本發(fā)明涉及通過使用從特定細胞微隔室獲得的肝臟微組織治療肝衰竭。本發(fā)明特別涉及一種特定肝臟微組織，該特定肝臟微組織包含肝臟細胞的至少3種不同表型，該肝臟細胞從封裝在單個三維封閉微隔室中的誘導多能干細胞獲得。

背景技術(shù)：

0、現(xiàn)有技術(shù)

1、肝臟是人體最復雜的器官之一。作為消化系統(tǒng)不可或缺的一部分，不斷地向肝臟供給由消化產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)或有毒物質(zhì)。肝臟對這些物質(zhì)的加工是生物體所必需的并且具有以下目的：

2、-儲存和分配由消化產(chǎn)生的營養(yǎng)物

3、-降解有毒物質(zhì)

4、-合成大多數(shù)血蛋白，以及

5、-膽汁的產(chǎn)生。

6、為了執(zhí)行這些功能，肝臟由多種細胞組成，諸如肝細胞、膽管細胞(膽管細胞)、星狀細胞(ito細胞)、庫普弗細胞(kupffer?cell)、間充質(zhì)干細胞和內(nèi)皮細胞。

7、肝細胞是最具代表性的肝臟細胞，并且負責大部分肝功能，從脂肪酸合成到尿素生產(chǎn)到血漿蛋白合成。

8、膽管細胞是形成膽管壁的極化上皮細胞。它們在調(diào)節(jié)膽汁分泌和收集膽汁以將其從肝細胞轉(zhuǎn)運至腸道方面具有作用。

9、其他細胞提供良好的血管形成以及信號傳導功能并提供與其他肝臟細胞和與免疫系統(tǒng)細胞的相互作用。

10、當肝臟不能再執(zhí)行其功能時，將其稱為肝衰竭。肝衰竭的主要原因是病毒感染、藥物過量、免疫性病癥、遺傳性疾病或血液循環(huán)病癥。當肝功能的損傷不可逆時，推薦的治療是肝臟移植。

11、因此，肝臟移植代表對患有晚期肝臟疾病的人的標準治療。

12、如今，在發(fā)現(xiàn)可以供給足夠質(zhì)量的肝臟用于移植的器官供體方面存在很大困難。

13、與任何器官移植一樣，肝臟移植僅可在肝臟質(zhì)量良好的情況下進行以避免與移植相關(guān)的風險，諸如感染、癌癥、長期免疫抑制和重大手術(shù)。

14、如今，只有2/3的患者可以從移植獲益，并且只有在他們的生活質(zhì)量已經(jīng)極大惡化時受益。另外，在美國肝臟移植的預期費用為約1百萬歐元(或1百萬美元)。

15、面對這些問題，已經(jīng)出現(xiàn)若干創(chuàng)新解決方案。

16、移植分離的肝細胞已經(jīng)作為一種有吸引力的方法出現(xiàn)，但是臨床試驗仍然很少并且不確定，受到體內(nèi)移植后分離的肝細胞的不良存活、整合和擴增的限制，因此這些因素限制了短期和長期治療效果。事實上，從供體分離的肝細胞具有非常有限的體內(nèi)和體外增殖能力。此外，進行培養(yǎng)的分離的肝細胞傾向于進入去分化過程，從而減少了獲得足夠數(shù)量的成熟肝細胞的機會。

17、盡管該技術(shù)使得可以治療大量的患者，但施用的劑量常常不夠，并且在注射細胞期間呈現(xiàn)出逃逸到體循環(huán)中的風險。

18、這主要是由于單個細胞難以整合到肝臟內(nèi)，以及由原代細胞的制備及其體外培養(yǎng)誘導的質(zhì)量差，且盡管有免疫抑制但排斥部分肝細胞。

19、因此，肝細胞供體的低數(shù)目、這些肝細胞的穩(wěn)定性和有限的功能性構(gòu)成它們使用的障礙。

20、然而，用于多能干細胞(即胚胎干細胞和誘導多能干細胞)的指導分化的方案的開發(fā)已經(jīng)使得可以獲得幾乎取之不盡的肝細胞來源。

21、盡管有希望，但是源自多能細胞的肝細胞非常難以大規(guī)模培育并且產(chǎn)生不成比例的生產(chǎn)成本。例如，從誘導多能干細胞產(chǎn)生自體肝移植物的預期成本是大約970萬美元。

22、迄今為止，指導分化方案不能產(chǎn)生多種功能細胞表型，尤其是足夠的成熟肝細胞；獲得的細胞保留胎兒肝細胞的特征，尤其是具有甲胎蛋白的持續(xù)表達和低白蛋白產(chǎn)量。

23、然而，某些方案使得可以獲得具有更好功能特性的肝臟細胞。這些方案仍然復雜并且需要解離、再聚集或與尤其是間充質(zhì)干細胞和內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)的步驟。這些附加步驟增加附加風險，增加了總成本并且降低了成品的控制。

24、對于在細胞療法中的應(yīng)用，必須能夠適應(yīng)現(xiàn)有方法以便：i)為了在大規(guī)模上有效，用有限數(shù)目的步驟獲得產(chǎn)生，ii)改善移植細胞的整合。如今開發(fā)的技術(shù)不能產(chǎn)生從誘導多能干細胞獲得的適于大規(guī)模培養(yǎng)且呈遞功能性肝細胞的肝臟微組織。

25、目前用于產(chǎn)生肝臟微組織的方法仍然太復雜，具有多個步驟，因此成本非常高，并且難以擴大規(guī)模。

26、因此，非常需要一種允許大規(guī)模生產(chǎn)包含肝臟細胞的幾種表型的肝臟微組織的解決方案，所述肝臟微組織可以大規(guī)模生產(chǎn)并可直接移植，以滿足肝臟移植物的基本需要。

27、因此，本發(fā)明的目標是滿足所有這些需要并克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點和限制。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了實現(xiàn)該目的，本發(fā)明提出了一種特定肝臟微組織，該特定肝臟微組織適于在細胞療法且尤其是在對抗肝衰竭中使用。

2、為此，本發(fā)明涉及一種三維肝臟微組織，該三維肝臟微組織包含肝臟細胞的至少3種不同表型，該微組織的所述細胞已經(jīng)全部從封裝在單個三維封閉微隔室中的誘導多能干細胞獲得。

3、有利地，該肝臟微組織具有足夠的細胞多樣性以持續(xù)地恢復和/或改善肝臟功能。

4、優(yōu)選地，該肝臟微組織至少包含未成熟肝細胞、成熟肝細胞和膽管細胞。

5、根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選目的，該肝臟微組織至少包含：

6、-肝臟細胞，其中至少40％的肝臟細胞是表達細胞角蛋白19(ck19)的細胞，和

7、-表達cd73和cd90的細胞。

8、優(yōu)選地，表達cd73和cd90的細胞是間充質(zhì)干細胞，并且表達ck19的細胞是膽管細胞。

9、有利地，該肝臟微組織的表型組成接近于健康人肝臟的表型組成。

10、優(yōu)先地，根據(jù)本發(fā)明的肝臟微組織包含：

11、-至少一個內(nèi)腔，

12、-與內(nèi)腔和該微組織外部的介質(zhì)接觸的該微組織的至少一個細胞，和

13、-至少一個僅被細胞包圍的細胞。

14、有利地，該肝臟微組織的構(gòu)造接近于發(fā)育中的肝臟組織的構(gòu)造，這使得肝臟微組織尤其能夠促進其整合到肝臟中及在所治肝臟中代謝功能的適當表現(xiàn)。

15、根據(jù)特別優(yōu)選的實施方案，該肝臟微組織為卵形、圓柱形、球狀體或球形或基本上卵形、圓柱形、球狀體或球形或橢圓形形狀。優(yōu)選地，該肝臟微組織為橢圓形形狀。

16、有利地，該微組織的橢圓形形狀使得可以促進該肝臟微組織的存活。因此，大部分肝臟微組織被所治肝臟整合。

17、優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的肝臟微組織包含至少一個膽管和/或至少一種糖原顆粒。

18、根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選目的，該肝臟微組織包含：

19、-50％至99％的肝臟細胞，其中20％至60％的肝臟細胞是表達細胞角蛋白19的細胞，和

20、-1％至20％的表達cd73和cd90的細胞。

21、根據(jù)一種變體，肝臟微組織是三維肝臟微組織，該三維肝臟微組織的最大尺寸為500μm至700μm，和/或以每百萬細胞至少75,000rlu的活性表達cyp3a4單加氧酶和/或每24小時每百萬細胞產(chǎn)生至少18μg尿素。

22、有利地，與尿素產(chǎn)生相關(guān)的cyp3a4的活性使得可以保證肝臟微組織至少包含功能性肝臟細胞。

23、優(yōu)選地，這些肝臟細胞每24小時每百萬細胞分泌至少75μg白蛋白。

24、有利地，肝臟微組織表現(xiàn)出類似于健康肝臟的代謝活性。

25、本發(fā)明的一個目的還是介質(zhì)中的一組幾個三維肝臟微組織，其中至少一個肝臟微組織是根據(jù)本發(fā)明的肝臟微組織。優(yōu)選地，該組肝臟微組織中至少50％(以數(shù)目計)的肝臟微組織是根據(jù)本發(fā)明的肝臟微組織。

26、根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及一種三維封閉細胞微隔室，該三維封閉細胞微隔室包含限定內(nèi)部部分的外部水凝膠層，所述內(nèi)部部分包含至少一個根據(jù)本發(fā)明的肝臟微組織。

27、根據(jù)本發(fā)明的微隔室使得可以保證微環(huán)境適于多能干細胞的培養(yǎng)和適于它們分化成構(gòu)成根據(jù)本發(fā)明的微組織的細胞。實際上，此類微隔室使得可以復現(xiàn)肝臟器官發(fā)生期間細胞微環(huán)境的體內(nèi)條件。

28、本發(fā)明還涉及一組根據(jù)本發(fā)明的細胞微隔室。

29、根據(jù)另一個方面，本發(fā)明涉及一種用于制備微隔室或一組微隔室的方法，該方法至少包括實施以下步驟：產(chǎn)生包含誘導多能干細胞的微隔室，在該微隔室內(nèi)誘導細胞分化以獲得肝臟細胞的至少3種不同表型。

30、最后，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的肝臟微組織或含有該肝臟微組織的微隔室，或一組根據(jù)本發(fā)明的肝臟微組織或含有肝臟微組織的一組微隔室，這些作為藥物，優(yōu)選在預防或治療由以下疾病引起的肝衰竭中使用，這些疾病諸如肝纖維化和肝硬化、脂肪變性、非酒精性脂肪變性、肝炎、肝臟代謝疾病、與因子viii、α1抗胰蛋白酶、ix和/或vwf分泌相關(guān)的疾病、威爾遜氏病(wilson's?disease)和遺傳性血色素沉著癥。

31、其他特征和優(yōu)點將從具體實施方式和以下實施例中顯現(xiàn)出來。