本發(fā)明涉及生物測序領(lǐng)域，尤其涉及三聚氰酸在測序中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、第二代dna測序技術(shù)具有測序通量大、成本低、自動化程度高和單分子測序的特點。已經(jīng)廣泛應(yīng)用于全基因組測序，轉(zhuǎn)錄組測序，宏基因組測序等，是分析生物的進化與分類，研究癌癥，自閉癥等疾病相關(guān)基因，以及進行體外診斷等的有力工具，促進了人們對于生命科學(xué)的進一步了解，也推動了健康產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前已開發(fā)的第二代dna測序技術(shù)主要涉及，邊連接邊測序(sequencing?by?ligation,sbl)技術(shù)和邊合成邊測序(sequencingbysynthesis,sbs)技術(shù)，浸泡測序(dipseq)技術(shù)在內(nèi)的聯(lián)合探針錨定合成測序技術(shù)(combinatorial?probe?anchor?synthesis,cpas)。

2、浸泡測序(dipseq)技術(shù)是一種具有高通量、低成本、自動化等優(yōu)勢的二代測序技術(shù)，以cpas和dna納米球(dna?nanoball，dnb)為技術(shù)核心。dipseq使用溫度穩(wěn)定的水浴鍋代替復(fù)雜的溫控系統(tǒng)，有利于提供生化反應(yīng)的穩(wěn)定性，生化反應(yīng)上，仍以cpas為測序核心技術(shù)，測序試劑按照所設(shè)計的特定順序放在試劑槽，試劑槽固定在水浴鍋中，達到所需溫度后，通過設(shè)計好的測序設(shè)備，讓芯片在不同的試劑槽之間移動，完成一個完成的測序循環(huán)過程。這種反應(yīng)方式由于試劑一直浸泡在恒定高溫中，酶的活性，疊氮基團穩(wěn)定性等問題，影響dipseq測序質(zhì)量及讀長。

3、bgi-seq?cpas是采用先進的dna納米球(dna?nanoball，dnb)以及聯(lián)合探針錨定聚合(combinatorial?probe?anchor?synthesis，cpas)測序核心技術(shù)，使用一種經(jīng)過特殊表面修飾的規(guī)則陣列芯片，每個修飾位點僅固定一個dna納米球，陣列芯片修飾位點的間距均一，可保證不同納米球的光信號不會互相干擾，從而大幅提高信號處理的準(zhǔn)確性。通過儀器液路系統(tǒng)將測序試劑和帶有不同發(fā)光波長的熒光標(biāo)記探針泵入測序芯片流動室，每個dna納米球每個測序周期只結(jié)合一種熒光標(biāo)記物，再由激光器激發(fā)熒光基團發(fā)光，不同熒光基團所發(fā)射的光信號被科學(xué)級cmos相機采集。之后規(guī)則陣列芯片上的光信號經(jīng)過處理后由隨機軟件轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號，傳輸?shù)接嬎銠C進行處理，就能獲取待測樣本的堿基序列信息。

4、bgi-dipseq技術(shù)中，采用浸泡測序法，使用溫度穩(wěn)定的水浴鍋代替復(fù)雜的溫控系統(tǒng)，一方面維持穩(wěn)定的生化反應(yīng)環(huán)境，另一方面可以使試劑與芯片接觸充分。其生化反應(yīng)采用傳統(tǒng)了bgi傳統(tǒng)的cpas測序試劑以及生化反應(yīng)原理和步驟。一個完整的循環(huán)包括如下：聚合反應(yīng)試劑，用于延伸待測dna鏈的互補鏈；洗脫試劑，洗掉前一步反應(yīng)中殘留的聚合反應(yīng)試劑；拍照試劑，用于在拍照時保護dna和熒光標(biāo)記；再生試劑，移除互補鏈末端dntp的阻斷，使得互補鏈可以繼續(xù)延伸；洗脫試劑：洗掉前一步反應(yīng)中殘留的再生試劑。

5、基于bgi?seq-500測序平臺的cpas測序技術(shù)，生化反應(yīng)部分主要采用流道式方案，把特定的試劑在特定時間點的特定位置從制冷設(shè)備泵入對應(yīng)的流動槽來完成，并且輔助以精細的溫控設(shè)施，確保在盡可能短的時間內(nèi)讓生化反應(yīng)得以充分進行進行，其反應(yīng)步驟已經(jīng)在對dipseq測序技術(shù)的描述中提到。然而，bgiseq-500測序平臺由于光學(xué)系統(tǒng)的局限性，其拍照時間較長(拍全芯片全程約需14min/每個循環(huán))，意味著拍照試劑在流動室中的停留時間較長。

6、現(xiàn)有的dipseq技術(shù)和bgi500測序技術(shù)，前者由于采用浸泡測序法，測序反應(yīng)試劑一直處在恒定高溫環(huán)境中。這種環(huán)境對試劑組分的穩(wěn)定性帶來一些技術(shù)難題，一定程度上可能影響測序酶在該環(huán)境中的反應(yīng)效率。譬如，如何維持測序酶的活性不受溫度影響，帶有特殊標(biāo)記的dntp和切除試劑在高溫條件下的穩(wěn)定性等。這些因素直接表現(xiàn)出在測序過程中產(chǎn)生相對較高的lag/run?on比率。該高通量測序試劑中的測序反應(yīng)試劑的這種缺陷，不利于dipseq高通量通用測序試劑在高讀長測序方面的科研需求與臨床應(yīng)用。

7、后者盡管試劑穩(wěn)定性優(yōu)于前者，但由于拍照系統(tǒng)局限，拍照時間較長，拍照過程使用的拍照試劑在芯片表面停留時間的長短也對測序熒光基團有光漂白作用(即熒光信號淬滅)，某種程度上導(dǎo)致區(qū)域性的測序質(zhì)量偏差。

8、此外，無論是在bgi-dipseq技術(shù)還是在bgi-seq技術(shù)中，拍照過程對測序模板(dnb)和特殊標(biāo)記的dntp的破壞程度因光機而異，拍照試劑的抗光損傷作用的強弱，一定程度上影響平臺的測序質(zhì)量。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供了三聚氰酸在測序中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)關(guān)鍵是在dipseq高通量測序cpas生化試劑中，通過添加ca(cyanuric?acid，三聚氰酸)，可以促進dnb、酶、疊氮基團的穩(wěn)定性，提高反應(yīng)效率，降低lag/runon，提高測序質(zhì)量。

2、為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了三聚氰酸在測序中的應(yīng)用。

4、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述應(yīng)用中，所述測序包括高通量測序。

5、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述應(yīng)用中，所述測序包括浸泡測序技術(shù)(dipseq)或探針錨定合成測序技術(shù)(cpas)。

6、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述應(yīng)用中，所述三聚氰酸增強dnb聚合酶、dntp和/或疊氮基團的熱穩(wěn)定性。

7、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述應(yīng)用中，所述三聚氰酸減少滯后反應(yīng)和/或超前反應(yīng)。

8、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述應(yīng)用中，所述三聚氰酸促進聚合反應(yīng)和/或提高測序質(zhì)量。

9、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述應(yīng)用中，所述三聚氰酸降低熒光染料的光漂白作用和/或淬滅作用。

10、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述應(yīng)用中，所述三聚氰酸降低dnb光損傷。

11、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述應(yīng)用中，所述三聚氰酸的添加量為125～500μmol/l。

12、本發(fā)明還提供了三聚氰酸在制備聚合反應(yīng)試劑、拍照試劑、試劑組合或試劑盒中的應(yīng)用。

13、本發(fā)明還提供了聚合反應(yīng)試劑包括：125～500μmol/l三聚氰酸。

14、本發(fā)明還提供了拍照試劑包括：125～500μmol/l三聚氰酸。

15、在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明的試劑組合(bgiseq500-cpas測序緩沖液)還包括：te緩沖液、dnb制備緩沖液、dnb聚合酶混合液i、dnb聚合酶混合液i(lc)、dnb終止緩沖液、dnb加載緩沖液i、dnb加載緩沖液ii、dntps混合液、dntps混合液ii和dna聚合酶混合液。

16、本發(fā)明還提供了試劑組合，包括上述聚合反應(yīng)試劑和/或上述拍照試劑。

17、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述試劑組合包括cpas測序試劑和/或dipseq試劑。

18、本發(fā)明提供了試劑盒，包括上述聚合反應(yīng)試劑、上述拍照試劑或上述試劑組合以及可接受的助劑或載體。

19、本發(fā)明還提供了測序方法，取待測樣品進行聚合反應(yīng)，經(jīng)第一洗脫后，拍照，再生，再經(jīng)第二洗脫，獲得測序結(jié)果；

20、所述聚合反應(yīng)采用上述聚合反應(yīng)試劑、上述試劑組合中的所述聚合反應(yīng)試劑或上述試劑盒中的所述聚合反應(yīng)試劑；

21、所述拍照采用上述拍照試劑、上述試劑組合中的所述拍照試劑或上述試劑盒中的所述拍照試劑。

22、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述測序方法中，所述第一洗脫洗掉所述聚合反應(yīng)試劑。

23、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述測序方法中，所述再生采用再生試劑，所述再生移除互補鏈末端dntp的阻斷，使得互補鏈可以繼續(xù)延伸。

24、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述測序方法中，所述第二洗脫洗掉所述再生試劑。

25、本發(fā)明提供了三聚氰酸在測序中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了聚合反應(yīng)試劑、拍照試劑、試劑組和試劑盒。

26、本發(fā)明的有益效果包括：

27、(1)本發(fā)明提供的ca可以增強dipseq技術(shù)中測序反應(yīng)試劑中的dnb聚合酶以及帶特殊標(biāo)記的dntp在高溫環(huán)境中的穩(wěn)定性,有效提高聚合效率，降低測序反應(yīng)過程中產(chǎn)生的lag(lag是滯后反應(yīng)，指在測序過程中的延遲現(xiàn)象，產(chǎn)生的原因包括反應(yīng)不充分和切除試劑切除不完全)，達到顯著提高測序質(zhì)量的目的。

28、(2)在拍照過程中，可顯著抵抗光機對包含dipseq技術(shù)在內(nèi)的bgi系列測序技術(shù)中所用到的熒光染料的光漂白作用，使熒光信號更加穩(wěn)定(從信號值的heatmap圖)，顯著削弱此類測序技術(shù)中原拍照試劑對熒光染料的淬滅作用。

29、(3)顯著降低或是減少光學(xué)作用對dnb產(chǎn)生的光損傷(信號值下降趨勢變緩慢；pe測序中二鏈回升的好壞。一般情況下，dnb若光損傷，二鏈信號則無回升)。