本發(fā)明涉及基因工程、基因治療、細(xì)胞治療領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ipsc)重編程技術(shù)，一條重要途徑是通過轉(zhuǎn)錄因子(如oct4、sox2、klf4和myc,以下簡稱4因子)，使已分化的細(xì)胞誘導(dǎo)生成多能干細(xì)胞，整個(gè)過程即完全重編程，其中可以分為啟始階段、成熟階段、穩(wěn)定階段(koji?et?al,2013,nelly?et?al.,2019)。在重編程過程中，細(xì)胞經(jīng)歷劇烈的轉(zhuǎn)錄水平和表觀遺傳修飾上的改變，使細(xì)胞身份、狀態(tài)發(fā)生巨大改變。在啟始階段，早期多能性相關(guān)基因如tra-1-60、nanog、ssea4、sall4等快速上升表達(dá)，而體細(xì)胞身份特征基因表達(dá)水平變化不大；在成熟階段，除上述早期多能性相關(guān)基因外，也會(huì)高表達(dá)dppa5、lin28等成熟期特異的多能性相關(guān)基因，而在啟始階段表達(dá)水平變化不大的體細(xì)胞身份特征基因則快速下降(koji?et?al,2013,nelly?et?al.,2019)，暗示這個(gè)階段細(xì)胞已難以維持原本體細(xì)胞的身份特征；在穩(wěn)定階段，細(xì)胞已經(jīng)完全建立多能性基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，變成了ipsc，除表達(dá)上述多能性相關(guān)基因外，也高表達(dá)oct4、sox2、klf4等經(jīng)典核心多能性轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)體細(xì)胞身份特征基因基本不表達(dá)。另外，這一過程還可以使細(xì)胞年輕化，年輕化可通過特定基因轉(zhuǎn)錄水平變化、細(xì)胞衰老標(biāo)志物，特別是基于dna甲基化的表觀遺傳年齡(epigenetic?age,epiage)來檢測(nelly?et?al.,2019,antoine,et?al,2022,diljeet?et?al.,2022)。

2、部分重編程就是上述完全重編程進(jìn)行到中途時(shí)停止，由于細(xì)胞年輕化在重編程的早期就發(fā)生，而體細(xì)胞身份特征的丟失在重編程的中后期才發(fā)生，因此這里存在一個(gè)時(shí)間窗口，使得細(xì)胞年輕化的同時(shí)又能保持細(xì)胞原本的身份特征，這是部分重編程使細(xì)胞年輕化的技術(shù)原理(ocampo?et?al.2016)。目前報(bào)道的利用轉(zhuǎn)錄因子逆轉(zhuǎn)年齡的方法主要如下：1.體外誘導(dǎo)時(shí)間限制的部分重編程，又稱瞬時(shí)重編程(transient?reprogramming)，如通過誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)限制4因子過表達(dá)時(shí)間，使人成纖維細(xì)胞重編程限制在啟始階段，這樣可以逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的年齡，并維持成纖維細(xì)胞的特征(nelly?et?al.,2019,diljeet?et?al.,2022)；2.體內(nèi)瞬時(shí)脈沖的重編程，如在小鼠體內(nèi)通過可誘導(dǎo)的體系，瞬時(shí)脈沖過表達(dá)4因子，可以使早衰小鼠的器官變的年輕，也可以使野生型年齡的小鼠各器官一定的年輕化(alejandroet?al.,2016,kristen?et?al,2022)；3.減少轉(zhuǎn)錄因子持續(xù)誘導(dǎo)的部分重編程(以下簡稱3因子重編程)，如在小鼠眼球內(nèi)遞送裝載osk轉(zhuǎn)錄因子序列的aav病毒，可以治療青光眼(luet?al.2020)。以上所述都是目前已有利用過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子逆轉(zhuǎn)年齡的研究，但在避免誘導(dǎo)多能干細(xì)胞生成和有效逆轉(zhuǎn)年齡的實(shí)際應(yīng)用中，仍有很大改進(jìn)空間，如人體內(nèi)不可能通過小分子誘導(dǎo)表達(dá)體系來限制4因子表達(dá)時(shí)間，因此需要通過諸如工程化改造轉(zhuǎn)錄因子等途徑來在源頭上限制生成ipsc的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)不影響細(xì)胞年輕化的效果。

3、相分離指細(xì)胞內(nèi)某些蛋白質(zhì)或者核酸分子可以通過多價(jià)相互作用，在周圍原本均一的環(huán)境中產(chǎn)生物理化學(xué)性質(zhì)不同的另一相，通常呈現(xiàn)液滴狀特征，結(jié)果是形成無膜細(xì)胞器或者細(xì)胞結(jié)構(gòu)，這一現(xiàn)象或結(jié)構(gòu)即液-液相分離(liquid-liquid?phase?separation,llps)，簡稱相分離(clifford,et?al.2009,li,et?al.2012)。相分離描述了尺寸在微米級別的特定結(jié)構(gòu)，它創(chuàng)造了一個(gè)相對獨(dú)立的空間區(qū)域，選擇性地富集分子；與周圍環(huán)境相比，相分離形成的細(xì)胞結(jié)構(gòu)通常有更高的蛋白密度以及減弱的分子微觀運(yùn)動(dòng)，這可以促進(jìn)某些生化反應(yīng)。能形成相分離的蛋白結(jié)構(gòu)特征仍在研究中。

4、本發(fā)明利用工程化改造的去掉相分離能力的轉(zhuǎn)錄因子(以下簡稱無相分離轉(zhuǎn)錄因子)，參與多因子部分重編程。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)無相分離轉(zhuǎn)錄因子使得部分重編程滯留在啟始階段，使細(xì)胞年輕化的同時(shí)維持細(xì)胞身份特征，因此發(fā)明人將此稱為啟始階段重編程技術(shù)。該技術(shù)在提高細(xì)胞年輕化效率的同時(shí)極大降低ipsc生成風(fēng)險(xiǎn)，更有希望應(yīng)用于臨床。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、一般術(shù)語定義

2、在權(quán)利要求和/或說明書中，當(dāng)與術(shù)語“包含”聯(lián)用時(shí)，詞語“一(a)”或“一(an)”可以指“一個(gè)”，但也可以指“一個(gè)或多個(gè)”、“至少一個(gè)”以及“一個(gè)或多于一個(gè)”。

3、在該公開內(nèi)容中，“包含”、“包括”、“含有”、“具有”等具有中國、美國、歐洲等國專利法中賦予它們的含義，且可指“囊括”、“涵蓋”等，“基本由......組成”、“基本組成為”等具有中國、美國、歐洲等國專利法中賦予它們的含義，該術(shù)語為開放式的，允許多于所引用的事項(xiàng)的存在，只要所引用的事項(xiàng)的基本或新穎特征不因多于所引用的事項(xiàng)的存在而改變，但排除現(xiàn)有技術(shù)的實(shí)施方案。

4、在整個(gè)申請文件中，術(shù)語“約”表示：一個(gè)值包括測定該值所使用的裝置或方法的誤差的標(biāo)準(zhǔn)偏差，表示在列舉范圍內(nèi)可合理預(yù)期的可替換的特征，特別是指給定的數(shù)量，例如意味著包括正負(fù)百分之五的偏差。

5、雖然所公開的內(nèi)容支持術(shù)語“或”的定義僅為替代物以及“和/或”，但除非明確表示僅為替代物或替代物之間相互排斥外，權(quán)利要求中的術(shù)語“或”是指“和/或”。

6、在本文中，術(shù)語“任選地”、“任選的”或“任選”通常是指隨后所述的事件或狀況可以但未必發(fā)生，并且該描述包括其中發(fā)生該事件或狀況的情況，以及其中未發(fā)生該事件或狀況的情況。

7、本發(fā)明所述的術(shù)語“同一性”“同源性”是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際工作需要對序列進(jìn)行調(diào)整，使使用序列與現(xiàn)有技術(shù)獲得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的相似度，且依然具有與原氨基酸序列或核苷酸序列相同的功能。

8、關(guān)于肽或多肽使用的術(shù)語“變體”是指氨基酸序列因氨基酸的插入、缺失或保守取代而不同但保留至少一種生物學(xué)活性的肽或多肽。變體還可以指具有與參考蛋白質(zhì)基本相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，參考蛋白質(zhì)具有保留至少一種生物學(xué)活性的氨基酸序列。氨基酸的保守取代，即用具有相似性質(zhì)(例如，親水性、帶電區(qū)域的程度和分布)的不同氨基酸替換氨基酸，在本領(lǐng)域中被認(rèn)為通常涉及微小變化。如本領(lǐng)域所理解的，這些微小變化可以部分地通過考慮氨基酸的親水指數(shù)來識別。(kyte等人，1982年，j.mol.生物學(xué).157:105-132)。氨基酸的親水指數(shù)是基于其疏水性和電荷的考慮。本領(lǐng)域已知類似親水指數(shù)的氨基酸可以被取代并仍然保留蛋白質(zhì)功能。一方面，氨基酸具有±2的親水指數(shù)的被替代。氨基酸的親水性也可用于揭示導(dǎo)致蛋白質(zhì)保留生物學(xué)功能的取代。在肽的上下文中考慮氨基酸的親水性允許計(jì)算該肽的最大局部平均親水性，這是一種有用的測量，據(jù)報(bào)道與抗原性和免疫原性密切相關(guān)。美國專利號4,554,101，通過引用全部并入本文。取代具有相似親水性值的氨基酸可導(dǎo)致保留生物學(xué)活性的肽，例如免疫原性，如本領(lǐng)域所理解的?？捎糜H水性值彼此相差在±2以內(nèi)的氨基酸進(jìn)行取代。氨基酸的疏水指數(shù)和親水值均受該氨基酸特定側(cè)鏈的影響。與該觀察結(jié)果一致，與生物學(xué)功能相容的氨基酸取代被理解為取決于氨基酸的相對相似性，尤其是那些氨基酸的側(cè)鏈，如疏水性、親水性、電荷、大小和其他屬性。

9、如本文所用的關(guān)于核酸的術(shù)語“變體”是指(i)參考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)參考核苷酸序列或其部分的互補(bǔ)序列；(iii)與參考核酸或其互補(bǔ)序列基本相同的核酸；(iv)在嚴(yán)格條件下與參考核酸、其互補(bǔ)序列或與其基本相同的序列雜交的核酸。變體可以是在整個(gè)基因序列或其片段的全長上基本上相同的核酸序列。核酸、蛋白序列可以是66％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％在基因、蛋白序列或其片段的全長上相同。

10、在本文中，術(shù)語“同一性”、“同源性”或“相似性”均用于描述相對于參考序列的氨基酸序列或核酸序列時(shí)，采用通過常規(guī)的方法進(jìn)行確定兩個(gè)氨基酸序列或核酸序列之間的相同氨基酸或核苷酸的百分比，例如參見，ausubel等，編著(1995)，current?protocols?inmolecular?biology，第19章(greene?publishing?and?wiley-interscience，new?york)；和align程序(dayhoff(1978)，atlas?of?protein?sequence?and?structure?5：suppl.3(national?biomedical?research?foundation，washington，d.c.)。關(guān)于比對序列和測定序列同一性有很多算法，包括，needleman等(1970)j.mol.biol.48：443的同源性比對算法；smith等(1981)adv.appl.math.2：482的局部同源性算法；pearson等(1988)proc.natl.acad.sci.85：2444的相似性搜索方法；smith-waterman算法(meth.mol.biol.70：173-187(1997)；和blastp，blastn，和blastx算法(參見altschul等(1990)j.mol.biol.215：403-410)。利用這些算法的計(jì)算機(jī)程序也是可獲得的，并且包括但不限于：align或megalign(dnastar)軟件，或者wu-blast-2(altschul等，meth.enzym.，266：460-480(1996))；或者gap，bestfit，blast?altschul等，上文，fasta，和tfasta，在genetics?computing?group(gcg)包，8版，madison，wisconsin，usa中可獲得；和intelligenetics，mountain?view，california提供的pc/gene程序中的clustal。

11、“雜交”是指于不同的嚴(yán)謹(jǐn)性條件下在互補(bǔ)多核苷酸序列(例如，表1和2中所列的基因)或其部分之間配對形成雙鏈分子。(見，例如wahl，gm.和s.l.berger(1987)methodsenzymol.152：399；kimmel，a.r.(1987)methods?enzymol.152：507)。一般基因工程、細(xì)胞工程專業(yè)術(shù)語定義

12、術(shù)語“細(xì)胞”指天然存在或修飾的完整活細(xì)胞。細(xì)胞可以與其他細(xì)胞分離，與培養(yǎng)物中的其他細(xì)胞混合，或在組織(部分或完整)或生物體中混合。本文描述的方法可以在例如包含單個(gè)細(xì)胞、細(xì)胞群或包含細(xì)胞的組織或器官的樣品上進(jìn)行。

13、如本文所用，術(shù)語“哺乳動(dòng)物細(xì)胞”是指源自哺乳動(dòng)物受試者的適合移植到相同或不同受試者中的任何細(xì)胞。細(xì)胞可以是異種的、自體的或同種異體的。細(xì)胞可以是直接從哺乳動(dòng)物受試者獲得的原代細(xì)胞。細(xì)胞也可以是來源于從受試者獲得的細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞已被遺傳工程化以表達(dá)重組蛋白和/或核酸。

14、載體、重組載體用于承載目標(biāo)基因，本發(fā)明中優(yōu)選慢病毒載體(lentiviralvector,lv)，是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，是rna病毒，可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)。本發(fā)明中優(yōu)選腺相關(guān)病毒載體(adeno-associated?viralvector,aav)，是一種非整合型的dna病毒，由于其具有較高的安全性、較低的免疫原性、較長的體內(nèi)表達(dá)時(shí)間，被廣泛應(yīng)用于基因治療。工程化mrna，包括線性mrna(linear?mrna)和環(huán)狀mrna(circular?mrna)，是一種新型的基因載體，適用于非病毒型的基因遞送系統(tǒng)，可以用于體內(nèi)基因治療。本發(fā)明中優(yōu)選環(huán)狀mrna，比線性mrna具有更低的免疫原性、更高的穩(wěn)定性，適合在體內(nèi)長期表達(dá)治療性蛋白，因此越來越多地被應(yīng)用于基因治療。但只要能夠用于承載的載體都在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

15、宿主細(xì)胞包括分裂細(xì)胞、非分裂細(xì)胞；能有效感染原代細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、t細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等，又如成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、血液細(xì)胞、免疫細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、胚胎細(xì)胞。更具體的，如人皮膚成纖維細(xì)胞，如hff-1、hsf-1、hdf、bj等；如人皮膚角質(zhì)細(xì)胞，如hacat等；如人t細(xì)胞，如jurkat等；如人肺成纖維細(xì)胞，如imr-90等。

16、重編程領(lǐng)域?qū)I(yè)術(shù)語定義

17、術(shù)語“再生細(xì)胞”是指已用一種或多種細(xì)胞重編程因子處理或瞬時(shí)重編程的老化細(xì)胞，使得細(xì)胞具有年輕細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征，同時(shí)仍保留一種或多種細(xì)胞身份標(biāo)記。

18、術(shù)語“干細(xì)胞”是指保留通過有絲分裂細(xì)胞分裂更新自身的能力并且可以分化成多種特化細(xì)胞類型的細(xì)胞。全能干細(xì)胞是由卵子和精子細(xì)胞融合產(chǎn)生的。受精卵最初幾次分裂產(chǎn)生的細(xì)胞也是全能的。這些細(xì)胞可以分化成胚胎和胚胎外細(xì)胞類型。胚胎干細(xì)胞是全能細(xì)胞的后代，具有多能性，可以分化成來自三個(gè)胚層中任何一個(gè)的細(xì)胞類型。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced?pluripotent?stem?cell，ipsc)來源于成體細(xì)胞，這些細(xì)胞被細(xì)胞重編程因子誘導(dǎo)成為胚胎干細(xì)胞樣多能性狀態(tài)。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞可以衍生自成體體細(xì)胞如皮膚或血液細(xì)胞，也具有向三個(gè)胚層中任何一個(gè)細(xì)胞類型分化的潛能。

19、如本文所用，術(shù)語“重編程”是指使用細(xì)胞重編程因子誘導(dǎo)體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為ipsc。重編程過程可以分為啟始階段、成熟階段、穩(wěn)定階段共3個(gè)階段。在啟始階段，細(xì)胞仍然維持原本的體細(xì)胞身份，但早期多能性相關(guān)基因如nanog、sall4等快速上升表達(dá)；在成熟階段，體細(xì)胞身份特征快速丟失，且晚期的多能性相關(guān)基因如dppa5、lin28等表達(dá)上升；在穩(wěn)定階段，細(xì)胞完全丟失細(xì)胞身份，變成ipsc。另外，這一過程還可以使年老的細(xì)胞恢復(fù)活力(即消減所有或一些衰老標(biāo)志)。

20、如本文所用，術(shù)語“細(xì)胞身份丟失”(loss?of?cell?identity)是指體細(xì)胞經(jīng)過重編程，失去了原本體細(xì)胞特異的形態(tài)、功能、表觀遺傳模式、基因表達(dá)譜等特征(即細(xì)胞身份)，獲得了多能干細(xì)胞的各種特征，變成了ipsc。需要特別說明的是，體細(xì)胞的細(xì)胞身份是在重編程過程中逐步失去的，在啟始階段，細(xì)胞仍維持原本的細(xì)胞身份；到了成熟階段，細(xì)胞已經(jīng)失去了大部分細(xì)胞身份特征，獲得了較高程度的多能干細(xì)胞特征，此時(shí)即使中止重編程，細(xì)胞仍有很大風(fēng)險(xiǎn)不能恢復(fù)原本的細(xì)胞身份。

21、術(shù)語“部分重編程”(partial?reprogramming)是指使用一種或多種細(xì)胞重編程因子處理或瞬時(shí)重編程年老的細(xì)胞，使細(xì)胞恢復(fù)一定程度的活力，但又不足以去分化變成ipsc，保留其原本的細(xì)胞身份。“瞬時(shí)重編程”(transient?reprogramming)是部分重編程的一種實(shí)現(xiàn)方式，是指細(xì)胞暴露于細(xì)胞重編程因子的時(shí)間足以使細(xì)胞恢復(fù)活力，但不足以引起去分化為ipsc。由于暴露時(shí)間非常短，這種瞬時(shí)重編程恢復(fù)活力的程度較低。

22、啟始階段重編程(initiation?phase?reprogramming)是指通過工程化改造細(xì)胞重編程因子，使對年老細(xì)胞的重編程滯留于啟始階段，從而有更長的安全時(shí)間窗口恢復(fù)活力，而且極大降低了變成ipsc的風(fēng)險(xiǎn)。其與瞬時(shí)重編程的主要區(qū)別在于對細(xì)胞重編程因子的工程化改造，從而可以在分子層面上人工控制重編程的階段進(jìn)程。

23、術(shù)語“液-液相分離”(liquid-liquid?phase?separation,llps)，簡稱相分離，是指細(xì)胞內(nèi)某些蛋白質(zhì)或者核酸分子可以通過多價(jià)相互作用，在周圍原本均一的液態(tài)環(huán)境中產(chǎn)生物理化學(xué)性質(zhì)不同的另一相，通常呈現(xiàn)為微米級別的液滴(類似水中的油滴)，這些液滴形成了一個(gè)相對獨(dú)立的空間，選擇性地富集某些蛋白質(zhì)分子，使其有更高的蛋白密度以及減弱的分子微觀運(yùn)動(dòng)，可以促進(jìn)某些生化反應(yīng)結(jié)果，例如基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、染色體空間結(jié)構(gòu)的改變等等。蛋白質(zhì)形成相分離的機(jī)制有很多種，其中一類依賴蛋白的內(nèi)部無序區(qū)(intrinsically?disordered?domain,idr)，該結(jié)構(gòu)域中的酸性極性氨基酸帶有負(fù)電荷，可以相互作用形成相分離。另一類依賴賴氨酸的泛素化，通過多泛素化鏈的相互作用，也能形成相分離?！盁o相分離”指通過對形成相分離的ird序列或關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行突變，造成變體蛋白質(zhì)不能形成llps,從而影響(降低)其細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)功能。

24、如本文所用，術(shù)語“細(xì)胞重編程因子”是指一組轉(zhuǎn)錄因子及其組合，其可將成體或分化細(xì)胞轉(zhuǎn)化為多能干細(xì)胞。具體的，重編程因子是來自oct家族、sox家族、klf家族、myc家族、nanog家族、glis家族或lin家族的因子。示例性重編程因子包括oct4、sox2、klf4、c-myc、lin28、nanog和/或glis1。其他示例性重編程因子包括cmyc、dppa2、dppa4、esrrb、gdf3、glis1、klf2、klf4、klf5、lin28、lmyc、nanog、nmyc、nr5a1、nr5a2、oct-4、rcor2、sall1、sall4、sox1、sox2、sox3、tdrd12、tet1、th2a、th2b、utf1、zfp42、mdm2、cyclind1、sv40大t抗原、sirt6、tcl1a和rary。其中“山中因子yamanaka因子”，包括但不限于oct-4、sox4、klf4和c-myc四種轉(zhuǎn)錄因子基因組合(合稱oskm基因)，在某些方面，也可以是oct4、sox-2和klf4基因(osk基因)，在某些方面，也可以是oct4、klf4和c-myc基因(okm基因)，在某些方面，也可以是sox-2、klf4和c-myc基因(kms基因)。

25、oct重編程因子是指轉(zhuǎn)錄因子八聚體家族中任何天然存在的成員，或其保持轉(zhuǎn)錄因子活性的變體，與最接近的相關(guān)因子相比相似(在至少50％、80％或90％的活性范圍內(nèi))天然存在的家族成員,或至少包含天然存在的家族成員的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽，并且可以進(jìn)一步包含轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。示例性的oct多肽包括oct-1、oct-2、oct-3/4、oct-6、oct-7、oct-8、oct-9和oct-11，例如oct3/4(本文稱為“oct4")包含pou結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中,變體與天然存在的oct多肽家族成員相比在其整個(gè)序列中具有至少85％、90％或95％的氨基酸序列同一性。在一些實(shí)施方案中，本文提供的oct4重編程因子蛋白質(zhì)/多肽由優(yōu)化的多核苷酸序列seq?id?no:1編碼。因此，與野生型oct4相比,seq?id?no:1構(gòu)成改變的多核苷酸序列。與氨基酸序列seq?id?no:2相比在一些實(shí)施方案中編碼更穩(wěn)健的oct4重編程因子的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中,oct4重編程因子蛋白質(zhì)/多肽由具有至少約80％、約85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％的多核苷酸或氨基酸序列編碼。

26、“sox家族”是指編碼sry(性別決定區(qū)y)-box?2的基因，也稱為sox2，與維持多能性相關(guān)。sox多肽(例如sox1、sox2、sox3、sox15或sox18)可以來自人、小鼠、大鼠、牛、豬或其他動(dòng)物。因此,本文所指的“蛋白質(zhì)”、“sox2蛋白質(zhì)”等包括任何天然形式的sox2轉(zhuǎn)錄因子或其保持sox2轉(zhuǎn)錄因子活性(例如,在至少50％、80％、如通過本領(lǐng)域已知的方法測量的，與野生型sox2相比具有90％或100％的活性。在一些實(shí)施例中，與天然存在的sox2多肽相比,變體在其整個(gè)序列中具有至少90％的氨基酸序列同一性。具體的，在seq?id?no:23-24的基礎(chǔ)上進(jìn)行同一性控制的序列改進(jìn)。

27、“klf家族”是指kruppel樣因子4或編碼klf4蛋白的“klf’基因是由小鼠klf4基因和人類klf4基因編碼的蛋白質(zhì)。示例性的klf家族成員包括klf1、klf2、klf3、klf-4、klf5、klf6、klf7、klf8、klf9、klf10、klf11、klf12、klf13、klf14、klf15、klf16和klf17。因此,本文所指的術(shù)語“klf4”、“klf4蛋白”等包括kff4轉(zhuǎn)錄因子的任何天然存在形式或其保持klf4轉(zhuǎn)錄因子活性(例如，在至少50％、與野生型kff4相比，80％、90％或100％的活性,如通過本領(lǐng)域已知的方法測量的。在一些實(shí)施方案中,與天然存在的kff4多肽相比,變體在其整個(gè)序列中具有至少85％或90％或95％的氨基酸序列同一性。例如seq?id?no:21-22所示的變體結(jié)構(gòu)。

28、myc家族的因子是指由與癌癥有關(guān)的myc原癌基因編碼的因子。n-myc或l-myc也被用作替代c-myc的可能重編程因子。因此,本文所指的術(shù)語“c-myc”、“c-myc”、“c-myc蛋白”、“c-myc蛋白”等包括cmyc轉(zhuǎn)錄因子的任何天然存在形式或變體其維持cmyc轉(zhuǎn)錄因子活性(例如,與野生型cmyc相比，活性至少在50％、80％、90％或100％以內(nèi)，如通過本領(lǐng)域已知的方法所測量)。具體的，可以在seq?id?no:11-12的野生型序列基礎(chǔ)上進(jìn)行變體改進(jìn)。

29、在本文所述的這個(gè)方面及其它所有方面的一個(gè)實(shí)施方式中，所述的重編程包括以下之一：將編碼轉(zhuǎn)錄因子oct4、sox2、c-myc和klf4等的核酸序列導(dǎo)入所述分化的體細(xì)胞中，所述序列可操作地連接至用于表達(dá)所述因子的調(diào)節(jié)元件；導(dǎo)入重編程所述細(xì)胞分化狀態(tài)的一個(gè)或多個(gè)蛋白因子；以及將所述細(xì)胞與誘導(dǎo)所述細(xì)胞分化狀態(tài)重編程的小分子相接觸。

30、變體

31、本發(fā)明還包括所述轉(zhuǎn)錄因子突變體的片段、衍生物和類似物。術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄因子突變體相同的生物學(xué)功能或活性的蛋白。本發(fā)明的蛋白片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的蛋白，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此蛋白的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據(jù)本文的定義這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。然而，所述的轉(zhuǎn)錄因子突變體及其片段、衍生物和類似物的氨基酸序列中，對應(yīng)于野生型序列，肯定存在本發(fā)明上上段所述的任一位點(diǎn)的突變。

32、藥物治療領(lǐng)域術(shù)語定義

33、在本文中，術(shù)語“治療”是指用于指獲得期望的藥理學(xué)和/或生理學(xué)效果。所述效果就完全或部分預(yù)防疾病或其癥狀而言可以是預(yù)防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病導(dǎo)致的不良作用而言可以是治療性的。本文使用的“治療”涵蓋哺乳動(dòng)物、特別是貓的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未確診得病的個(gè)體中預(yù)防疾病或病癥發(fā)生；(b)抑制疾病，例如阻滯疾病發(fā)展；或(c)緩解疾病，例如減輕與疾病相關(guān)的癥狀。本文使用的“治療”涵蓋將藥物或化合物給予個(gè)體以治療、治愈、緩解、改善、減輕或抑制個(gè)體的疾病的任何用藥，包括但不限于將含本文所述化合物的藥物給予有需要的個(gè)體。

34、術(shù)語“對象”“個(gè)體”、“患者”或“受試者”包括(根據(jù)是否存在治療用途選擇添加)哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物包括但不限于，家養(yǎng)動(dòng)物(例如，牛，羊，貓，狗和馬)，靈長類動(dòng)物(例如，人和非人靈長類動(dòng)物如猴)，兔，以及嚙齒類動(dòng)物(例如，小鼠和大鼠)。

35、本發(fā)明所述的“預(yù)防”指在疾病開始發(fā)展之前或之后通過施用本發(fā)明所述的產(chǎn)品來避免癥狀或者延緩特定癥狀緊張的所有行為。

36、本發(fā)明所述的“有效量”是指在以單個(gè)或多個(gè)劑量給予至患者或器官之后提供所希望的治療或預(yù)防的本發(fā)明所述產(chǎn)品的量或劑量。

37、在本文中，術(shù)語“藥物組合物”通常是指單位劑量形式，并且可以通過制藥領(lǐng)域中熟知的方法的任何一種進(jìn)行制備。所有的方法包括使活性成分與構(gòu)成一種或多種附屬成分的載體相結(jié)合的步驟。通常，通過均勻并充分地使活性化合物與液體載體、細(xì)碎固體載體或這兩者相結(jié)合，制備組合物。

38、術(shù)語“基因治療”指對個(gè)體細(xì)胞和/或生物組織的瞬時(shí)或永久的基因修飾(例如基因的表達(dá)、插入、改變或移除)以治療疾病，例如腫瘤、遺傳性疾病、衰老相關(guān)疾病和自體免疫疾病。最常見形式的基因治療包括將功能基因?qū)爰?xì)胞進(jìn)行表達(dá)以治療疾病，將功能基因插入特定或非特定的基因組位置以取代突變基因，然而其他形式包括直接糾正突變或修飾易受病原體感染的正?；?，或?qū)⒒蚧蚧蚱无D(zhuǎn)入細(xì)胞進(jìn)行其轉(zhuǎn)錄。

39、術(shù)語“細(xì)胞治療”是指，通過一系列行為(如：在體外對活的自體(autologous)、同種(allogenic)、異種(xenogenic)細(xì)胞進(jìn)行增殖、篩選，以恢復(fù)細(xì)胞和組織的功能，或以其他方法改變細(xì)胞生物學(xué)特性)達(dá)到治療、診斷和預(yù)防目的的醫(yī)藥品。

40、本發(fā)明的第一方面涉及細(xì)胞年輕化方法

41、發(fā)明人通過研究細(xì)胞重編程三個(gè)階段的機(jī)理，啟始階段(initiation?phase)：細(xì)胞身份繼續(xù)維持，早期多能性基因上調(diào)，表觀遺傳年齡(epigenetic?age,epiage)下降，細(xì)胞開始年輕化；成熟階段(maturation?phase)：細(xì)胞身份特征大幅丟失，晚期多能性基因上調(diào)；穩(wěn)定階段(stabilization?phase)：細(xì)胞身份完全丟失，變成ipsc；因此，成熟階段前為部分重編程(pr)的時(shí)間窗口。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種阻止細(xì)胞重編程進(jìn)入成熟階段，延長pr時(shí)間窗口，使細(xì)胞年輕化的同時(shí)又不會(huì)丟失細(xì)胞身份的新方法。所述方法為，使用工程化無相分離重編程因子，基于對轉(zhuǎn)錄因子的相分離功能相關(guān)區(qū)域的突變，使得轉(zhuǎn)錄因子失去了引發(fā)相分離的功能，導(dǎo)致其無力驅(qū)動(dòng)細(xì)胞重編程進(jìn)入成熟階段，從而使重編程滯留在啟始階段，持續(xù)地使細(xì)胞年輕化，但又極大降低了重編程進(jìn)入晚期階段而丟失細(xì)胞身份的風(fēng)險(xiǎn)，該方法稱為“啟始階段重編程”。

42、進(jìn)一步的，所述無相分離工程化轉(zhuǎn)錄因子可以為oct4、sox2、klf4、c-myc、l-myc、lin28、nanog和glis1等因子。

43、本發(fā)明涉及對轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行工程化改造，使其失去相分離能力，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)對于轉(zhuǎn)錄因子立體結(jié)構(gòu)的修飾改進(jìn)的方式并不需要限定，只要能夠使其失去相分離能力，使得細(xì)胞重編程滯留在啟始階段，都在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

44、因此本發(fā)明涉及一種無相分離工程化轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的細(xì)胞啟始階段重編程的方法，其特征在于，使用無相分離工程化轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入細(xì)胞實(shí)現(xiàn)。

45、一種細(xì)胞年輕化方法，其特征在于，使用無相分離工程化轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)細(xì)胞啟始階段重編程。

46、一種細(xì)胞重編程方法，其特征在于，使用包含無相分離工程化轉(zhuǎn)錄因子的載體導(dǎo)入細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)。

47、具體的，判定細(xì)胞年輕化的標(biāo)準(zhǔn)為，與參考值相比，再生細(xì)胞表現(xiàn)出一種或多種表觀遺傳標(biāo)記的基因表達(dá)的變化，所述變化為升高或降低。

48、具體的，判定細(xì)胞年輕化的標(biāo)準(zhǔn)為，與參考值相比，再生細(xì)胞表現(xiàn)細(xì)胞dna甲基化表觀遺傳年齡epiage的變化，所述變化為降低。

49、具體的，判定細(xì)胞年輕化的標(biāo)準(zhǔn)例如，與參考值相比，再生細(xì)胞表現(xiàn)衰老相關(guān)半乳糖苷酶(sa-β-gal)陽性細(xì)胞比例的變化，所述變化為降低。

50、具體的，判定細(xì)胞年輕化的標(biāo)準(zhǔn)示例：相對于參考值，檢測年輕化功能相關(guān)基因：col1a1、col3a1、col4a1、fn1、lama5，基因表達(dá)水平提升；檢測重編程啟始階段特征基因：nanog、sall4，基因表達(dá)水平提升；檢測重編程成熟階段特征基因：dppa5、lin28a，基因表達(dá)水平下降?？梢杂脵z測細(xì)胞的身份基因進(jìn)行細(xì)胞驗(yàn)證，例如檢測成纖維細(xì)胞身份特征基因：thy1、p4hb、s100a4、serpinh1；根據(jù)不同的細(xì)胞選擇不同的身份基因；經(jīng)過檢測身份基因表達(dá)相對于參考值能夠提高。

51、所述參考值的選擇，可以為相同細(xì)胞種類的空白細(xì)胞對照、又或者是野生型轉(zhuǎn)錄因子重組載體導(dǎo)入細(xì)胞作為對照；總之，參考值并非一個(gè)絕對的標(biāo)準(zhǔn)，而是針對修飾的轉(zhuǎn)錄因子重組載體導(dǎo)入細(xì)胞后用于比較的一個(gè)相對的比較基準(zhǔn)。因此，以上針對“判定年輕化的標(biāo)準(zhǔn)”僅為示例，并非絕對化標(biāo)準(zhǔn)，只要能夠證明細(xì)胞重編程滯留在啟始階段都在細(xì)胞年輕化判斷標(biāo)準(zhǔn)的范圍內(nèi)。

52、本發(fā)明保護(hù)范圍也并不僅限于上述示例性的功能基因，只要能夠用于檢測確定細(xì)胞部分重編程在啟始階段，都應(yīng)該在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)。

53、值得注意的是，細(xì)胞年輕化的方法、或細(xì)胞重編程的方法，可以用于治療或診斷，也可以不用于治療或診斷，可以對體內(nèi)或離體細(xì)胞進(jìn)行處理，而并不一定直接需要治療的對象進(jìn)行處理；在某一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞年輕化的方法、或細(xì)胞重編程的方法，并不用于疾病的診斷、預(yù)防和治療。

54、所述無相分離工程化轉(zhuǎn)錄因子元件修飾，具體的改造/突變/修飾方式可以為，以下改進(jìn)方式僅為示例：

55、(1)對帶電氨基酸進(jìn)行突變，包括對酸性氨基酸帶電氨基酸進(jìn)行突變，和/或?qū)A性帶電氨基酸進(jìn)行突變，從而改變蛋白質(zhì)內(nèi)部無序區(qū)(idr區(qū))的帶電氨基酸以調(diào)控凝聚態(tài)形成能力。

56、發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，“idr帶負(fù)電荷是轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生相分離”是原理之一，因此通過預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子內(nèi)部idr區(qū)，例如通過vsl2算法進(jìn)行disorder?score預(yù)測oct4的idr，，例如得分大于一定數(shù)值的連續(xù)區(qū)域有較高可能性為idr，所述數(shù)值并不特別限定，但可以是0.4-0.6的范圍，優(yōu)選0.5。對于oct4進(jìn)行示例性預(yù)測結(jié)果可知，oct4的idr分布于兩端的活化域(activation?domain,ad)，更具體的，是第1-140位、第288-360位氨基酸；中間dna結(jié)合域-(dna?binding?domain,dbd)則不屬于idr。值得注意的是，還可以使用替換性的打分標(biāo)準(zhǔn)，例如iupred2和anchor2的評分標(biāo)準(zhǔn)，但只要能夠用于idr區(qū)的預(yù)測打分，都在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。發(fā)明人經(jīng)過預(yù)測，多種打分標(biāo)準(zhǔn)得到的結(jié)論是相同的(誤差范圍內(nèi))，因此本發(fā)明能夠保護(hù)多種打分標(biāo)準(zhǔn)預(yù)測得到的idr區(qū)結(jié)構(gòu)。

57、具體的，可以對轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)內(nèi)部無序區(qū)(idr區(qū))進(jìn)行氨基酸修飾，或者對活化域進(jìn)行修飾，進(jìn)一步的，可以對帶電氨基酸進(jìn)行修飾；使得轉(zhuǎn)錄因子去除相分離能力。

58、具體的，可以將極性帶電荷的氨基酸替換為中性氨基酸，所述極性帶電氨基酸可以為酸性氨基酸；

59、優(yōu)選的，可以將idr區(qū)的極性帶電荷的氨基酸替換為中性氨基酸，所述極性帶電荷氨基酸可以為酸性氨基酸；

60、更具體的，可以將酸性氨基酸例如天冬氨酸(asp)、谷氨酸(glu)突變?yōu)橹行园被?，例如丙氨酸?/p>

61、更具體的，可以將idr區(qū)的酸性氨基酸例如天冬氨酸(asp)、谷氨酸(glu)突變?yōu)橹行园被?，例如丙氨?

62、在一個(gè)具體的實(shí)施例中，可以是對oct4的野生型氨基酸序列進(jìn)行突變改進(jìn)；

63、所述oct4野生型基因的蛋白序列的idr區(qū)，可以占全序列的比例為，n端占38-40％，c端占19-24％。

64、優(yōu)選的，可以是對seq?id?no：2的第1-140位進(jìn)行上述突變改進(jìn)，和/或?qū)?88-360位進(jìn)行上述突變改進(jìn)；值得注意的是，上述位置可以有前后約10-20個(gè)氨基酸位置的誤差范圍。

65、優(yōu)選的，突變位點(diǎn)選自seq?id?no：2的8、20、31、108、138、291、297；26、56、68、91、96、98、104、113、125、127、130、134、135、296、299、341、343中至少一個(gè)；優(yōu)選的，突變點(diǎn)選自seq?id?no：2的145、147、166、188、209、210、215、224、238、246、270、272中的至少一個(gè)。具體的，突變數(shù)量可以為1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)……36個(gè)。

66、示例性的，可以是對野生型oct4的基因進(jìn)行突變，使得其蛋白的idr區(qū)域的酸性極性氨基酸進(jìn)行突變(d/e→a)，以下稱為oct4’；例如seq?id?no：4-10中任意一個(gè)所示，或者能夠達(dá)到相同功能的至少85％或90％或95％以上同一性的序列。

67、本發(fā)明還進(jìn)一步保護(hù)表達(dá)上述蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列，示例性的，可以是seq?id?no：3所示，然而本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，只要能夠通過密碼子表達(dá)得到目的蛋白，合理的密碼子偏好變化得到不同的核苷酸序列都在保護(hù)范圍內(nèi)。

68、當(dāng)然本發(fā)明并不限于上述轉(zhuǎn)錄因子的限定，只要進(jìn)行idr區(qū)帶電氨基酸的修飾能夠?qū)崿F(xiàn)無相分離的功能的轉(zhuǎn)錄因子改造都在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

69、(2)泛素化修飾

70、發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，氨基酸被多泛素鏈(polyubiquitin?chain)修飾后，多泛素鏈介導(dǎo)的相分離，因此將例如賴氨酸k替換成精氨酸r，不產(chǎn)生多泛素鏈修飾，可以避免相分離發(fā)生。但值得注意的是，本發(fā)明的保護(hù)范圍在于提供了一種對轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行泛素化突變避免相分離發(fā)生的方法，而并不局限于具體的突變方式。

71、示例性的，針對c-myc轉(zhuǎn)錄因子，對其可被泛素化的賴氨酸進(jìn)行突變(k→r)，也可以對其他轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行泛素化突變。

72、具體的可以對seq?id?no：11-12進(jìn)行突變處理，在seq?id?no：12的基礎(chǔ)上可以對第51、52、126、143、148、157、206、269、275、289、298、317、323、326、341、355、371、389、392、397、398、412、422、428、430位中至少一個(gè)賴氨酸(k)進(jìn)行突變處理；

73、優(yōu)選的，可以是對以上位置中1個(gè)，2個(gè)，3個(gè)……25個(gè)位置進(jìn)行突變處理；優(yōu)選對第148、389位氨基酸兩者之一，或兩者一起進(jìn)行突變處理；優(yōu)選對20-25個(gè)位置進(jìn)行突變處理；更優(yōu)選對25個(gè)位置均進(jìn)行突變處理；但只要能夠?qū)崿F(xiàn)去除泛素化鏈并進(jìn)而達(dá)到目的效果，即避免相分離，則具體的突變位置的數(shù)量并不需要特別限定。

74、優(yōu)選的，是對賴氨酸k進(jìn)行突變?yōu)榫彼岬男揎椃绞?；但并不限定具體方式，只要能夠去除泛素化并實(shí)現(xiàn)避免相分離，都在保護(hù)范圍內(nèi)。

75、例如seq?id?no:14-20所示的變體作為示例，或者能夠達(dá)到相同功能的至少85％或90％或95％以上同一性的序列。

76、本發(fā)明還進(jìn)一步保護(hù)表達(dá)上述蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列，示例性的，可以是seq?id?no：13所示，或者能夠達(dá)到相同功能的至少85％或90％或95％以上同一性的序列；然而本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，只要能夠通過密碼子表達(dá)得到目的蛋白，根據(jù)表達(dá)細(xì)胞的需要合理的密碼子偏好變化得到不同的核苷酸序列都在保護(hù)范圍內(nèi)。

77、當(dāng)然本發(fā)明并不限于上述轉(zhuǎn)錄因子的限定，只要進(jìn)行去除泛素化處理能夠?qū)崿F(xiàn)無相分離的功能的轉(zhuǎn)錄因子改造都在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

78、(3)部分缺失處理，優(yōu)選末端缺失處理，可以是對n端或c端進(jìn)行部分缺失處理，或?qū)虻闹虚g部分進(jìn)行部分缺失處理；或者稱為蛋白的idr區(qū)部分缺失處理，即idr區(qū)帶電氨基酸部分缺失處理；或者稱為蛋白的相分離關(guān)鍵調(diào)控區(qū)域缺失處理，即具有泛素化鏈修飾的關(guān)鍵賴氨酸缺失處理，或?qū)Ξa(chǎn)生相分離具有關(guān)鍵作用的氨基酸缺失處理。

79、示例性的，可以對轉(zhuǎn)錄因子n端或c端、其dbd以外的非關(guān)鍵區(qū)域進(jìn)行缺失處理，例如對第1-20位進(jìn)行缺失處理，進(jìn)一步的，還可以是2-20、1-19、2-29、2-18、2-17、2、16位置進(jìn)行缺失處理，這種處理方式不影響dbd區(qū)域，即不影響轉(zhuǎn)錄因子原本的dna位點(diǎn)識別功能，但有可能去掉其idr區(qū)域、泛素化鏈修飾的賴氨酸或其它關(guān)鍵氨基酸，從而避免發(fā)生相分離；

80、具體的，可以對seq?id?no：21-22所示的klf轉(zhuǎn)錄因子4(klf4)的序列進(jìn)行部分刪除，例如其重要的dbd區(qū)域位于c端的375-470位，因此可以對n端2-374位的idr區(qū)域進(jìn)行全部或部分缺失處理，得到例如seq?id?no：40所示的氨基酸序列，或者能夠達(dá)到相同功能的至少85％或90％或95％以上同一性的序列；

81、具體的，可以對seq?id?no：23-24所示的性別決定y盒轉(zhuǎn)錄因子2(sox2)的序列進(jìn)行部分刪除，例如其重要的dbd區(qū)域和轉(zhuǎn)錄激活域位于中部的41-200位，因此可以對n端2-40位和/或c端201-317位的idr區(qū)域進(jìn)行全部或部分缺失處理，得到例如seq?id?no：41-43所示的氨基酸序列，或者能夠達(dá)到相同功能的至少85％或90％或95％以上同一性的序列。

82、具體的，可以對seq?id?no：1-2所示的oct4的序列進(jìn)行部分刪除，例如其重要的dbd區(qū)域位于中部的141-287位，因此可以對n端2-140位和/或c端288-360位的idr區(qū)域進(jìn)行全部或部分缺失處理，得到例如seq?id?no：44-46所示的氨基酸序列，或者能夠達(dá)到相同功能的至少85％或90％或95％以上同一性的序列。

83、具體的，可以對seq?id?no：11-12所示的c-mcy的序列進(jìn)行部分刪除，例如其最重要的dbd為c端361-439位的bhlh-lz結(jié)構(gòu)域，因此可以對n端2-360位進(jìn)行全部或部分缺失處理，得到例如seq?id?no：47-48所示的氨基酸序列，或者能夠達(dá)到相同功能的至少85％或90％或95％以上同一性的序列。本發(fā)明還進(jìn)一步保護(hù)表達(dá)上述蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列，示例性的，可以是seq?id?no：13所示，或者能夠達(dá)到相同功能的至少85％或90％或95％以上同一性的序列；然而本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，只要能夠通過密碼子表達(dá)得到目的蛋白，合理的密碼子偏好變化得到不同的核苷酸序列都在保護(hù)范圍內(nèi)。

84、當(dāng)然本發(fā)明并不限于上述轉(zhuǎn)錄因子的限定，只要進(jìn)行部分缺失處理從而能夠?qū)崿F(xiàn)無相分離的功能的轉(zhuǎn)錄因子改造都在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

85、本發(fā)明的第二方面提供了包含工程化轉(zhuǎn)錄因子的元件

86、核酸元件

87、本發(fā)明進(jìn)一步包括了前述工程化轉(zhuǎn)錄因子的核酸元件，所述元件可以是dna元件、rna元件，進(jìn)一步的可以是mrna元件、sirna元件、環(huán)狀rna元件、環(huán)狀mrna元件、trna元件。

88、所述元件進(jìn)一步包含kozak序列、啟動(dòng)子序列、至少一個(gè)連接肽序列、utr區(qū)、終止子序列、5’帽子、polya尾等；所述核酸元件可以是dna、rna序列，也可以是進(jìn)一步表達(dá)的蛋白元件。啟動(dòng)子可選自，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子如tre、tre3g、tre3gs、tre3gv等，組成型啟動(dòng)子cmv、efs、cag、pgk等，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列例如wpre等，poly(a)尾例如sv40?poly(a)、pgh?poly(a)等。

89、所述mrna元件包括但不限于線性mrna和環(huán)狀mrna。所述環(huán)狀mrna上可存在ires和自剪切多肽2a元件。所述rna可存在適度的修飾，包括但不限于假尿苷(ψ)、n1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲氧基-尿苷(5mou)、n6-甲基-腺苷(m6a)、5-甲基-胞苷(5m5c)等。所述rna上可存在用于富集該rna所需的與l7ae、tat等結(jié)合的序列。

90、重組載體元件

91、本發(fā)明中的元件可以進(jìn)一步構(gòu)建載體，可以為單順反子、雙順反子或多順反子。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述的雙順反子或多順反子基因的編碼區(qū)可通過至少一種連接肽鏈接，連接肽可以為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal?ribosome?entry?site，ires)或自剪切多肽2a(self-cleaving?2a?peptide，2a)。

92、可使用的ires序列包括但不限于：小rna病毒(例如fmdv)、瘟病毒(例如cffv)、脊髓灰質(zhì)炎病毒(例如pv)、腦心肌炎病毒(例如ecmv)、口蹄疫病毒(例如fmdv)、丙肝病毒(例如hcv)、古典豬瘟病毒(例如csfv)、小鼠角膜白斑病毒(例如mlv)、猿免疫缺陷病毒(例如siv)或蟋蟀麻痹病毒(例如crpv)等。所述編碼區(qū)亦可以通過“2a連接子”進(jìn)行分割，所述“2a連接子”是來源于病毒的短肽(18-25個(gè)氨基酸)，又稱“自我剪切”肽，能使一條轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)生多種蛋白，包括但不限于p2a/t2a/e2a/f2a等。

93、當(dāng)多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子串聯(lián)時(shí)，具體的可以是seq?id?no：25-27所示。當(dāng)然本發(fā)明也提供單獨(dú)轉(zhuǎn)錄因子的載體，并進(jìn)行一定比例的混合，例如1：1：1：1混合，1：2：1：2混合，1：2：2：1混合，2：1：1：1混合。混合物也在本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)。

94、本發(fā)明進(jìn)一步包括了前述工程化轉(zhuǎn)錄因子的重組載體，包括但不限于克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體、病毒載體(例如慢病毒載體、腺相關(guān)病毒載體，痘病毒相關(guān)載體等)。

95、重組蛋白

96、本發(fā)明進(jìn)一步包括上述核酸元件翻譯表達(dá)得到的重組蛋白元件，以及能夠表達(dá)得到上述蛋白元件的所有核苷酸序列。蛋白元件在一定程度下維持功能，也能夠包含一定的變體。

97、重組細(xì)胞

98、本發(fā)明進(jìn)一步包括了導(dǎo)入前述載體的重組細(xì)胞。

99、具體的，本發(fā)明提供的方法可應(yīng)用于需要再生的任何類型的細(xì)胞。細(xì)胞可以與其他細(xì)胞分離,與培養(yǎng)物中的其他細(xì)胞混合,或在組織(部分或完整)或活生物體中混合。本文描述的方法可以在例如包含單個(gè)細(xì)胞、細(xì)胞群或包含細(xì)胞的組織或器官的樣品上進(jìn)行。選擇用于年輕化的細(xì)胞將取決于治療與年齡相關(guān)的疾病或病癥所需的治療效果。,細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。包括但不限于原核細(xì)胞、真核細(xì)胞，進(jìn)一步的，可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如人、猴、鼠(大鼠、小鼠)、馬、牛、羊、豬、狗、貓等。如crfk貓腎細(xì)胞、pg-4(s+l-)貓腦細(xì)胞、f81貓腎細(xì)胞、fca-s1貓皮膚細(xì)胞、catk1貓腎細(xì)胞、mdck(nbl-2)犬腎細(xì)胞、scbn犬十二指腸細(xì)胞、dh82犬腎惡性組織增生癥細(xì)胞、hek293t、hek293、bhk、cho、3t3、ns0、hela、ht-1080，perc6、cap、hkb-11、huh-7等；在實(shí)施例中，細(xì)胞是人類細(xì)胞。在實(shí)施例中，細(xì)胞來自老年受試者。

100、本發(fā)明提供的方法可以在神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、外皮系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)、排泄系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)(例如,神經(jīng)系統(tǒng))的細(xì)胞、組織或器官上進(jìn)行。(內(nèi)分泌和外分泌)或消化系統(tǒng)。如本文所述,任何類型的細(xì)胞都可能被再生,包括但不限于上皮細(xì)胞(例如,鱗狀、立方形、柱狀和假復(fù)層上皮細(xì)胞)、內(nèi)皮細(xì)胞(例如,靜脈、動(dòng)脈和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞)細(xì)胞)和結(jié)締組織、肌肉和神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞。此類細(xì)胞可包括但不限于表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、衛(wèi)星細(xì)胞、心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、基底細(xì)胞、成釉細(xì)胞、外分泌細(xì)胞、肌上皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、神經(jīng)元(例如,感覺神經(jīng)元、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和中間神經(jīng)元)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(例如,少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、室管膜細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、雪旺細(xì)胞和衛(wèi)星細(xì)胞)、柱狀細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、周細(xì)胞、星狀細(xì)胞、肺細(xì)胞、血液和免疫系統(tǒng)細(xì)胞(例如,紅細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、t細(xì)胞、b細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞)、激素分泌細(xì)胞、生殖細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、晶狀體細(xì)胞、感光細(xì)胞、味覺細(xì)胞和嗅覺細(xì)胞；以及來自腎、肝、胰腺、胃、脾、膽囊、腸、膀胱、肺、前列腺、乳房、泌尿生殖道、垂體細(xì)胞、口腔、食道、皮膚、頭發(fā)、指甲、甲狀腺、甲狀旁腺、腎上腺、眼睛、鼻子或大腦。

101、具體的，細(xì)胞選自成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨骼肌干細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和角膜上皮細(xì)胞。具體的，細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。具體的，細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞。具體的，細(xì)胞是軟骨細(xì)胞。具體的，細(xì)胞是骨骼肌干細(xì)胞。具體的,細(xì)胞是角化細(xì)胞。具體的，細(xì)胞是間充質(zhì)干細(xì)胞。具體的，細(xì)胞是角膜上皮細(xì)胞。

102、導(dǎo)入與遞送

103、所述導(dǎo)入方法包括但不限于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、微囊泡轉(zhuǎn)染、外泌體轉(zhuǎn)染、電穿孔、納米載體轉(zhuǎn)染、采用轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)染；納米載體包括脂質(zhì)、聚合物或脂質(zhì)-聚合物雜化物。

104、一種遞送系統(tǒng)，用于遞送上述核酸分子、包含核酸分子的重組載體、重組dna分子、mrna、重組蛋白質(zhì)等。在一些實(shí)施方案中，脂質(zhì)納米顆粒或“l(fā)np”用于將核酸遞送至細(xì)胞。如上所述，lnp可包含天然脂質(zhì)或合成脂質(zhì),包括共軛脂質(zhì)或聚合物(例如聚乙二醇化脂質(zhì))。lnp可包含中性脂質(zhì)、兩性離子脂質(zhì)、可電離脂質(zhì)、陽離子脂質(zhì)和陰離子脂質(zhì)中的任何一種或多種。在一些實(shí)施方案中，lnp包含天然或合成的單?；蚨；问降牧字Ｄ憠A(pc)、磷脂酰甘油(pg)、磷脂酰絲氨酸(ps)、磷脂酰乙醇胺(pe)和磷脂酸(pa),或單?；⒍；?、三?；蛩孽；问叫牧字?。在一些實(shí)施方案中，lnp是膠束或反膠束(反膠束)。在其他實(shí)施方案中，lnp是單層脂質(zhì)體或多層脂質(zhì)體。

105、本發(fā)明還涉及其他遞送系統(tǒng)，如galnac共軛連接遞送系統(tǒng)、脂質(zhì)體lnp納米遞送系統(tǒng)(小分子配體、抗體及其它分子)和病毒樣顆粒vlp遞送、魚精蛋白、高分子聚合物、無機(jī)納米顆粒、外泌體、聚合物基質(zhì)、病毒轉(zhuǎn)染等。

106、本發(fā)明的第三方面涉及預(yù)防和/或治療用途

107、本發(fā)明所涉及的核酸元件(dna、rna元件)、重組載體、重組蛋白、重組細(xì)胞可在多領(lǐng)域中實(shí)現(xiàn)預(yù)防和/或治療用途，也用于在制備用于治療疾病的藥物中的用途。具體治療的疾病包括但不限于細(xì)胞療法、基因治療、免疫細(xì)胞增殖、癌癥治療、衰老相關(guān)疾病治療等。

108、本發(fā)明涉及的方法可用于使培養(yǎng)的細(xì)胞(例如,離體或體外)恢復(fù)活力以改善用于細(xì)胞療法的功能和效力。用于治療患者的細(xì)胞可以是自體的或同種異體的。優(yōu)選地，細(xì)胞來源于患者或匹配的供體。例如，在離體治療中，細(xì)胞直接從待治療的患者獲得，如本發(fā)明所述用編碼細(xì)胞重編程因子的mrna轉(zhuǎn)染,并重新植入患者體內(nèi)。這一類細(xì)胞可以例如從對患者進(jìn)行的活組織檢查或外科手術(shù)中獲得。或者,需要再生的細(xì)胞可以用編碼細(xì)胞重編程因子的mrna在體內(nèi)直接轉(zhuǎn)染。在一些實(shí)施方案中,這種免疫細(xì)胞工程是離體進(jìn)行的，例如，在細(xì)胞治療產(chǎn)品的制造中，例如自體或同種異體嵌合抗原受體(car)-t、car-nk、car-m或car-nkt細(xì)胞。

109、本發(fā)明涉及的方法可以用于進(jìn)行基因治療?！盎蛑委煛庇糜谥甘褂没?即，遺傳物質(zhì))來治療和/或預(yù)防哺乳動(dòng)物受試者(例如，人類)的疾病。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所涉及的遺傳物質(zhì)(核酸元件(dna、rna元件)、重組載體等)被直接遞送到哺乳動(dòng)物受試者的至少一些細(xì)胞中。本發(fā)明可用于基因治療的任何特定方法或組合物。可以利用前述的核酸元件、重組載體等導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)基因治療的目的。具體的，可以包括自體或離體的基因治療?；蛑委熞部梢苑譃椤吧诚导?xì)胞基因治療”和“體細(xì)胞基因治療”。在“生殖細(xì)胞基因治療”的情況下，生殖細(xì)胞，即精子或卵細(xì)胞，被遺傳修飾。遺傳改變通常整合到它們的基因組中。因此，由于治療產(chǎn)生的改變可以遺傳，并將傳遞至后代。該方法可用于治療遺傳紊亂和遺傳病。在“體細(xì)胞基因治療”的情況下，治療性基因被轉(zhuǎn)移入個(gè)體的體細(xì)胞。任何修飾和效應(yīng)將僅被限制至該個(gè)體，將不會(huì)由個(gè)體的子孫或后代遺傳。具體策略包括但不限于dna矯正、dna置換、dna增補(bǔ)、dna失活的方式。

110、在另一方面,提供了用于誘導(dǎo)細(xì)胞例如免疫細(xì)胞增殖的方法。在一些實(shí)施方案中,該方法包括將細(xì)胞暴露于編碼一種或多種重編程因子的mrna,由此所述暴露實(shí)現(xiàn)一種或多種重編程因子在細(xì)胞中的表達(dá)以增強(qiáng)細(xì)胞增殖,同時(shí)保留其特性。在一些實(shí)施例中,誘導(dǎo)增殖的方法不誘導(dǎo)衰竭。在一些實(shí)施例中,增殖由衰竭的預(yù)防或逆轉(zhuǎn)引起。

111、特定的，本發(fā)明的細(xì)胞年輕化治療方式，可以用于“與年齡相關(guān)的疾病或病癥”，具體是指與衰老相關(guān)的任何病癥、疾病或病癥,例如但不限于神經(jīng)退行性疾病(例如阿爾茨海默病、帕金森氏病、亨廷頓病、肌萎縮側(cè)索硬化、癡呆、和中風(fēng))、心血管和周圍血管疾病(例如動(dòng)脈粥樣硬化、外周動(dòng)脈疾病(pad)、血腫、鈣化、血栓形成、栓塞和動(dòng)脈瘤)、眼部疾病(例如年齡相關(guān)性黃斑變性、青光眼、白內(nèi)障、干眼癥、糖尿病視網(wǎng)膜病變、視力減退)、皮膚病(真皮萎縮變薄、彈性增生和皮膚皺紋、皮脂腺增生或發(fā)育不全、老年性雀斑等色素沉著異常、頭發(fā)花白、脫發(fā)或稀疏、慢性皮膚潰瘍)、自身免疫性疾病(例如,風(fēng)濕性多肌痛(pmr)、巨細(xì)胞動(dòng)脈炎(gca)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(ra)、晶體關(guān)節(jié)病和脊椎關(guān)節(jié)病(spa))、內(nèi)科代謝功能障礙(例如,成人垂體功能減退癥、甲狀腺功能減退癥、淡漠性甲狀腺毒癥、骨質(zhì)疏松癥、糖尿病、腎上腺功能不全、各種形式的性腺功能減退癥和內(nèi)分泌惡性腫瘤)、肌肉骨骼疾病(例如,關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、骨髓瘤、痛風(fēng)、paget病、骨骨折、骨髓衰竭綜合征、強(qiáng)直、彌漫性特發(fā)性骨肥厚、血源性骨髓炎、肌肉萎縮、周圍神經(jīng)病變、多發(fā)性硬化癥、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(als)、杜氏肌營養(yǎng)不良癥、原發(fā)性側(cè)索硬化癥和重癥肌無力),消化系統(tǒng)疾病系統(tǒng)(例如肝硬化、肝纖維化、巴雷特食管)、呼吸系統(tǒng)疾病(例如肺纖維化、慢性阻塞性肺病、哮喘、慢性支氣管炎、肺栓塞(pe)、肺癌和感染)、與細(xì)胞增殖相關(guān)的病癥,以及任何其他與衰老相關(guān)的疾病和病癥。

112、如本文所用,術(shù)語“涉及軟骨退化的疾病或病癥”是涉及軟骨和/或關(guān)節(jié)退化的任何疾病或病癥。術(shù)語“涉及軟骨退化的疾病或病癥”包括影響動(dòng)物(包括人類)的椎間盤或關(guān)節(jié)(例如,關(guān)節(jié))的病癥、病癥、綜合征、疾病和損傷,并且包括但不限于關(guān)節(jié)炎、軟骨畸形、脊柱關(guān)節(jié)病、強(qiáng)直性脊柱炎、紅斑狼瘡、復(fù)發(fā)性多軟骨炎和干燥綜合征。術(shù)語“肌肉退化疾病或病癥”是涉及肌肉退化的任何疾病或病癥。該術(shù)語包括病癥、障礙、綜合征、

113、影響肌肉組織的疾病和損傷,例如但不限于肌肉萎縮、肌肉廢用、肌肉撕裂、燒傷、手術(shù)、周圍神經(jīng)病變、多發(fā)性硬化癥、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(als)、杜氏肌營養(yǎng)不良癥、原發(fā)性側(cè)索硬化癥、重癥肌無力、癌癥、艾滋病、充血性心力衰竭、慢性阻塞性肺病(copd)、肝病、腎衰竭、飲食失調(diào)、營養(yǎng)不良、饑餓、感染或糖皮質(zhì)激素治療。

114、與細(xì)胞增殖相關(guān)的病癥是指由于細(xì)胞增殖引起的異常生長或延伸而發(fā)生的疾病(walker,cambridge?dictionary?of?biology,cambridge?university?press:cambridge,uk,1990)。增殖性疾病可能與:1)正常靜止細(xì)胞的病理性增殖有關(guān)；2)細(xì)胞從其正常位置的病理遷移(例如,腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移)；3)基質(zhì)金屬蛋白酶(如膠原酶、明膠酶和彈性蛋白酶)等蛋白水解酶的病理表達(dá)；或4)病理性血管生成,如增殖性視網(wǎng)膜病變和腫瘤轉(zhuǎn)移。示例性增殖性疾病包括癌癥(即,惡性腫瘤”)、良性腫瘤、血管生成、炎癥性疾病和自身免疫性疾病。

115、“癌癥”是指一類以異常細(xì)胞的發(fā)展為特征的疾病,這些異常細(xì)胞不受控制地增殖并具有浸潤和破壞正常身體組織的能力。示例性癌癥包括但不限于聽神經(jīng)瘤；腺癌；腎上腺癌；肛門癌；血管肉瘤(例如淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、血管肉瘤)；闌尾癌；良性單克隆丙種球蛋白??；膽管癌(例如,膽管癌)；膀胱癌；乳腺癌(例如，乳腺腺癌、乳腺乳頭狀癌、乳腺癌、乳腺髓樣癌)；腦癌(例如,腦膜瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤(例如，星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤)、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤)；支氣管癌；類癌瘤；宮頸癌(例如宮頸腺癌)；絨毛膜癌；脊索瘤；顱咽管瘤；結(jié)直腸癌(例如,結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)直腸腺癌)；結(jié)締組織癌；上皮癌；室管膜瘤；內(nèi)皮肉瘤(例如,卡波西肉瘤、多發(fā)性特發(fā)性出血性肉瘤)；子宮內(nèi)膜癌(例如,子宮癌、子宮肉瘤)；食管癌(例如,食管腺癌、巴雷特腺癌)；尤因氏肉瘤；眼癌(例如眼內(nèi)黑色素瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤)；熟悉的嗜酸性粒細(xì)胞增多癥；膽囊癌；胃癌(例如,胃腺癌)；胃腸道間質(zhì)瘤(gist)；生殖細(xì)胞癌；頭頸癌(例如頭頸鱗狀細(xì)胞癌、口腔癌(例如口腔鱗狀細(xì)胞癌)、咽喉癌(例如喉癌、咽癌、鼻咽癌、口咽癌))；造血系統(tǒng)癌癥(例如,白血病,例如急性淋巴細(xì)胞白血病(all)(例如,b細(xì)胞all、t細(xì)胞all)、急性髓細(xì)胞性白血病(aml)(例如,b細(xì)胞aml、t細(xì)胞aml)、慢性髓細(xì)胞性白血病白血病(cml)(例如,b細(xì)胞cml、t細(xì)胞cml)和慢性淋巴細(xì)胞白血病(cll)(例如,b細(xì)胞cll、t細(xì)胞cll))；淋巴瘤,例如霍奇金淋巴瘤(hl)(例如,b細(xì)胞hl、t細(xì)胞hl)和非霍奇金淋巴瘤(nhl)(例如,b細(xì)胞nhl,例如彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤(dlcl)(例如,彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤)、濾泡性淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病/小淋巴細(xì)胞淋巴瘤(cll/sll)、套細(xì)胞淋巴瘤(mcl)、邊緣區(qū)b細(xì)胞淋巴瘤(例如粘膜相關(guān)淋巴組織(malt)淋巴瘤、淋巴結(jié)邊緣區(qū)b細(xì)胞淋巴瘤、脾邊緣區(qū)b細(xì)胞淋巴瘤)、原發(fā)性縱隔b細(xì)胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴漿細(xì)胞性淋巴瘤(即華氏巨球蛋白血癥)、毛細(xì)胞白血病(hcl)、免疫母細(xì)胞大細(xì)胞淋巴瘤、前體b淋巴母細(xì)胞淋巴瘤和原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)淋巴瘤；和t細(xì)胞nhl,例如前體t淋巴母細(xì)胞淋巴瘤/白血病、外周t細(xì)胞淋巴瘤(ptcl)(例如皮膚t細(xì)胞淋巴瘤(ctcl)(例如蕈樣真菌病、sezary綜合征)、血管免疫母細(xì)胞t細(xì)胞淋巴瘤,結(jié)外自然殺傷t細(xì)胞淋巴瘤、腸病型t細(xì)胞淋巴瘤、皮下脂膜炎樣t細(xì)胞淋巴瘤和間變性大細(xì)胞淋巴瘤)；如上所述的一種或多種白血病/淋巴瘤的混合物；和多發(fā)性骨髓瘤(mm))、重鏈病(例如,α鏈病、γ鏈病、μ鏈病)；血管母細(xì)胞瘤；下咽癌；炎性肌纖維母細(xì)胞腫瘤；免疫細(xì)胞淀粉樣變性；腎癌(例如腎母細(xì)胞瘤又名腎母細(xì)胞瘤、腎細(xì)胞癌)；肝癌(例如,肝細(xì)胞癌(hcc)、惡性肝細(xì)胞瘤)；肺癌(例如支氣管癌、小細(xì)胞肺癌(sclc)、非小細(xì)胞肺癌(nsclc)、肺腺癌)；平滑肌肉瘤(lms)；肥大細(xì)胞增多癥(例如系統(tǒng)性肥大細(xì)胞增多癥)；肌肉癌；骨髓增生異常綜合征(mds)；間皮瘤；骨髓增生性疾病(mpd)(例如,真性紅細(xì)胞增多癥(pv)、原發(fā)性血小板增多癥(et)、特發(fā)性骨髓化生(amm)又名骨髓纖維化(mf)、慢性特發(fā)性骨髓纖維化、慢性粒細(xì)胞白血病(cml)、慢性中性粒細(xì)胞白血病(cnl),嗜酸性粒細(xì)胞增多綜合征(hes))；成神經(jīng)細(xì)胞瘤；神經(jīng)纖維瘤(例如,1型或2型神經(jīng)纖維瘤病(nf)、神經(jīng)鞘瘤病)；神經(jīng)內(nèi)分泌癌(例如,胃腸胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(gep-net)、類癌瘤)；骨肉瘤(例如,骨癌)；卵巢癌(例如,囊腺癌、卵巢胚胎癌、卵巢腺癌)；乳頭狀腺癌；胰腺癌(例如胰腺癌、導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀粘液性腫瘤(ipmn)、胰島細(xì)胞瘤)；陰莖癌(例如陰莖和陰囊佩吉特病)；松果體；原始神經(jīng)外胚層腫瘤(pnt)；漿細(xì)胞瘤；副腫瘤綜合征；上皮內(nèi)腫瘤；前列腺癌(例如前列腺癌)；直腸癌；橫紋肌肉瘤；唾液腺癌；皮膚癌(例如,鱗狀細(xì)胞癌(scc)、角化棘皮瘤(ka)、黑色素瘤、基底細(xì)胞癌(bcc))；小腸癌(例如闌尾癌)；軟組織肉瘤(例如,惡性纖維組織細(xì)胞瘤(mfh)、脂肪肉瘤、惡性周圍神經(jīng)鞘瘤(mpnst)、軟骨肉瘤、纖維肉瘤、粘液肉瘤)；皮脂腺癌；小腸癌；汗腺癌；滑膜瘤；睪丸癌(例如,精原細(xì)胞瘤、睪丸胚胎癌)；甲狀腺癌(例如,甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺乳頭狀癌(ptc)、甲狀腺髓樣癌)；尿道癌；陰道癌；和外陰癌(例如佩吉特外陰病)。

116、本發(fā)明第四方面提供了藥物組合物

117、藥物組合物通常由主料和輔料構(gòu)成，所述藥物組合物可以用于預(yù)防也可以用于治療，可以為標(biāo)準(zhǔn)化治療也可以用于個(gè)性化治療(細(xì)胞治療、基因治療)。

118、主料的選擇主要為本發(fā)明第一、第二方面所提及的核酸元件、重組載體、重組細(xì)胞等為主要成分，可以通過串聯(lián)方式形成重組載體，也可以通過單獨(dú)構(gòu)建載體，形成多種單獨(dú)的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行混合形成混合物的方式?；旌媳壤齼?yōu)選等比例混合，當(dāng)然在維持相同活性功能的基礎(chǔ)上，不同的比例也是被允許的。

119、本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述核酸元件、重組載體、重組細(xì)胞等在制備用于治療通過介導(dǎo)細(xì)胞年輕化能夠預(yù)防和治療的疾病的藥物中的用途。以及提供了用于治療通過介導(dǎo)細(xì)胞年輕化能夠預(yù)防和治療的疾病的藥物組合物。以及提供了，藥物組合物，其用于治療通過介導(dǎo)細(xì)胞年輕化能夠預(yù)防和治療的疾病。

120、當(dāng)藥物組合物為細(xì)胞的組合物時(shí)，尤其是再生細(xì)胞組合物時(shí)，還可包含一種或多種額外因子，例如營養(yǎng)素、細(xì)胞因子、生長因子、細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)組分、抗生素、抗氧化劑或免疫抑制劑以改善細(xì)胞功能或生存能力。

121、生長因子的例子包括但不限于成纖維細(xì)胞生長因子(fgf)、胰島素樣生長因子(igf)、轉(zhuǎn)化生長因子β(tgf-p)、上皮調(diào)節(jié)蛋白、表皮生長因子(“egf”)、內(nèi)皮細(xì)胞因子細(xì)胞生長因子(“ecgf”)、神經(jīng)生長因子(“ngf”)、白血病抑制因子(“l(fā)if”)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(“bmp-4”)、肝細(xì)胞生長因子(“hgf”)、血管內(nèi)皮生長因子-a(“vegf-a”)和膽囊收縮素八肽。

122、在主料的基礎(chǔ)上，可選的，所述藥物組合物還包含一種以上的藥學(xué)可接受的賦型劑、載體、輔料、媒介物。賦型劑、載體、輔料、媒介物的實(shí)例包括但不限于抗粘劑、粘合劑、包衣、壓縮助劑、崩解劑、染料、滑潤劑、乳化劑、填充劑(稀釋劑)、成膜劑或包衣、調(diào)味劑、芳香劑、助流劑(流動(dòng)增強(qiáng)劑)、潤滑劑、吸附劑、懸浮或分散劑或甜味劑。例示性賦型劑、載體、輔料、媒介物包括但不限于：丁基化羥基甲苯(bht)、碳酸鈣、磷酸鈣(一氫)、硬脂酸鈣、交聯(lián)羧甲纖維素、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、檸檬酸、交聯(lián)聚維酮、半胱氨酸、乙基纖維素、明膠、羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、乳糖、硬脂酸鎂、麥芽糖醇、甘露糖醇、蛋氨酸、甲基纖維素、對羥基苯甲酸甲酯、微晶纖維素、聚乙二醇、聚維酮、預(yù)膠化淀粉、對羥基苯甲酸丙酯、視黃醇棕櫚酸酯、蟲膠、二氧化硅、羧基甲基纖維素鈉、檸檬酸鈉、乙醇酸淀粉鈉、山梨糖醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化鈦、維他命a、維他命e、維他命c(diǎn)及木糖醇。

123、所述藥物組合物可呈注射制劑、口服制劑、吸入制劑或微針制劑的形式經(jīng)制備。所述的注射制劑依據(jù)物態(tài)分類包括液體注射劑、注射用粉劑、注射用片劑；依據(jù)注射部分分類包括皮內(nèi)注射劑、皮下注射劑、肌肉注射劑、靜脈注射劑、腹腔注射、脊椎腔注射劑；優(yōu)選的所述注射制劑的溶劑包括注射用水或生理鹽水。優(yōu)選靜脈、肌肉、微針注射的方式。

124、用于口服使用的制劑包括含有與無毒的藥學(xué)上可接受的賦形劑混合的活性成分的片劑。這些賦形劑可以是例如惰性稀釋劑或填充劑(例如，蔗糖、山梨糖醇、糖、甘露糖醇、微晶纖維素、包括馬鈴薯淀粉的淀粉、碳酸鈣、氯化鈉、乳糖、磷酸鈣、硫酸鈣或磷酸鈉)；制粒劑及崩解劑(例如，包括微晶纖維素的纖維素衍生物、包括馬鈴薯淀粉的淀粉、交聯(lián)羧甲纖維素鈉、藻酸鹽或藻酸)；粘合劑(例如，蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、阿拉伯膠、藻酸、藻酸鈉、明膠、淀粉、預(yù)膠化淀粉、微晶纖維素、硅酸鎂鋁、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乙基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇)；以及潤滑劑、助流劑及抗粘劑(例如，硬脂酸鎂、硬脂酸鋅、硬脂酸、二氧化硅、氫化植物油或滑石)。用于口服使用的制劑也可呈可咀嚼片劑形式，或呈硬明膠膠囊形式，其中活性成分與惰性固體稀釋劑(例如，馬鈴薯淀粉、乳糖、微晶纖維素、碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土)混合，或呈軟明膠膠囊形式，其中活性成分與水或油介質(zhì)(例如，花生油、液體石蠟或橄欖油)混合。粉劑、顆粒劑及丸劑可以使用上文在片劑或膠囊下提到的成分以常規(guī)方式使用例如混合器、流化床設(shè)備或噴霧干燥設(shè)備來制備。

125、用于口服制劑的其他藥學(xué)上可接受的賦形劑包括但不限于著色劑、調(diào)味劑、增塑劑、保濕劑及緩沖劑。用于口服使用的制劑也可呈可咀嚼片劑形式，或呈硬明膠膠囊形式，其中活性成分與惰性固體稀釋劑(例如，馬鈴薯淀粉、乳糖、微晶纖維素、碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土)混合，或呈軟明膠膠囊形式，其中活性成分與水或油介質(zhì)(例如，花生油、液體石蠟或橄欖油)混合。粉劑、顆粒劑及丸劑可以使用上文在片劑或膠囊下提到的成分以常規(guī)方式使用例如混合器、流化床設(shè)備或噴霧干燥設(shè)備來制備。

126、所述注射制劑包括注射溶液、注射乳液、凍干劑、混懸注射劑等。注射制劑的輔料包括注射用水和至少一種增溶劑。所述增溶劑包括吐溫80、乙醇、丙二醇、聚乙二醇400中的至少一種。優(yōu)選地，所述增溶劑為吐溫80或聚乙二醇400。注射制劑也包括但不僅限于蛋白納米粒、環(huán)糊精包含物、脂質(zhì)體、微球、儲(chǔ)庫型控釋注射劑或無針注射釋藥系統(tǒng)。

127、組合治療

128、本發(fā)明所涉及的核酸元件、重組載體、重組細(xì)胞，以及包含其的藥物組合物，可以和其他藥物進(jìn)行組合治療。以抗衰老治療為例，啟始階段重編程也可以聯(lián)合蛋白治療，例如聯(lián)合b18r蛋白，進(jìn)行抗衰老治療。

129、有益效果

130、細(xì)胞年輕化在重編程的早期就發(fā)生，而體細(xì)胞身份特征的丟失在重編程的中后期才發(fā)生，因此這里存在一個(gè)時(shí)間窗口，使得細(xì)胞年輕化的同時(shí)又能保持細(xì)胞原本的身份特征，這是部分重編程使細(xì)胞年輕化的技術(shù)原理。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子失去相分離能力后，反而難以使重編程進(jìn)入成熟階段，從而滯留在啟始階段，使得細(xì)胞沒有細(xì)胞身份丟失(lossof?cell?identity)，因此會(huì)提高細(xì)胞年輕化程度的同時(shí)，有降低了生成ipsc的風(fēng)險(xiǎn)，并不會(huì)完全重編程，因此稱為“啟始階段重編程”。通過功能基因的表型進(jìn)行判斷，確保細(xì)胞重編程階段的驗(yàn)證，證明了細(xì)胞達(dá)到了年輕化的技術(shù)效果。

131、臨床上，隨著細(xì)胞衰老，細(xì)胞本身的功能逐漸下調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致組織、器官以及系統(tǒng)層面發(fā)生衰老和紊亂。大量與年齡相關(guān)的疾病，包括但不限于神經(jīng)退行性疾病，心血管和周圍血管疾病，眼部疾病，皮膚病，自身免疫性疾病，代謝功能障礙，肌肉骨骼疾病，消化系統(tǒng)疾病，細(xì)胞增殖相關(guān)的病癥以及腫瘤等，其根本原因即相關(guān)組織和器官的衰老和失調(diào)。通過對于特定組織和器官的細(xì)胞年輕化治療，能夠有效的緩解和治療相關(guān)疾病，為廣大人民造福。同時(shí)對健康壽命的延長有利于大大提高社會(huì)生產(chǎn)力，緩解醫(yī)療需求和壓力，為老齡化社會(huì)創(chuàng)造新的財(cái)富。