本發(fā)明涉及測(cè)序，具體涉及測(cè)序反應(yīng)穩(wěn)定劑組合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、第二代dna測(cè)序技術(shù)具有測(cè)序通量大、成本低、自動(dòng)化程度高和單分子測(cè)序的特點(diǎn)。已經(jīng)廣泛應(yīng)用于全基因組測(cè)序，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，宏基因組測(cè)序等，是分析生物的進(jìn)化與分類，研究癌癥，自閉癥等疾病相關(guān)基因，以及進(jìn)行體外診斷等的有力工具，促進(jìn)了人們對(duì)于生命科學(xué)的進(jìn)一步了解，也推動(dòng)了健康產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前已開發(fā)的第二代dna測(cè)序技術(shù)主要涉及，邊連接邊測(cè)序(sequencing?by?ligation,sbl)技術(shù)和邊合成邊測(cè)序(sequencing?bysynthesis,sbs)技術(shù)，華大基因開發(fā)的包括浸泡測(cè)序(dipseq)技術(shù)在內(nèi)的聯(lián)合探針錨定合成測(cè)序技術(shù)(combinatorial?probe?anchor?synthesis,cpas)。

2、華大基因開發(fā)的浸泡測(cè)序(dipseq)技術(shù)(參考我們浸泡測(cè)序的專利)是一種具有高通量、低成本、自動(dòng)化等優(yōu)勢(shì)的二代測(cè)序技術(shù)，以cpas和dna納米球(dna?nanoball，dnb)為技術(shù)核心。dipseq使用溫度穩(wěn)定的水浴鍋代替復(fù)雜的溫控系統(tǒng)，有利于提供生化反應(yīng)的穩(wěn)定性，生化反應(yīng)上，仍以cpas為測(cè)序核心技術(shù)，測(cè)序試劑按照所設(shè)計(jì)的特定順序放在試劑槽，試劑槽固定在水浴鍋中，達(dá)到所需溫度后，通過設(shè)計(jì)好的測(cè)序設(shè)備，讓芯片在不同的試劑槽之間移動(dòng)，完成一個(gè)完成的測(cè)序循環(huán)過程。這種反應(yīng)方式由于試劑一直浸泡在恒定高溫中，酶的活性，疊氮基團(tuán)穩(wěn)定性等問題，影響dipseq測(cè)序質(zhì)量及讀長。

3、bgi-seq?cpas是采用先進(jìn)的dna納米球(dna?nanoball，dnb)以及聯(lián)合探針錨定聚合(combinatorial?probe?anchor?synthesis，cpas)測(cè)序核心技術(shù)，使用一種經(jīng)過特殊表面修飾的規(guī)則陣列芯片，每個(gè)修飾位點(diǎn)僅固定一個(gè)dna納米球，陣列芯片修飾位點(diǎn)的間距均一，可保證不同納米球的光信號(hào)不會(huì)互相干擾，從而大幅提高信號(hào)處理的準(zhǔn)確性。通過儀器液路系統(tǒng)將測(cè)序試劑和帶有不同發(fā)光波長的熒光標(biāo)記探針泵入測(cè)序芯片流動(dòng)室，每個(gè)dna納米球每個(gè)測(cè)序周期只結(jié)合一種熒光標(biāo)記物，再由激光器激發(fā)熒光基團(tuán)發(fā)光，不同熒光基團(tuán)所發(fā)射的光信號(hào)被科學(xué)級(jí)cmos相機(jī)采集。之后規(guī)則陣列芯片上的光信號(hào)經(jīng)過處理后由隨機(jī)軟件轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)，傳輸?shù)接?jì)算機(jī)進(jìn)行處理，就能獲取待測(cè)樣本的堿基序列信息。

4、bgi-dipseq技術(shù)中，采用浸泡測(cè)序法，使用溫度穩(wěn)定的水浴鍋代替復(fù)雜的溫控系統(tǒng)，一方面維持穩(wěn)定的生化反應(yīng)環(huán)境，另一方面可以使試劑與芯片接觸充分。其生化反應(yīng)采用傳統(tǒng)了bgi傳統(tǒng)的cpas測(cè)序試劑以及生化反應(yīng)原理和步驟。一個(gè)完整的循環(huán)包括如下：聚合反應(yīng)試劑，用于延伸待測(cè)dna鏈的互補(bǔ)鏈；洗脫試劑，洗掉前一步反應(yīng)中殘留的聚合反應(yīng)試劑；拍照試劑，用于在拍照時(shí)保護(hù)dna和熒光標(biāo)記；再生試劑，移除互補(bǔ)鏈末端dntp的阻斷，使得互補(bǔ)鏈可以繼續(xù)延伸；洗脫試劑：洗掉前一步反應(yīng)中殘留的再生試劑。

5、基于bgi?seq-500測(cè)序平臺(tái)的cpas測(cè)序技術(shù)，生化反應(yīng)部分主要采用流道式方案，把特定的試劑在特定時(shí)間點(diǎn)的特定位置從制冷設(shè)備泵入對(duì)應(yīng)的流動(dòng)槽來完成，并且輔助以精細(xì)的溫控設(shè)施，確保在盡可能短的時(shí)間內(nèi)讓生化反應(yīng)得以充分進(jìn)行進(jìn)行，其反應(yīng)步驟已經(jīng)在對(duì)dipseq測(cè)序技術(shù)的描述中提到。目前，dipseq測(cè)序技術(shù)目標(biāo)是3min快速生化(bgiseq-500測(cè)序平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)生化時(shí)間約為6min)，由于聚合反應(yīng)時(shí)間減少，聚合效率降低，引起lag/runon升高，影響測(cè)序質(zhì)量。

6、現(xiàn)有的bgiseq-500rs高通量通用測(cè)序試劑中的測(cè)序反應(yīng)試劑，雖然可以完美滿足se100甚至更長的測(cè)序，但是在快速生化反應(yīng)流程下，由于聚合反應(yīng)時(shí)間縮短，反應(yīng)速率不變條件下，不能在有限的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)充分完成反應(yīng)，產(chǎn)生相對(duì)較高的起始lag值，影響測(cè)序質(zhì)量。在測(cè)序過程中，lag值是一個(gè)線性參數(shù)，具有累積效應(yīng)，與讀長密切相關(guān)。lag值高易產(chǎn)生測(cè)序讀取的準(zhǔn)確性，直接影響測(cè)序質(zhì)量(如q30)?，F(xiàn)有的dipseq技術(shù)由于采用浸泡測(cè)序法，測(cè)序反應(yīng)試劑一直處在恒定高溫環(huán)境中。這種環(huán)境對(duì)試劑組分的穩(wěn)定性帶來一些技術(shù)難題，一定程度上可能影響測(cè)序酶在該環(huán)境中的反應(yīng)效率。譬如，如何維持測(cè)序酶的活性不受溫度影響，帶有特殊標(biāo)記的dntp和切除試劑在高溫條件下的穩(wěn)定性等。這些因素直接表現(xiàn)出在測(cè)序過程中產(chǎn)生相對(duì)較高的lag和runon比率。該高通量測(cè)序試劑中的測(cè)序反應(yīng)試劑的這些缺陷，不利于dipseq高通量通用測(cè)序試劑在高讀長測(cè)序方面的科研需求與臨床應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供測(cè)序反應(yīng)穩(wěn)定劑組合物及其應(yīng)用，本發(fā)明提供的穩(wěn)定劑組合物能夠有效增強(qiáng)測(cè)試反應(yīng)試劑的穩(wěn)定劑、延長試劑保質(zhì)期，從而有效提高聚合反應(yīng)效率。

2、本發(fā)明提供了吡咯烷二硫代氨基甲酸銨和/或n,n'-二甲基硫脲在如下任意項(xiàng)中的應(yīng)用：

3、(i)、維持測(cè)序酶的高效性和/或特異性；和/或

4、(ii)、打開dnb特殊結(jié)構(gòu)；和/或

5、(iii)、增加引物與模板的特異性結(jié)合；和/或

6、(iv)、利于測(cè)序酶在二級(jí)結(jié)構(gòu)處延伸；和/或

7、(v)、提高聚合效率；和/或

8、(vi)、降低測(cè)序反應(yīng)過程中產(chǎn)生的lag；和/或

9、(vii)、提高測(cè)序質(zhì)量；和/或

10、(viii)、提高測(cè)序讀長和/或

11、(ix)、擴(kuò)大測(cè)序試劑的應(yīng)用范圍。

12、本發(fā)明提供了穩(wěn)定劑組合物，包括吡咯烷二硫代氨基甲酸銨和n,n'-二甲基硫脲。

13、與其他組合物相比，本發(fā)明提供的穩(wěn)定劑組合物能夠有效提高dipseq技術(shù)中測(cè)序反應(yīng)試劑，以及其中的dnb聚合酶和帶特殊熒光dntp在高溫環(huán)境中的穩(wěn)定性，維持dnb聚合酶和帶特殊熒光dntp在測(cè)序試劑中的有效濃度，降低測(cè)序反應(yīng)過程中產(chǎn)生的lag水平，達(dá)到顯著提高測(cè)序質(zhì)量的目的，獲得更準(zhǔn)確的技術(shù)效果。

14、在一些具體實(shí)施例中，所述穩(wěn)定劑組合物包括1mm吡咯烷二硫代氨基甲酸銨和1mmn,n'-二甲基硫脲。

15、實(shí)驗(yàn)表明，在上述濃度下的所述吡咯烷二硫代氨基甲酸銨和n,n'-二甲基硫脲之間配合緊密，維持酶和特殊基團(tuán)的穩(wěn)定性及有效濃度的效果最好，從而獲得更準(zhǔn)確的技術(shù)效果。

16、本發(fā)明還提供了所述的穩(wěn)定劑組合物在制備測(cè)序反應(yīng)試劑或測(cè)序試劑盒中的應(yīng)用。

17、本發(fā)明提供了測(cè)序反應(yīng)試劑，包括所述的穩(wěn)定劑組合物，以及可接受的輔料或助劑。

18、本發(fā)明提供了測(cè)序試劑盒，包括所述的穩(wěn)定劑組合物及其他試劑，所述其他試劑包括測(cè)序緩沖液、dntps、dna納米球、測(cè)序引物、探針和測(cè)序酶中的至少一種。

19、在一些實(shí)施例中，所述dntps連接熒光基團(tuán)和/或阻斷基團(tuán)。

20、在一些實(shí)施例中，，所述測(cè)序酶包括dnb聚合酶和/或dna聚合酶。

21、本發(fā)明提供了所述的穩(wěn)定劑組合物、所述的測(cè)序反應(yīng)試劑或所述的測(cè)序試劑盒在高通量測(cè)序中的應(yīng)用。

22、本發(fā)明還提供了高通量測(cè)序方法，包括取待測(cè)樣本，與如下任意項(xiàng)混合，測(cè)序；

23、(i)、吡咯烷二硫代氨基甲酸銨和/或n,n'-二甲基硫脲；和/或

24、(ii)、如權(quán)利要求2～4任一項(xiàng)所述的穩(wěn)定劑組合物；和/或

25、(iii)、如權(quán)利要求6所述的測(cè)序反應(yīng)試劑；和/或

26、(iv)、如權(quán)利要求7～9任一項(xiàng)所述的測(cè)序試劑盒中的試劑。

27、進(jìn)一步的，所述測(cè)序還包括加熱的步驟。

28、在一些實(shí)施例中，所述高通量測(cè)序方法包括取待測(cè)樣本，

29、(a)、添加吡咯烷二硫代氨基甲酸銨并加熱；和/或

30、(b)、添加n,n'-二甲基硫脲并加熱；和/或

31、(c)、添加如權(quán)利要求2～4任一項(xiàng)所述的穩(wěn)定劑組合物、如權(quán)利要求6所述的測(cè)序反應(yīng)試劑或如權(quán)利要求7～9任一項(xiàng)所述的測(cè)序試劑盒中的試劑，不加熱；和/或

32、(d)、添加如權(quán)利要求2～4任一項(xiàng)所述的穩(wěn)定劑組合物、如權(quán)利要求6所述的測(cè)序反應(yīng)試劑或如權(quán)利要求7～9任一項(xiàng)所述的測(cè)序試劑盒中的試劑，并加熱。

33、實(shí)驗(yàn)表明，在加熱的情況下，分別單獨(dú)添加apdtc和dmtu，可以同時(shí)降低lag和runon；同時(shí)添加apdtc和dmtu的新型反應(yīng)試劑，在加熱與不加熱的情況下，均能降低lag與runon，且在試劑加熱的情況下效果比單獨(dú)添加apdtc或者單獨(dú)添加dmtu好。

34、優(yōu)選的，所述加熱的溫度包括60℃，所述加熱的時(shí)間包括3h。

35、本發(fā)明提供了包括吡咯烷二硫代氨基甲酸銨和n,n'-二甲基硫脲在測(cè)序中的應(yīng)用，同時(shí)提供了包括吡咯烷二硫代氨基甲酸銨和n,n'-二甲基硫脲的穩(wěn)定劑組合物，以及所述穩(wěn)定劑組合物在制備測(cè)序反應(yīng)試劑或試劑盒以及在高通量測(cè)序反應(yīng)中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的穩(wěn)定劑組合物能夠在高溫環(huán)境中，增強(qiáng)測(cè)序反應(yīng)試劑的穩(wěn)定性，延長試劑保質(zhì)期；同時(shí)可以增強(qiáng)dipseq技術(shù)中測(cè)序反應(yīng)試劑中的dnb聚合酶以及帶特殊標(biāo)記的dntps在高溫環(huán)境中的穩(wěn)定性,有效提高聚合效率，降低測(cè)序反應(yīng)過程中產(chǎn)生的lag，達(dá)到顯著提高測(cè)序質(zhì)量的目的，從而在保證高測(cè)序質(zhì)量的前提下進(jìn)一步提高測(cè)序讀長，擴(kuò)大高通量通用測(cè)序試劑的應(yīng)用范圍。實(shí)驗(yàn)表明，在加熱的情況下，分別單獨(dú)添加1mm?apdtc和1mm?dmtu，可以同時(shí)降低lag和runon?0.01-0.02％；同時(shí)添加1mm?apdtc和1mm?dmtu的新型反應(yīng)試劑，在加熱情況下，lag降低0.03％，runon降低0.04％左右，且效果比單獨(dú)添加apdtc或者單獨(dú)添加dmtu好，在試劑不加熱情況下同時(shí)添加apdtc和dmtu也可以降低lag和runon?0.01％。