本發(fā)明涉及生物，具體而言，涉及一種自然殺傷細(xì)胞標(biāo)志物、篩選裝置及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、哺乳動(dòng)物的血液系統(tǒng)包含超過10種不同的成熟細(xì)胞類型，它們都由同一種始祖細(xì)胞類型—造血干細(xì)胞(hematopoietic?stem?cell，hsc)分化而來。成熟的血液細(xì)胞類型可以大致分為兩類：(1)髓系細(xì)胞，主要包括巨核細(xì)胞、成紅細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸/堿/中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；(2)淋巴系細(xì)胞，主要包括b細(xì)胞、t細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞。

2、自然殺傷細(xì)胞(natural?killer?cell，nk?cell)是免疫系統(tǒng)的天然關(guān)鍵參與者，在腫瘤或病毒感染激活前會(huì)自動(dòng)殺死細(xì)胞。自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中含有豐富的小顆粒，其中含有特殊的蛋白質(zhì)，如蛋白酶和稱為顆粒酶的蛋白酶。它在被殺傷細(xì)胞附近釋放，并通過靶細(xì)胞細(xì)胞膜上的孔粒酶及相關(guān)分子的形成在靶細(xì)胞內(nèi)傳播，導(dǎo)致靶細(xì)胞的破壞。因此，自然殺傷細(xì)胞是非抗原特異性靶向病毒感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵先天效應(yīng)細(xì)胞。

3、鑒于自然殺傷細(xì)胞在機(jī)體免疫尤其是抗腫瘤免疫方面的重要作用，其受到科學(xué)和臨床研究的廣泛關(guān)注。但開展相關(guān)研究的首要前提在于如何鑒定/富集自然殺傷細(xì)胞。傳統(tǒng)生物實(shí)驗(yàn)的篩選方法，主要是利用自然殺傷細(xì)胞高表達(dá)cd56細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白的特性，通過流式分選或磁珠分選將自然殺傷細(xì)胞從一群細(xì)胞中分離出來。但這種方法耗時(shí)耗力，精度上也存在一定限度。2017年nvigen?inc的“復(fù)合物用于捕獲樣本中的稀有細(xì)胞”專利(專利號(hào)：wo2017035419-a1)，通過設(shè)計(jì)可操作地連接到聚乙二醇(peg)化合物的珠子和連接到珠子的分析物捕獲組分，分析物捕獲組分能夠特異性地結(jié)合到稀有細(xì)胞的表面標(biāo)記，從而捕獲包括自然殺傷細(xì)胞在內(nèi)的罕見免疫細(xì)胞或循環(huán)細(xì)胞，用以指示疾病的存在。該專利基于設(shè)計(jì)珠子、分析物捕獲組分的復(fù)合物，鑒別包括自然殺傷細(xì)胞在內(nèi)的稀有細(xì)胞，主要用于疾病預(yù)測(cè)。該技術(shù)需要設(shè)計(jì)珠子和相應(yīng)分析物捕獲組分，成本較高且技術(shù)難度較大。捕獲到細(xì)胞后需要對(duì)混合細(xì)胞群進(jìn)行二次區(qū)分，且主要目的是指示疾病狀態(tài)，不能很好地適用于自然殺傷細(xì)胞類型鑒定。2013年授權(quán)的專利“通過幾種細(xì)胞表面標(biāo)志物鑒別癌癥患者外周血樣的樹突狀殺傷細(xì)胞”，利用自然殺傷細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和人類白細(xì)胞抗原中選擇的幾種細(xì)胞表面標(biāo)志物，來鑒定和篩選從癌癥患者獲得的用于開發(fā)癌癥細(xì)胞免疫療法的人類外周血樣品中的自然殺傷細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞。該技術(shù)通過4個(gè)逐步篩選的步驟，最終分離得到表型為hla-g-cd14-cd19-cd3-cd56+hla-dr+的樹突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞混樣。該技術(shù)通過細(xì)胞表面標(biāo)志物逐步鑒定富集自然殺傷細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞混樣，篩選流程比較繁瑣。且通過評(píng)估細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)高低的鑒別方法存在一定的主觀性，特異性和精確性也有些不足。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明旨在提供一種自然殺傷細(xì)胞標(biāo)志物、篩選裝置及應(yīng)用，以提供新的自然殺傷細(xì)胞標(biāo)志物。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種標(biāo)志物在鑒定、富集或分選自然殺傷細(xì)胞中的應(yīng)用，標(biāo)志物包括基因標(biāo)志物和/或蛋白標(biāo)志物，基因標(biāo)志物為rna18sn1、rna18sn2、rna18sn3和gzma基因中的一個(gè)或多個(gè)，蛋白標(biāo)志物為rna18sn1、rna18sn2、rna18sn3和gzma基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物中的一個(gè)或多個(gè)。

3、進(jìn)一步地，當(dāng)應(yīng)用為鑒定自然殺傷細(xì)胞時(shí)，應(yīng)用包括檢測(cè)基因標(biāo)志物的表達(dá)量，優(yōu)選地，檢測(cè)基因標(biāo)志物的表達(dá)量為檢測(cè)基因標(biāo)志物的mrna表達(dá)量或蛋白表達(dá)量；更優(yōu)選地，通過高通量測(cè)序檢測(cè)基因標(biāo)志物的mrna表達(dá)量；可選地，應(yīng)用為在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究中對(duì)自然殺傷細(xì)胞的鑒定。

4、進(jìn)一步地，對(duì)來源于生物樣品中的自然殺傷細(xì)胞進(jìn)行鑒定、富集或分選，其中，生物樣品選自以下一種或多種：外周血、骨髓、臍帶血、肝或淋巴結(jié)。

5、根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種標(biāo)志物在制備鑒定、富集或分選自然殺傷細(xì)胞的相關(guān)產(chǎn)品中的應(yīng)用，標(biāo)志物包括基因標(biāo)志物和/或蛋白標(biāo)志物，基因標(biāo)志物為rna18sn1、rna18sn2、rna18sn3和gzma基因中的一個(gè)或多個(gè)，蛋白標(biāo)志物為rna18sn1、rna18sn2、rna18sn3和gzma基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物中的一個(gè)或多個(gè)。

6、進(jìn)一步地，當(dāng)應(yīng)用為制備鑒定自然殺傷細(xì)胞的相關(guān)產(chǎn)品時(shí)，相關(guān)產(chǎn)品包括采用檢測(cè)試劑檢測(cè)基因標(biāo)志物的表達(dá)量，

7、優(yōu)選地，檢測(cè)試劑為檢測(cè)基因標(biāo)志物的mrna表達(dá)量或蛋白表達(dá)量的檢測(cè)試劑；

8、更優(yōu)選地，檢測(cè)基因標(biāo)志物的mrna表達(dá)量的檢測(cè)試劑為探針和/或引物，進(jìn)一步優(yōu)選為將基因標(biāo)志物的mrna制備成高通量測(cè)序文庫的相關(guān)試劑。

9、進(jìn)一步地，對(duì)來源于生物樣品中的自然殺傷細(xì)胞進(jìn)行鑒定、富集或分選，其中，生物樣品選自以下一種或多種：外周血、骨髓、臍帶血、肝或淋巴結(jié)；

10、優(yōu)選地，相關(guān)產(chǎn)品包括試劑盒。

11、根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)方面，提供了一種鑒定自然殺傷細(xì)胞的試劑盒。該試劑盒包括檢測(cè)試劑，檢測(cè)試劑為用于檢測(cè)基因標(biāo)志物和/或蛋白標(biāo)志物表達(dá)量的檢測(cè)試劑，基因標(biāo)志物為rna18sn1、rna18sn2、rna18sn3和gzma基因中的一個(gè)或多個(gè)，蛋白標(biāo)志物為rna18sn1、rna18sn2、rna18sn3和gzma基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物中的一個(gè)或多個(gè)；優(yōu)選的，檢測(cè)試劑為檢測(cè)基因標(biāo)志物的mrna表達(dá)量或蛋白表達(dá)量的檢測(cè)試劑；更優(yōu)選地，檢測(cè)基因標(biāo)志物的mrna表達(dá)量的檢測(cè)試劑為探針和/或引物，進(jìn)一步優(yōu)選為將基因標(biāo)志物的mrna制備成高通量測(cè)序文庫的相關(guān)試劑。

12、進(jìn)一步地，檢測(cè)試劑為檢測(cè)基因標(biāo)志物的mrna表達(dá)量或蛋白表達(dá)量的檢測(cè)試劑；優(yōu)選地，檢測(cè)基因標(biāo)志物的mrna表達(dá)量的檢測(cè)試劑為探針和/或引物，進(jìn)一步優(yōu)選為將基因標(biāo)志物的mrna制備成高通量測(cè)序文庫的相關(guān)試劑。

13、根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供了一種自然殺傷細(xì)胞標(biāo)志物的篩選裝置。該篩選裝置包括：比對(duì)單元，配置為用于計(jì)算外周血中終末端分化血液細(xì)胞在正常生理?xiàng)l件下的基因表達(dá)譜，通過比較得到自然殺傷細(xì)胞與其他血液細(xì)胞的基因表達(dá)譜的差異特征，篩選出候選分子標(biāo)志物；篩選單元，配置為用于將比對(duì)單元中篩選出的候選分子標(biāo)志物結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)算法構(gòu)建自然殺傷細(xì)胞鑒別基因模型，篩選出自然殺傷細(xì)胞的標(biāo)志物。

14、進(jìn)一步地，其他血液細(xì)胞包括b淋巴細(xì)胞、t淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、成紅細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞；優(yōu)選的，機(jī)器學(xué)習(xí)算法為邏輯回歸模型。

15、進(jìn)一步地，比對(duì)單元中的原始數(shù)據(jù)為外周血中終末端分化血液細(xì)胞的rna-seq數(shù)據(jù)；

16、優(yōu)選的，比對(duì)單元中計(jì)算外周血中終末端分化血液細(xì)胞在正常生理?xiàng)l件下的基因表達(dá)譜包括對(duì)血液細(xì)胞基因表達(dá)譜定量；

17、更優(yōu)選的，基因表達(dá)譜定量包括將原始的血液細(xì)胞rna-seq測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，包括剪切接頭，去除低質(zhì)量讀長，質(zhì)控后的序列比對(duì)到人基因組，并過濾掉比對(duì)率小于閾值的樣本，使用tpm方法進(jìn)行定量；

18、優(yōu)選的，比對(duì)單元中通過比較得到自然殺傷細(xì)胞與其他血液細(xì)胞的基因表達(dá)譜的差異特征包括對(duì)自然殺傷細(xì)胞與其他血液細(xì)胞進(jìn)行兩兩之間的差異表達(dá)分析，相同細(xì)胞類型同一基因的表達(dá)量取均值；對(duì)于自然殺傷細(xì)胞，有相較于其他血液細(xì)胞均上調(diào)差異基因列表，通過取交集獲得自然殺傷細(xì)胞類型特異的上調(diào)差異基因，優(yōu)選去除cellmarker數(shù)據(jù)庫已報(bào)道的標(biāo)志基因后，作為自然殺傷細(xì)胞的候選分子標(biāo)志物。

19、進(jìn)一步地，篩選單元配置為將單個(gè)候選分子標(biāo)志物作為輸入，利用機(jī)器學(xué)習(xí)分類模型分別構(gòu)建模型對(duì)數(shù)據(jù)樣本進(jìn)行自然殺傷細(xì)胞鑒定；預(yù)測(cè)分?jǐn)?shù)由模型自動(dòng)評(píng)估，通過受試者工作特征曲線下面積auc值評(píng)估模型鑒定效果；若auc值大于閾值，則判斷候選分子標(biāo)志物作為用于鑒定、富集或分選自然殺傷細(xì)胞的標(biāo)志物。

20、進(jìn)一步地，篩選單元還包括鑒定模塊，鑒定模塊配置為對(duì)標(biāo)志物鑒定效果進(jìn)行比較驗(yàn)證；比較驗(yàn)證包括：

21、選取對(duì)照基因集，利用機(jī)器學(xué)習(xí)分類模型構(gòu)建模型對(duì)數(shù)據(jù)樣本進(jìn)行自然殺傷細(xì)胞鑒定；預(yù)測(cè)分?jǐn)?shù)由模型自動(dòng)評(píng)估，通過受試者工作特征曲線下面積auc值評(píng)估模型鑒定效果；通過比較對(duì)照基因集與標(biāo)志物的auc值，驗(yàn)證標(biāo)志物的鑒定效果。

22、根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供了一種自然殺傷細(xì)胞標(biāo)志物的鑒定裝置，鑒定裝置配置為：選取對(duì)照基因集，利用機(jī)器學(xué)習(xí)分類模型構(gòu)建模型對(duì)數(shù)據(jù)樣本進(jìn)行自然殺傷細(xì)胞鑒定；預(yù)測(cè)分?jǐn)?shù)由模型自動(dòng)評(píng)估，通過受試者工作特征曲線下面積auc值評(píng)估模型鑒定效果；通過比較對(duì)照基因集與標(biāo)志物的auc值，驗(yàn)證標(biāo)志物的鑒定效果。

23、應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，基于大量公共外周血轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，利用機(jī)器學(xué)習(xí)方法篩選開發(fā)新的自然殺傷細(xì)胞分子標(biāo)志物。篩選得到的自然殺傷細(xì)胞新的分子標(biāo)志物rna18sn1、rna18sn2、rna18sn3和gzma基因，預(yù)測(cè)模型auc值分別為0.91、0.92、0.92、0.92，鑒定效果接近甚至優(yōu)于現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫分子標(biāo)志物。因此，四個(gè)新標(biāo)志物可用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的自然殺傷細(xì)胞鑒定研究。此外，構(gòu)建的機(jī)器學(xué)習(xí)模型也可用于鑒定數(shù)據(jù)樣本中的自然殺傷細(xì)胞。