本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種適用于器官/類器官循環(huán)培養(yǎng)的系統(tǒng)、方法及類器官。

背景技術(shù)：

1、類器官培養(yǎng)作為目前火熱的技術(shù)領(lǐng)域，它是由正?；蚰[瘤組織中成體干細(xì)胞分化而來，在體外三維培養(yǎng)條件下，形成的三維體外細(xì)胞結(jié)構(gòu)，具有自我組織形成類似于原始組織的“微型器官”的能力，能夠較好的表現(xiàn)來源組織的特征和細(xì)胞異質(zhì)性。類器官作為腫瘤研究的臨床前模型，可用于藥物篩選，預(yù)測患者對治療的反應(yīng)，為患者選擇最合適的治療方案。還可以通過基因編輯技術(shù)，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

2、在現(xiàn)有類器官培養(yǎng)技術(shù)中，為了克服培養(yǎng)環(huán)境下毒氨等有害物質(zhì)的積累，需要通過維持二氧化碳的碳環(huán)境濃度、在培養(yǎng)基中額外添加中和物質(zhì)等手段實(shí)現(xiàn)，這可以滿足靜態(tài)培養(yǎng)的要求，卻無法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模高效率的動態(tài)培養(yǎng)，如在營養(yǎng)成分配比上不能滿足循環(huán)培養(yǎng)，特別是難以滿足蛋白質(zhì)含量，微量元素含量等實(shí)時(shí)調(diào)整，難以滿足現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展需求。

3、因此，針對上述技術(shù)問題，有必要提供一種適用于器官/類器官循環(huán)培養(yǎng)的系統(tǒng)、方法及類器官。

4、公開于該背景技術(shù)部分的信息僅僅旨在增加對本發(fā)明的總體背景的理解，而不應(yīng)當(dāng)被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種適用于器官/類器官循環(huán)培養(yǎng)的系統(tǒng)、方法及類器官。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一具體實(shí)施例提供的技術(shù)方案如下：

3、適用于器官/類器官循環(huán)培養(yǎng)的系統(tǒng)，包括具有腔室和連接腔室的模擬循環(huán)系統(tǒng)的微流道的芯片，在培養(yǎng)過程中所述腔室中容納有具有樣本細(xì)胞的基質(zhì)膠并以微流道為腔室中提供器官培養(yǎng)基，器官培養(yǎng)基包括：用于多癌種的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其組成包括氨基酸、維生素、無機(jī)鹽、蛋白質(zhì)以及微量元素；以及為適應(yīng)不同類型的癌細(xì)胞培養(yǎng)還添加有，均以終濃度計(jì)：

4、針對肺癌樣本培養(yǎng)添加：100ng/ml?fgf10（成纖維細(xì)胞生長因子10）、250ng/mlnoggin、50ng/ml?fgf2（成纖維細(xì)胞生長因子2）、30nm?sb202190、100ng/ml?rspondin-1、1xb27、3μm?chir99021；

5、針對胃癌樣本培養(yǎng)添加：50ng/ml?egf（表皮生長因子）、5nm?gastrin、100ng/mlrspondin-1、250ng/ml?noggin、1x?b27、20nm?a83-01、50μg/ml?primocin；

6、針對腸癌樣本培養(yǎng)添加：100ng/ml?rspondin-1、250ng/ml?noggin、1x?b27、20nma83-01、50μg/ml?primocin、30nm?sb202190；

7、針對肝癌樣本培養(yǎng)添加：300ng/ml?rspondin-1、500ng/ml?noggin、3x?b27、10nma83-01、50μg/ml?primocin、3nm?sb202190、100ng/ml?hgf（肝細(xì)胞生長因子）。

8、在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中，氨基酸選自glycine（甘氨酸）、l-alanine（l-丙氨酸）、l-alanyl-l-glutamine（l-丙氨酸-谷氨酰胺）、l-arginine?hydrochloride（l-精氨酸鹽酸鹽?）、l-asparagine（l-天門冬氨酸）、l-aspartic?acid（l-天冬氨酸）、l-cystine2hcl（l-胱氨酸二鹽酸鹽）、l-glutamic?acid（l-谷氨酸）、l-histidine?hydrochloride-h2o（l-組氨酸鹽酸鹽）、l-isoleucine（l-異亮氨酸）、l-leucine（l-亮氨酸）、l-methionine（l-蛋氨酸）、l-proline（l-脯氨酸）、l-serine（l-絲氨酸）、l-threonine（l-蘇氨酸）、l-tryptophan（l-色氨酸）、l-tyrosine?disodiμm?salt?dihydrate（l-酪氨酸二鈉鹽二水合物）、l-valine（l-纈氨酸）、l-cysteine?hydrochloride-h2o（l-半胱氨酸鹽酸鹽）、l-asparagine-h2o（l-天門冬酰胺-水合物?）、l-lysine?hydrochloride（l-賴氨酸鹽酸鹽）、l-phenylalanine（l-苯丙氨酸）。

9、在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中，維生素選自ascorbic?acid?phosphate（維生素c磷酸酯）、choline?chloride（氯化膽堿）、d-calciμm?pantothenate（d-泛酸鈣）、folicacid（葉酸）、niacinamide（煙酰胺）、pyridoxine?hydrochloride（鹽酸維生素b6）、riboflavin（核黃素）、thiamine?hydrochloride（維生素b1鹽酸鹽）、i-inositol（肌醇）。

10、在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中，無機(jī)鹽選自calciμm?chloride?(cacl2)(anhyd.)（氯化鈣）、ferric?nitrate?(fe(no3)3"9h2o)（硝酸鐵）、magnesiμm?sulfate(mgso4)?(anhyd.)（硫酸鎂）、potassiμm?chloride?(kcl)（氯化鉀）、sodiμm?bicarbonate(nahco3)（碳酸氫鈉）、sodiμm?chloride?(nacl)（氯化鈉）、sodiμm?phosphate?dibasic(na2hpo4-h2o)（磷酸氫二鈉）。

11、在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中，蛋白質(zhì)選自albμmax??ii（富含脂質(zhì)bsa）、hμman?transferrin?(holo)（轉(zhuǎn)鐵蛋白）、insulin?recombinant?full?chain（重組人胰島素）。

12、在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中，微量元素選自ammoniμm?metavanadate（偏釩酸銨）、cupric?sulfate（硫酸銅）、manganous?chloride（氯化錳）、sodiμm?selenite（亞硒酸鈉）。

13、在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中，還包括其他組分，其選自d-glucose(dextrose)（無水葡萄糖）、ethanolamine（乙醇胺）、glutathione?(reduced)（還原性谷胱甘肽）、phenol?red（酚紅）、sodiμm?pyruvate（丙酮酸鈉）、linoleic?acid（亞油酸）、lipoicacid（硫辛酸）、hypoxanthine?na（次黃嘌呤）、putrescine?2hcl（腐胺二鹽酸鹽）、thymidine（胸腺嘧啶核苷）、hepes（4-羥乙基哌嗪乙磺酸）。

14、在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基具體為：

15、

16、

17、在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中，應(yīng)用適用于器官/類器官循環(huán)培養(yǎng)的系統(tǒng)的方法，包括：

18、準(zhǔn)備樣本，并匹配癌種準(zhǔn)備基礎(chǔ)培養(yǎng)基；

19、所述樣本經(jīng)清洗、組織消化、收獲細(xì)胞沉淀、基質(zhì)膠固化、在微流道系統(tǒng)中加入固化后的樣本和器官培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

20、在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中，培養(yǎng)為以微流芯片為依托進(jìn)行的循環(huán)培養(yǎng)。

21、在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中，類器官，至少包括由前述的系統(tǒng)培養(yǎng)得到的類器官組織。這里包括而不限于培養(yǎng)得到的三維形態(tài)的類器官組織自身，也包括包含有類器官組織的商品或者醫(yī)療用品或者實(shí)驗(yàn)性用品等。

22、在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中，循環(huán)培養(yǎng)為將樣本接種在有流道的可循環(huán)密閉芯片內(nèi)，流道內(nèi)接入匹配的基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

23、在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中，清洗為在由青霉/鏈霉素雙抗溶液組成清洗液中，目標(biāo)腫瘤組織樣本浸泡1min。

24、在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中，組織消化為：樣本加入組織消化液，在37℃、50rpm搖床中進(jìn)行震蕩和消化，消化完成后加入血清終止消化。

25、在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中，收獲細(xì)胞沉淀包括：將組織消化過程得到的細(xì)胞懸液用100μm的濾網(wǎng)過濾，在1000rpm、4℃條件下離心5min；離心完成后，棄上清，將細(xì)胞重懸后，再次1000rpm、4℃下，離心5min。

26、在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中，基質(zhì)膠固化具體包括：將基質(zhì)膠與基礎(chǔ)培養(yǎng)基以7:3的比例進(jìn)行混合，然后在細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)點(diǎn)膠，然后將細(xì)胞培養(yǎng)板放在37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)，靜置30min，等待基質(zhì)膠凝固。

27、在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中，加入培養(yǎng)基具體包括：將放入37℃培養(yǎng)箱中的細(xì)胞培養(yǎng)器中加入一定體積的基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)：動態(tài)培養(yǎng)在可循環(huán)的微流芯片內(nèi)進(jìn)行，但都需要將可循環(huán)的芯片放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

28、在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中，hepes的濃度是595.8mg/l。

29、在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中，l-丙氨酰-l-谷氨酰胺二肽的濃度是151.3mg/l。

30、在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中，l-丙氨酰-l-谷氨酰胺二肽的滲透壓是440-500mosm/kg。

31、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的適用于器官/類器官循環(huán)培養(yǎng)的系統(tǒng)、方法及類器官。

32、與現(xiàn)有基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比，本發(fā)明通過優(yōu)化培養(yǎng)基技術(shù)，提供了一種成分明確的培養(yǎng)基，且無需額外添加hepes和l-丙氨酰-l-谷氨酰胺二肽，可以高效克服現(xiàn)有體系下毒氨積累等方面的問題，從而滿足可循環(huán)動態(tài)培養(yǎng)的需求。

33、本發(fā)明所提供的基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有雙緩沖體系，碳酸氫鈉和hepes緩沖體系，既可以滿足傳統(tǒng)的靜態(tài)培養(yǎng)還可以進(jìn)行芯片循環(huán)培養(yǎng)；具有更好的能量供給，不形成有毒氨的堆積。根據(jù)所培養(yǎng)的癌種不同，加入不同種類的因子即可。采用本發(fā)明的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)多癌種的類器官，無論是靜態(tài)還是動態(tài)都能夠表現(xiàn)出固有組織的活性特征，實(shí)現(xiàn)近似于腫瘤組織的綜合特征。