可用于非哺乳動物和哺乳動物細胞培養(yǎng)兩者；例如，所得重組生長因子來自魚類，可用于培養(yǎng)魚類細胞或相關物種的細胞。本發(fā)明的另一個目的是提供一種生產重組天然生長因子或改造生長因子的方法，這些生長因子的氨基酸序列經過改造，以改善穩(wěn)定性、生物活性或促進培養(yǎng)細胞的細胞生長和/或蛋白質表達的其他特性。由于不同物種和氨基酸序列的生長因子在刺激細胞生長方面的功效可有很大差異，細胞培養(yǎng)用戶可以使用本發(fā)明來生成不同的生長因子構建體并評估其功效，并選擇相關細胞類型對特定應用反應最大的構建體。此外，使用本發(fā)明生產的細胞產品具有通常適用于大多數應用類型的純度，并且可以輕松使用而無需復雜的純化程序。在一些具體應用如制藥或醫(yī)療應用需要更高純度的實施方案中，所得體外細胞產物可使用常規(guī)純化技術進一步純化?？傊?，本發(fā)明的應用不僅為其應用提供了靈活性，而且顯著降低了大規(guī)模培養(yǎng)的生產成本。

5、根據本公開的一個實施方案，提供了一種編碼重組生長因子的基因改造酵母細胞。重組生長因子可以是天然氨基酸序列，也可以是改造的氨基酸序列，與天然形式相比，改造的氨基酸序列具有改善的穩(wěn)定性和/或生物活性。

6、根據本公開的一個實施方案，提供了一種在體外細胞培養(yǎng)中增加多個細胞的生長或蛋白質表達速率的方法。所述方法包含以下步驟：在適合于啟動細胞分裂的生長條件下在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)多個細胞，并將至少一種重組生長因子引入營養(yǎng)培養(yǎng)基。在一些實施方案中，重組生長因子(a)被優(yōu)化以增加多個細胞的生長或蛋白質表達速率，或(b)(i)與多個細胞在基因上相同或相似的物種和/或(ii)與多個細胞在基因上相同的屬。

7、根據本公開的一個實施方案，通過體外細胞培養(yǎng)生產肉類的方法包括從動物或植物源分離組織并制備細胞懸浮液。所述方法還包括引入生長因子，所述生長因子(a)被優(yōu)化以增加多個細胞的生長或蛋白質表達速率或(b)(i)與細胞基因上相同或相似的物種和/或(ii)與細胞基因上相同的屬。此外，所述方法還包括在培養(yǎng)基中的食品級支架上培養(yǎng)細胞，細胞生長成模擬動物器官的固體或半固體結構。

8、在進一步的實施方案中，支持細胞生長的生長因子可以由含有并表達生長因子轉基因的其它微生物如細菌或真菌產生。

9、鑒于從微生物中純化表達的生長因子涉及復雜且昂貴的過程，本發(fā)明的實施方案開發(fā)了一種使用直接來自酵母培養(yǎng)物的生長因子培養(yǎng)細胞而無需復雜的純化程序的方法。在一些實施方案中，用于引入體外培養(yǎng)的重組生長因子由包含重組生長因子基因的基因改造酵母細胞產生，并從培養(yǎng)基因改造酵母細胞的細胞培養(yǎng)基中獲得。在一個實施方案中，重組生長因子在引入體外培養(yǎng)之前從酵母細胞培養(yǎng)基中純化。在另一個實施方案中，通過將含有生長因子的酵母細胞培養(yǎng)基引入體外培養(yǎng)物中，將重組生長因子引入體外培養(yǎng)物中。

10、本發(fā)明的方面可以對包含特定物種的igf-1基因(例如魚類ifgf-1基因)的酵母克隆進行基因工程改造。在一個方面，重組酵母可以在酵母培養(yǎng)基中生長，以允許igf-1基因的蛋白質表達。在一個方面，igf-1可以分泌到酵母培養(yǎng)基中。在另一個實施方案中，可以將含igf-1的酵母培養(yǎng)基以約1500g離心5分鐘，以將酵母與培養(yǎng)基分離?？梢允占锨逡?，并在約4℃下以約7200g再次離心約15分鐘。然后可以用2μm或更小孔徑的過濾器過濾澄清的上清液。可以將過濾后的含igf-1的酵母培養(yǎng)基稀釋高至10,000倍，然后加入細胞培養(yǎng)基中以培養(yǎng)魚類細胞或其他類型的細胞。