本發(fā)明涉及一種用于制造腺相關(guān)病毒的生產(chǎn)細胞。本發(fā)明還涉及一種上述生產(chǎn)細胞的制造方法及使用了上述生產(chǎn)細胞的腺相關(guān)病毒的制造方法。

背景技術(shù)：

1、腺相關(guān)病毒(adeno-associated?virus(也稱為aav))是屬于細小病毒科的直鏈單鏈dna病毒。野生型aav基因組包含復(fù)制的調(diào)節(jié)基因(rep基因)和衣殼的結(jié)構(gòu)基因(cap基因)，且為了病毒的復(fù)制和包裝相鄰有反向末端重復(fù)序列(itr)。aav載體能夠在增殖或非增殖的任一細胞中進行基因?qū)?，尤其能夠在非分裂細胞中進行長期的表達。并且，aav被認為是非病原性，且免疫原性低。根據(jù)上述情況，aav載體作為基因治療用載體在臨床應(yīng)用上取得進展。

2、aav為在腺病毒和皰疹病毒等輔助病毒的存在下增殖的非包膜病毒。在制備用于基因治療或核酸導(dǎo)入的aav時，典型的做法為使腺病毒與宿主細胞共感染而進行了aav復(fù)制。并且，明確了負責(zé)腺病毒的輔助作用的基因，還使用攜帶有該基因的質(zhì)粒。例如，通過使包含rep基因及cap基因的質(zhì)粒、腺病毒輔助質(zhì)粒及包含目的基因(轉(zhuǎn)基因)的質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染為hek293細胞而能夠包裝成重組型aav(raav)。

3、在專利文獻1中，記載使用哺乳動物細胞來產(chǎn)生aav，所述哺乳動物細胞包含編碼在第1可抑制解除的啟動子的控制下的病毒輔助基因的核酸分子、編碼在第2可抑制解除的啟動子的控制下的aav基因的核酸分子及編碼第1及第2可抑制解除的啟動子的阻遏要件的核酸分子。

4、在專利文獻2中記載了一種宿主細胞，其包含對腺相關(guān)病毒rep蛋白質(zhì)rep78及rep蛋白質(zhì)rep68進行編碼的核酸，其中，內(nèi)部aav啟動子p19通過使維持rep78蛋白質(zhì)及rep68蛋白質(zhì)的功能性的一個以上的突變而被失活。

5、現(xiàn)有技術(shù)文獻

6、專利文獻

7、專利文獻1：國際公開wo2020/132059號公報

8、專利文獻2：國際公開wo2019/57691號公報

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、發(fā)明要解決的技術(shù)課題

2、在專利文獻1的方法中，存在如下問題：分別對aav產(chǎn)生中所需的輔助基因及aav基因附加控制序列，因此，通過3～5個控制序列之間的相互干涉而有可能存在針對每個對象基因充分地控制表達量變得困難。

3、并且，作為用于產(chǎn)生aav的方法的一例，有使用生產(chǎn)細胞的方法。在建立產(chǎn)生aav的生產(chǎn)細胞時，存在產(chǎn)生細胞損傷的問題。在專利文獻2中，作為用于避免由rep蛋白質(zhì)引起的細胞毒性的方法，記載有使內(nèi)部aav啟動子p19失活的方法，但沒有記載關(guān)于生產(chǎn)細胞的制造。

4、本發(fā)明的課題在于，提供一種用于避免或抑制了建立細胞株時的細胞損傷的aav產(chǎn)生的生產(chǎn)細胞。本發(fā)明的課題還在于，提供一種上述生產(chǎn)細胞的制造方法及使用了上述生產(chǎn)細胞的腺相關(guān)病毒的制造方法。

5、用于解決技術(shù)課題的手段

6、本發(fā)明人等為了解決上述課題而進行了深入研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了通過不使用va-rna基因及e4基因中的至少一個而使用在外源啟動子的控制下的cap基因及在外源啟動子的控制下的rep基因來建立生產(chǎn)細胞，能夠避免或減少建立生產(chǎn)細胞時的細胞損傷。本發(fā)明是基于上述見解而完成的。

7、根據(jù)本發(fā)明，提供以下發(fā)明。

8、<1>一種生產(chǎn)細胞，其不包含va-rna基因及e4基因中的至少一個且為哺乳動物細胞，

9、所述生產(chǎn)細胞在染色體中具有在外源啟動子的控制下的cap基因和在外源啟動子的控制下的rep基因。

10、<2>根據(jù)<1>所述的生產(chǎn)細胞，其中，rep基因的外源啟動子和cap基因的外源啟動子為相同的啟動子。

11、<3>根據(jù)<1>所述的生產(chǎn)細胞，其中，rep基因存在于cap基因的轉(zhuǎn)錄方向的下游。

12、<4>根據(jù)<1>所述的生產(chǎn)細胞，其在染色體中具有在外源啟動子的控制下的e4基因，且不包含va-rna基因。

13、<5>根據(jù)<4>所述的生產(chǎn)細胞，其中，e4基因位于ires的下游。

14、<6>根據(jù)<4>所述的生產(chǎn)細胞，其中，e4基因的外源啟動子為能夠進行開啟及關(guān)閉的切換的誘導(dǎo)型啟動子。

15、<7>根據(jù)<6>所述的生產(chǎn)細胞，其中，e4基因的外源啟動子為能夠通過藥劑誘導(dǎo)表達的啟動子。

16、<8>根據(jù)<7>所述的生產(chǎn)細胞，其中，e4基因的外源啟動子位于四環(huán)素響應(yīng)因子的下游。

17、<9>根據(jù)<1>所述的生產(chǎn)細胞，其不包含va-rna基因及e4基因這兩者。

18、<10>根據(jù)<1>至<9>中任一項所述的生產(chǎn)細胞，其還包含e2a基因。

19、<11>根據(jù)<10>所述的生產(chǎn)細胞，其中，e2a基因位于ires的下游。

20、<12>根據(jù)<10>所述的生產(chǎn)細胞，其中，e2a基因在外源啟動子的控制下。

21、<13>根據(jù)<12>所述的生產(chǎn)細胞，其中，e2a基因在來源于巨細胞病毒的啟動子的控制下。

22、<14>根據(jù)<10>所述的生產(chǎn)細胞，其中，e2a基因的外源啟動子為能夠進行開啟及關(guān)閉的切換的誘導(dǎo)型啟動子。

23、<15>根據(jù)<14>所述的生產(chǎn)細胞，其中，e2a基因的外源啟動子為能夠通過藥劑誘導(dǎo)表達的啟動子。

24、<16>根據(jù)<15>所述的生產(chǎn)細胞，其中，e2a基因的外源啟動子位于四環(huán)素響應(yīng)因子的下游。

25、<17>一種生產(chǎn)細胞，其為不包含va-rna基因的哺乳動物細胞，

26、所述生產(chǎn)細胞在染色體中具有在外源啟動子的控制下的cap基因、在外源啟動子的控制下的rep基因及在外源啟動子的控制下的e4基因。

27、<18>根據(jù)<1>至<17>中任一項所述的生產(chǎn)細胞，其還包含目的基因。

28、<19>根據(jù)<1>至<18>中任一項所述的生產(chǎn)細胞，其中，cap基因的外源啟動子及rep基因的外源啟動子中的1個以上為能夠進行開啟及關(guān)閉的切換的誘導(dǎo)型啟動子。

29、<20>根據(jù)<19>所述的生產(chǎn)細胞，其中，cap基因的外源啟動子及rep基因的外源啟動子中的1個以上為能夠通過藥劑誘導(dǎo)表達的啟動子。

30、<21>根據(jù)<20>所述的生產(chǎn)細胞，其包括：cap基因的外源啟動子及rep基因的外源啟動子中的1個以上位于四環(huán)素響應(yīng)因子的下游。

31、<22>根據(jù)<1>至<21>中任一項所述的生產(chǎn)細胞，其還包含在外源啟動子的控制下的smallrep基因。

32、<23>根據(jù)<22>所述的生產(chǎn)細胞，其中，rep基因存在于smallrep基因的轉(zhuǎn)錄方向的下游。

33、<24>根據(jù)<22>所述的生產(chǎn)細胞，其中，smallrep基因的外源啟動子為能夠進行開啟及關(guān)閉的切換的誘導(dǎo)型啟動子。

34、<25>根據(jù)<24>所述的生產(chǎn)細胞，其中，smallrep基因的外源啟動子為能夠通過藥劑誘導(dǎo)表達的啟動子。

35、<26>根據(jù)<25>所述的生產(chǎn)細胞，其中，smallrep基因的外源啟動子位于四環(huán)素響應(yīng)因子的下游。

36、<27>根據(jù)<1>至<26>中任一項所述的生產(chǎn)細胞，其還包含表達反向四環(huán)素調(diào)節(jié)性轉(zhuǎn)錄激活因子的基因。

37、<28>根據(jù)<27>所述的生產(chǎn)細胞，其包括：表達反向四環(huán)素調(diào)節(jié)性轉(zhuǎn)錄激活因子的基因位于rep基因的下游。

38、<29>根據(jù)<1>所述的生產(chǎn)細胞，其包含在外源啟動子的控制下的e4基因、在外源啟動子的控制下的e2a基因及在外源啟動子的控制下的smallrep基因，

39、cap基因的外源啟動子和e2基因的外源啟動子為相同的啟動子，rep基天的外源啟動子和smallrep基因的外源啟動子為相同的啟動子。

40、<30>一種生產(chǎn)細胞，其為不包含va-rna基因的哺乳動物細胞，

41、所述生產(chǎn)細胞在染色體中具有在外源啟動子的控制下的cap基因、在外源啟動子的控制下的rep基因、在外源啟動子的控制下的e4基因及在外源啟動子的控制下的e2a基因，并且cap基因、rep基因及e2基因存在于附近，e4基因不存在于附近。

42、<31>一種生產(chǎn)細胞，其為不包含va-rna基因的哺乳動物細胞，

43、所述生產(chǎn)細胞在染色體中具有：

44、第一載體，攜帶有在外源啟動子的控制下的cap基因、在外源啟動子的控制下的rep基因及在外源啟動子的控制下的e2a基因；及

45、第二載體，攜帶有在外源啟動子的控制下的e4基因。

46、<32>根據(jù)<31>或<32>所述的生產(chǎn)細胞，其中，染色體上的e4基因插入數(shù)量比其他基因插入數(shù)量少。

47、<33>根據(jù)<31>或<32>所述的生產(chǎn)細胞，其中，染色體上的e4基因插入數(shù)量比cap基因或e2基因在染色體上的插入數(shù)量少。

48、<34>根據(jù)<31>或<32>所述的生產(chǎn)細胞，其中，染色體上的e4基因插入數(shù)量為cap基因在染色體上的插入數(shù)量的0.4倍以下。

49、<35>根據(jù)<31>或<32>所述的生產(chǎn)細胞，其中，染色體上的e4基因插入數(shù)量為e2基因在染色體上的插入數(shù)量的0.4倍以下。

50、<36>一種<1>至<35>中任一項所述的生產(chǎn)細胞的制造方法，其包括：將在外源啟動子的控制下的cap基因及在外源啟動子的控制下的rep基因?qū)氲讲溉閯游锛毎小?/p>

51、<37>根據(jù)<36>所述的生產(chǎn)細胞的制造方法，其還包括導(dǎo)入反向四環(huán)素調(diào)節(jié)性轉(zhuǎn)錄激活因子。

52、<38>一種腺相關(guān)病毒的制造方法，其包括：通過培養(yǎng)<1>至<35>中任一項所述的生產(chǎn)細胞來產(chǎn)生腺相關(guān)病毒。

53、<39>一種腺相關(guān)病毒的制造方法，其包括如下工序：

54、在不誘導(dǎo)cap基因及rep基因的表達的條件下培養(yǎng)<1>至<35>中任一項所述的生產(chǎn)細胞而使上述生產(chǎn)細胞增殖；及

55、通過在誘導(dǎo)cap基因及rep基因的表達的條件下培養(yǎng)所增殖的生產(chǎn)細胞來產(chǎn)生腺相關(guān)病毒。

56、<40>一種腺相關(guān)病毒的制造方法，其包括如下工序：

57、在不誘導(dǎo)cap基因、rep基因及e4基因的表達的條件下培養(yǎng)<4>至<8>中任一項所述的生產(chǎn)細胞而使上述生產(chǎn)細胞增殖；及

58、通過在誘導(dǎo)cap基因、rep基因及e4基因的表達的條件下培養(yǎng)所增殖的生產(chǎn)細胞來產(chǎn)生腺相關(guān)病毒。

59、<a>一種腺相關(guān)病毒，其通過<38>至<40>中任一項所述的腺相關(guān)病毒的制造方法來制造。

60、<b>一種用于制造生產(chǎn)細胞的載體試劑盒，其包括：第一載體，攜帶有在外源啟動子的控制下的cap基因、在外源啟動子的控制下的rep基因及在外源啟動子的控制下的e2a基因；及第二載體，攜帶有在外源啟動子的控制下的e4基因。

61、發(fā)明效果

62、根據(jù)本發(fā)明，能夠避免或減少建立生產(chǎn)細胞時的細胞損傷。