本發(fā)明屬于生物學(xué)檢測(cè)，尤其涉及一種檢測(cè)泰澤隱孢子蟲的引物探針組合物、試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

1、泰澤隱孢子蟲(cryptosporidium?tyzzeri)是一種寄生在小鼠腸道的天然易感病原體，能夠感染小鼠、豚鼠、沙鼠等嚙齒類動(dòng)物。一方面，在小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，泰澤隱孢子蟲存在的情況較為普遍，不僅影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量，在一定程度上也對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。另一方面，泰澤隱孢子蟲小鼠感染模型可以作為評(píng)價(jià)預(yù)防和治療微小隱孢子蟲病疫苗和藥物的動(dòng)物模型。目前，診斷動(dòng)物感染泰澤隱孢子蟲的方法主要包括鏡檢法和分子檢測(cè)技術(shù)。然而，這些方法各有局限性：鏡檢法包括直接涂片鏡檢和染色鏡檢，雖然能通過卵囊的大小、形狀和內(nèi)部結(jié)構(gòu)來識(shí)別隱孢子蟲，但實(shí)際操作中卻面臨諸多挑戰(zhàn)。卵囊直徑?。▋H為4～6μm），內(nèi)部結(jié)構(gòu)模糊，使得觀察變得困難。此外，卵囊與糞便中的霉菌、食物碎屑等小顆粒難以有效區(qū)分，導(dǎo)致鑒定過程耗時(shí)且需要豐富的專業(yè)知識(shí)。相比之下，分子檢測(cè)技術(shù)以其高靈敏性、穩(wěn)定性及特異性為泰澤隱孢子蟲的檢測(cè)提供了新的途徑，其中，pcr和定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（qrt-pcr）等方法已經(jīng)得到開發(fā)并應(yīng)用于泰澤隱孢子蟲的檢測(cè)。然而，這些方法同樣存在不足，如耗時(shí)長以及對(duì)大型檢測(cè)設(shè)備的高度依賴，限制了其在實(shí)際應(yīng)用中的廣泛性。因此，快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物泰澤隱孢子蟲感染的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

2、重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增側(cè)流層析技術(shù)（raa-lfd）是重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增raa（recombinase-aid?amplification?raa）技術(shù)結(jié)合側(cè)流層析試紙條（lateral?flow?dipsticks?lfd）建立的一種現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)系統(tǒng)，特別適用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全及農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，具有發(fā)展成為快速檢測(cè)試劑盒的潛力。但目前尚未有raa-lfd用于檢測(cè)泰澤隱孢子蟲感染的方案被報(bào)道。為此本發(fā)明提出一種檢測(cè)泰澤隱孢子蟲的引物探針組合物、試劑盒及方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)泰澤隱孢子蟲的引物探針組合物、試劑盒及方法，旨在解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、一種檢測(cè)泰澤隱孢子蟲的引物探針組合物，包括上游引物、下游引物和探針，所述上游引物的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如seq?id?no.2所示；所述探針的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；

4、所述下游引物的5'端進(jìn)行生物素化修飾；所述探針的5'端由6-羧基熒光素修飾，相關(guān)g堿基被[thf]殘基取代，3'端由c3?spacer修飾。

5、一種檢測(cè)泰澤隱孢子蟲的試劑盒，所述試劑盒包括上述所述的引物探針組合物，所述引物探針組合物包括10μm上游引物1.0μl、10μm下游引物1.0μl和10μm探針0.6μl。

6、進(jìn)一步的，所述試劑盒還包括raa擴(kuò)增反應(yīng)試劑、對(duì)照物和側(cè)流層析試紙條。

7、進(jìn)一步的，所述raa擴(kuò)增反應(yīng)試劑包括含raa凍干顆粒的反應(yīng)管、反應(yīng)緩沖液、啟動(dòng)劑及純化水；所述含raa凍干顆粒反應(yīng)管的組分包括重組酶、dna聚合酶、單鏈dna結(jié)合蛋白、dntp以及外切酶。

8、進(jìn)一步的，所述對(duì)照物包括陽性對(duì)照和陰性對(duì)照；陽性對(duì)照的dna模板為感染泰澤隱孢子蟲糞便基因組dna；陰性對(duì)照的dna模板為未感染泰澤隱孢子蟲糞便基因組dna。

9、一種利用上述所述的試劑盒檢測(cè)泰澤隱孢子蟲的方法，包括以下步驟：

10、步驟s1、提取待檢樣品的基因組dna；

11、步驟s2、raa擴(kuò)增：將引物探針組合物與提取的待檢樣品基因組dna混合于raa擴(kuò)增反應(yīng)試劑的反應(yīng)管中配置成擴(kuò)增反應(yīng)體系，進(jìn)行raa擴(kuò)增反應(yīng)；

12、步驟s3、lfd檢測(cè)raa擴(kuò)增產(chǎn)物：利用側(cè)流層析試紙條檢測(cè)raa擴(kuò)增產(chǎn)物。

13、進(jìn)一步的，所述raa擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)溫度為39℃，反應(yīng)時(shí)間為30min。

14、進(jìn)一步的，所述步驟s3的具體過程如下：

15、將raa擴(kuò)增產(chǎn)物用pbs稀釋至350μl，取10μl擴(kuò)增產(chǎn)物滴加于樣品墊上，然后滴加100μl試紙條緩沖液于樣品墊上，室溫下反應(yīng)5min，肉眼觀察結(jié)果：

16、若側(cè)流層析試紙條質(zhì)控線、檢測(cè)線均顯色，則raa擴(kuò)增產(chǎn)物為陽性，樣品中含有泰澤隱孢子蟲dna；

17、若側(cè)流層析試紙條僅質(zhì)控線出現(xiàn)條帶，檢測(cè)線無條帶出現(xiàn)，則raa擴(kuò)增產(chǎn)物為陰性，樣品中無泰澤隱孢子蟲dna；

18、若側(cè)流層析試紙條質(zhì)控線未顯色，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果無效。

19、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

20、本發(fā)明在實(shí)際應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)小鼠感染泰澤隱孢子蟲的檢測(cè)中具有切實(shí)的實(shí)際意義，不僅降低了對(duì)檢測(cè)設(shè)備的依賴，還縮短了檢測(cè)時(shí)長，同時(shí)確保了檢測(cè)結(jié)果的精準(zhǔn)性。對(duì)臨床樣品的測(cè)試結(jié)果顯示，在39℃條件下擴(kuò)增30min后，僅需將擴(kuò)增產(chǎn)物滴加至試紙條上，短時(shí)間內(nèi)即可獲得結(jié)果，且對(duì)泰澤隱孢子蟲卵囊的最低檢出限達(dá)到10-2個(gè)。在擁有良好的特異性的同時(shí)，該檢測(cè)方法還實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)過程的快速高效以及檢測(cè)結(jié)果的直觀可視化。

技術(shù)特征：

1.一種檢測(cè)泰澤隱孢子蟲的引物探針組合物，其特征在于，包括上游引物、下游引物和探針，所述上游引物的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如seqid?no.2所示；所述探針的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；

2.一種檢測(cè)泰澤隱孢子蟲的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求1所述的引物探針組合物，所述引物探針組合物包括10μm上游引物1.0μl、10μm下游引物1.0μl和10μm探針0.6μl。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括raa擴(kuò)增反應(yīng)試劑、對(duì)照物和側(cè)流層析試紙條。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述raa擴(kuò)增反應(yīng)試劑包括含raa凍干顆粒的反應(yīng)管、反應(yīng)緩沖液、啟動(dòng)劑及純化水；所述含raa凍干顆粒反應(yīng)管的組分包括重組酶、dna聚合酶、單鏈dna結(jié)合蛋白、dntp以及外切酶。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述對(duì)照物包括陽性對(duì)照和陰性對(duì)照；陽性對(duì)照的dna模板為感染泰澤隱孢子蟲糞便基因組dna；陰性對(duì)照的dna模板為未感染泰澤隱孢子蟲糞便基因組dna。

6.一種利用權(quán)利要求2-5任一項(xiàng)所述的試劑盒檢測(cè)泰澤隱孢子蟲的方法，其特征在于，包括以下步驟：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述raa擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)溫度為39℃，反應(yīng)時(shí)間為30min。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟s3的具體過程如下：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明適用于生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種檢測(cè)泰澤隱孢子蟲的引物探針組合物、試劑盒及方法，引物探針組合物包括上游引物、下游引物和探針，上游引物、下游引物和探針的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1~SEQ?ID?NO.3所示。本發(fā)明在實(shí)際應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)小鼠感染泰澤隱孢子蟲的檢測(cè)中具有切實(shí)的實(shí)際意義，降低了對(duì)檢測(cè)設(shè)備的依賴，縮短了檢測(cè)時(shí)長，同時(shí)確保了檢測(cè)結(jié)果的精準(zhǔn)性。對(duì)臨床樣品的測(cè)試結(jié)果顯示，經(jīng)39℃擴(kuò)增30min后，將擴(kuò)增產(chǎn)物滴加至試紙條上，短時(shí)間內(nèi)即可獲得結(jié)果，且對(duì)泰澤隱孢子蟲卵囊的最低檢出限達(dá)到10<supgt;?2</supgt;個(gè)。在擁有良好的特異性的同時(shí)，該檢測(cè)方法還實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)過程的快速高效以及檢測(cè)結(jié)果的直觀可視化。

技術(shù)研發(fā)人員：張西臣,韓銘書,張楠,王曉岑,李建華,宮鵬濤,李新,張旭
受保護(hù)的技術(shù)使用者：吉林大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9