本發(fā)明涉及麥角硫因生物合成，具體而言，涉及一種核酸分子、麥角硫因合成酶以及合成麥角硫因的方法。

背景技術(shù)：

1、麥角硫因(l-ergothioneine，egt)是一種稀有的天然手性氨基酸，具有較好的穩(wěn)定性和溶解度。在細(xì)胞中，麥角硫因可參與清除自由基、抗炎癥、抗紫外照射、誘導(dǎo)神經(jīng)元分化等功能，在臨床上具有吸收性好、半衰期長，安全性好等特點(diǎn)，其在化妝品、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，世界多國正在步入老齡化社會，聯(lián)合國提出的“健康老齡化十年”計劃中，“提供老年人需求的初級保健服務(wù)”成為重點(diǎn)之一?？顾ダ系木薮笫袌鲂枨螅沟镁哂辛己蒙锘钚缘柠溄橇蛞虺蔀檠芯亢蛻?yīng)用開發(fā)的熱點(diǎn)[1-3]。

2、麥角硫因的生物來源與合成技術(shù)進(jìn)展如下：麥角硫因主要來源于真菌，其可以保護(hù)真菌的分生孢子免受過氧化物侵害。而人類自身無法合成麥角硫因，必需通過外界攝入后，經(jīng)由腸道轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白o(hù)ctn1進(jìn)入人體。目前化學(xué)合成麥角硫因仍具有較多挑戰(zhàn)，例如α位碳的酸性易使反應(yīng)發(fā)生外消旋作用，這使得化學(xué)合成的產(chǎn)品售價偏高，部分限制了麥角硫因的應(yīng)用。目前更為主流的生物提取法主要原料是食用菌的子實體、麥角、動物組織等，但這些原料的整體含量仍然很低，且雜質(zhì)較多，并存在藥物殘留、提取成本高、原料生長周期長等問題，對于產(chǎn)業(yè)化具有較大的局限性。故使用基因編輯技術(shù)和深層發(fā)酵工藝更為成熟的微生物異源宿主和酶活更高的麥角硫因生物合成元件是目前麥角硫因生物合成的趨勢[4-6]。

3、egt的生物合成途徑最早在恥垢分枝桿菌(mycobacterium?smegmatis)中被鑒定。egt的生物合成包含5個步驟：histidine(組氨酸)經(jīng)egtd(sam依賴型組氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶)催化形成hercynine，cysteine(半胱氨酸)經(jīng)egta(γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶)γ-glu-cys，hercynine和γ-glu-cys依次經(jīng)由egtb(單核非血紅素鐵酶)、egtc(酰胺轉(zhuǎn)移酶)、egte(plp結(jié)合型c–s裂解酶)最終形成ergothioneine(egt)。后有研究在粗糙脈孢菌(neurosporacrassa)中發(fā)現(xiàn)了更為簡潔的真核生物合成途徑，只需egt1與egt2兩個生物合成基因。其中ncegt1基因是一個多結(jié)構(gòu)域蛋白，同時具有egtd的sam依賴甲基轉(zhuǎn)移酶和egtb(單核非血紅素鐵酶)的功能，可催化histidine轉(zhuǎn)化為hercynine后進(jìn)一步催化其與cysteine合成γ-cys-her。ncegt2基因則編碼plp結(jié)合型c–s裂解酶，可直接催化cys-her轉(zhuǎn)化為麥角硫因。經(jīng)過比對發(fā)現(xiàn)，egt1和egt2基因在多種子囊菌中具有同源基因，如麥角菌和粟酒裂殖酵母，但在擔(dān)子菌中鑒定的egt基因卻相對較少。目前已鑒定的egt真核合成基因有5組，來源于schizosaccharomyces?pombe的spegt1和spegt2；來源于neurospora?crassa的ncegt1和ncegt2；來源于claviceps?africana的cpegt1和cpegt2；來源于flammulina?velutipes的fvegt1，fvegt2，fvegt3；來源于trichoderma?reesei的tregt1和tregt2[7-10]。

4、目前，已報道的麥角硫因合成基因多為子囊菌來源，相比起自然界含量更為豐富的擔(dān)子菌卻鮮少報道，尤其是一些公開基因組測序的食用菌中尚未有文獻(xiàn)報道。

5、鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種核酸分子、麥角硫因合成酶以及合成麥角硫因的方法，以實現(xiàn)麥角硫因的異源工業(yè)化合成。

2、本發(fā)明中“egt基因”，等同于麥角硫因合成編碼基因。

3、本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：

4、第一方面，本發(fā)明提供了一種麥角硫因合成酶，其具有如seq?id?no.14-26任一項所示的氨基酸序列。

5、為了提供更多樣化的麥角硫因合成編碼基因，并解決麥角硫因工業(yè)化生產(chǎn)面臨的局限性，發(fā)明人從多種食用菌(蘑菇n1、蘑菇n2、蘑菇n3、蘑菇n4、蘑菇n5、蘑菇n6、蘑菇n7、蘑菇n8)中獲得了13個與麥角硫因合成相關(guān)的酶及相關(guān)編碼基因。將這13個麥角硫因合成相關(guān)酶的編碼基因分別與啟動子相連，并與已鑒定的egt元件基因進(jìn)行組合共表達(dá)，通過基因編輯將共表達(dá)的載體整合至宿主細(xì)胞或菌株中，在宿主細(xì)胞或菌株中實現(xiàn)13個egt基因的異源表達(dá)，且都能表達(dá)麥角硫因合成酶，并篩選獲得了不同麥角硫因產(chǎn)量的細(xì)胞或菌株。尤其是如seq?id?no.5所示的核酸分子與cpegt2基因共表達(dá)后，與對照菌株相比，顯著提升了麥角硫因的產(chǎn)量。如seq?id?no.10所示的核酸分子與ncegt1基因共表達(dá)后，大幅提升了麥角硫因的產(chǎn)量。

6、因此，這13個麥角硫因合成酶的開發(fā)不僅拓展了egt合成元件的多樣性，并且獲得了egt高效合成的新元件，有助于進(jìn)一步開發(fā)更高產(chǎn)量的麥角硫因生物合成細(xì)胞或菌株。

7、第二方面，本發(fā)明提供了一種編碼麥角硫因合成酶的核酸分子，其編碼上述的麥角硫因合成酶。

8、術(shù)語“編碼麥角硫因合成酶的核酸分子”可以是包括編碼本發(fā)明突變蛋白的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。

9、本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或突變蛋白的片段、類似物和衍生物。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的突變蛋白的功能。

10、目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的dna序列。然后可將該dna序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的dna分子(或如載體)和細(xì)胞中。

11、應(yīng)用pcr技術(shù)擴(kuò)增dna/rna的方法被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的多核苷酸。特別是很難從文庫中得到全長的cdna時，可優(yōu)選使用race法(race-cdna末端快速擴(kuò)增法)，用于pcr的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的dna/rna片段。

12、在一種可選的實施方式中，上述核酸分子包括第一核酸分子，第一核酸分子的核苷酸序列如seq?id?no.1-13任一項所示。

13、13個egt基因的開發(fā)不僅拓展了egt合成元件的多樣性，并且獲得了egt高效合成的新元件，有助于進(jìn)一步開發(fā)更高產(chǎn)量的麥角硫因生物合成細(xì)胞或菌株。

14、第三方面，本發(fā)明提供了一種編碼麥角硫因合成酶的核酸分子，核酸分子包括第一核酸分子和第二核酸分子，第一核酸分子的核苷酸序列如seq?id?no.1-13任一項所示，第二核酸分子選自如下任意一個egt基因簇中的任意一種egt真核合成基因：spegt1和spegt2、ncegt1和ncegt2、cpegt1和cpegt2、fvegt1和fvegt2、以及tregt1和tregt2。選擇上述egt基因簇中的任意一種egt真核合成基因與第一核酸分子進(jìn)行組合，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。如第二核酸分子選自spegt1、fvegt1或tregt2。

15、在一種可選的實施方式中，第二核酸分子選自如下任意一個egt基因簇中的任意一種egt真核合成基因：ncegt1和ncegt2、以及cpegt1和cpegt2。

16、在一種可選的實施方式中，核酸分子包括：如seq?id?no.1-7任一項所示的第一核酸分子，cpegt2或ncegt2；

17、或者核酸分子包括如seq?id?no.8-13任一項所示的第一核酸分子，ncegt1或cpegt1。

18、seq?id?no.1-7所示的第一核酸分子是發(fā)明人將麥角菌來源的麥角硫因合成酶cpegt2(genbank:cce33140.1)與多種食用菌的基因組進(jìn)行同源性搜索，獲得與cpegt2相似的蛋白質(zhì)序列，經(jīng)過對蛋白質(zhì)序列進(jìn)行里氏木霉的密碼子優(yōu)化，即為seq?id?no.1-7所示的第一核酸分子。

19、seq?id?no.8-13所示的第一核酸分子是發(fā)明人將粗糙脈孢菌麥角硫因合成酶ncegt1(ncbi?accession?xp_956324.3)與多種食用菌的基因組進(jìn)行同源性搜索，獲得與ncegt1相似的蛋白質(zhì)序列，經(jīng)過對蛋白質(zhì)序列進(jìn)行里氏木霉的密碼子優(yōu)化，即為seq?idno.8-13所示的第一核酸分子。

20、在一種可選的實施方式中，核酸分子包括：如seq?id?no.5所示的核酸分子和cpegt2；或者如seq?id?no.10所示的核酸分子和ncegt1。

21、如seq?id?no.5所示的核酸分子和cpegt2組合后，整合至宿主細(xì)胞可以將麥角硫因的產(chǎn)量提升21.7％，如seq?id?no.10所示的核酸分子和ncegt1組合后，整合至宿主細(xì)胞可以將麥角硫因的產(chǎn)量提升43.5％。因此，本發(fā)明提供的核酸分子具有工業(yè)化高效合成麥角硫因的應(yīng)用前景。

22、第四方面，本發(fā)明還提供了一種表達(dá)盒，其包括上述的核酸分子。

23、在其他實施方式中，上述表達(dá)盒還包括啟動子和終止子。

24、在本發(fā)明應(yīng)用較佳的實施方式中，表達(dá)盒包括：如seq?id?no.1-7任一項所示的第一核酸分子和如下任意一種egt真核合成基因：cpegt2和ncegt2；

25、或者表達(dá)盒包括：如seq?id?no.8-13任一項所示的核酸分子和如下任意一種egt真核合成基因：ncegt1和cpegt1；

26、在一種可選的實施方式中，表達(dá)盒包括：如seq?id?no.1-7任一項所示的核酸分子和cpegt2；或者如seq?id?no.8-13任一項所示的核酸分子和ncegt1；

27、在一種可選的實施方式中，表達(dá)盒包括：如seq?id?no.5所示的核酸分子和cpegt2；或者如seq?id?no.10所示的核酸分子和ncegt1。

28、第五方面，本發(fā)明還提供了一種載體，其包括上述的核酸分子或上述的表達(dá)盒。載體包括不限于表達(dá)載體、穿梭載體和整合載體。

29、本發(fā)明中，術(shù)語“表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。

30、在一種可選的實施方式中，表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。

31、此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(gfp)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。

32、包含上述的適當(dāng)dna序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。

33、第六方面，本發(fā)明還提供了一種細(xì)胞或菌株，其包括上述的核酸分子、上述的表達(dá)盒或載體。

34、宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母、植物細(xì)胞(如人參細(xì)胞)。

35、在本發(fā)明應(yīng)用較佳的實施方式中，菌株選自農(nóng)桿菌、大腸桿菌或里氏木霉；此外，上述細(xì)胞或菌株可以任選自其他的底盤細(xì)胞或菌株。

36、在一種可選的實施方式中，里氏木霉為糖解阻遏效應(yīng)的里氏木霉；糖解阻遏效應(yīng)的里氏木霉是通過紫外、化學(xué)誘變、紫外三輪篩選得到的解糖阻遏效應(yīng)的里氏木霉。化學(xué)誘變采用的誘變劑選自n硝基胍。

37、在一種可選的實施方式中，糖解阻遏效應(yīng)的里氏木霉包括不限于mc3菌株或rutc30菌株。

38、與野生型里氏木霉相比，當(dāng)起始細(xì)胞或菌株選自上述兩種中的任意一種類型時，可以明顯提高外源麥角硫因的產(chǎn)量。rutc30屬于市售菌株，購買于american?type?culturecollection(atcc,manassas,va,usa)，編號56765；mc3是實驗室篩選得到的。

39、里氏木霉是一種美國fda認(rèn)證的食品級安全菌株，該菌株作為生產(chǎn)菌株不會產(chǎn)生類似大腸桿菌生成的內(nèi)毒素；相比于釀酒酵母發(fā)酵，里氏木霉的發(fā)酵過程不會大量產(chǎn)熱，降低降溫設(shè)備投入成本；相比于大型真菌，里氏木霉發(fā)酵周期較短，且作為一種纖維素酶酶系發(fā)達(dá)的模式菌株，該菌可以直接利用纖維素，使得將麩皮、玉米芯等轉(zhuǎn)化合成麥角硫因成為可能。

40、第七方面，本發(fā)明還提供了一種核酸分子、麥角硫因合成酶、表達(dá)盒、載體或細(xì)胞或菌株在合成麥角硫因的應(yīng)用。

41、在一種可選的實施方式中，應(yīng)用包括：采用基因編輯的方法將核酸分子、表達(dá)盒或載體整合入細(xì)胞或菌株中，培養(yǎng)異源插入有目標(biāo)基因的細(xì)胞或菌株。

42、基因編輯技術(shù)例如選自crispr/cas9技術(shù)、鋅指核酸內(nèi)切酶(zfn，zinc-fingernucleases)技術(shù)或類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(talen，transcriptionactivator-likeeffector?nucleases)技術(shù)。

43、將核酸分子、表達(dá)盒或載體整合至里氏木霉的cbh1位點(diǎn)。cbh1基因編碼的是里氏木霉中表達(dá)量最高的纖維二糖水解酶，其產(chǎn)量可達(dá)里氏木霉胞外分泌蛋白總量的50％。所以發(fā)明人選擇將核酸分子、表達(dá)盒或載體插入該位點(diǎn)，首先可以去除該基因的蛋白分泌負(fù)擔(dān)，同時使用cbh1啟動子可以高表達(dá)本發(fā)明的目的基因。

44、第八方面，本發(fā)明還提供了一種合成麥角硫因的方法，其包括：

45、培養(yǎng)上述的細(xì)胞或菌株；

46、在一種可選的實施方式中，培養(yǎng)溫度為28℃±1℃，在sdb培養(yǎng)基中以200±20rpm的條件培養(yǎng)30-40h，然后進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

47、本發(fā)明具有以下有益效果：

48、本發(fā)明開發(fā)了13個egt基因，不僅拓展了egt合成元件的多樣性，并且獲得了egt高效合成的新元件，有助于進(jìn)一步開發(fā)更高產(chǎn)量的麥角硫因生物合成細(xì)胞或菌株。

49、發(fā)明人將13個麥角硫因合成相關(guān)酶的編碼基因分別與啟動子相連，并與已鑒定的egt元件基因進(jìn)行組合共表達(dá)，通過基因編輯將共表達(dá)的載體整合至宿主細(xì)胞或菌株中，在宿主細(xì)胞或菌株中實現(xiàn)13個egt基因的異源表達(dá)，且都能表達(dá)麥角硫因合成酶，具有良好的催化活性。在上述基礎(chǔ)上，發(fā)明人進(jìn)一步篩選獲得了不同麥角硫因產(chǎn)量的細(xì)胞或菌株。尤其是如seq?id?no.5所示的核酸分子與cpegt2基因共表達(dá)后，與對照菌株相比，顯著提升了麥角硫因的產(chǎn)量。如seq?id?no.10所示的核酸分子與ncegt1基因共表達(dá)后，也大幅提升了麥角硫因的產(chǎn)量。其催化活性超出目前已經(jīng)鑒定的egt元件組合產(chǎn)量1.0g/l。