本技術(shù)涉及重組腺相關(guān)病毒載體，特別是涉及一種重組腺相關(guān)病毒載體及方法、應用。

背景技術(shù)：

1、腺相關(guān)病毒(adeno-associated?virus，簡稱aav)屬于細小病毒科依賴病毒屬，無包膜，由直徑約為22nm的二十面體蛋白質(zhì)衣殼和約4.7kb的線性單鏈dna基因組組成。它的生命周期依賴輔助病毒，在腺病毒或者皰疹病毒等輔助病毒存在下，aav才能在宿主細胞中進行自我復制?！癮av”是腺相關(guān)病毒的縮寫，并且可用于指病毒本身或其衍生物，包括1型aav(aav1)、2型aav(aav2)、3型aav(aav3)、4型aav(aav4)、5型aav(aav5)、6型aav(aav6)、7型aav(aav7)、8型aav(aav8)、9型aav(aav9)、禽aav、牛aav、犬a(chǎn)av、馬aav、靈長類aav、非靈長類aav和羊aav。“靈長類aav”指感染靈長類動物的aav，“非靈長類aav”指感染非靈長類哺乳動物的aav，“牛aav”指感染牛哺乳動物的aav等。

2、野生型aav感染人宿主細胞后，可以整合到人類19號染色體的aavs1位點(19q13.4)，但aav不會引起人類疾病。aav的基因組約為4.7kb的線性單鏈dna，包括上下游兩個開放讀碼框，rep和cap，以及由145個核苷酸組成的2個反向末端重復序列(itr)。正鏈和負鏈都有相同的概率被包裝到aav病毒顆粒中。已證實aav可以感染多種視網(wǎng)膜細胞，包括光感受器細胞、視網(wǎng)膜色素上皮細胞(rpe)、müller細胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞和角膜內(nèi)皮細胞。

3、在治療眼疾方面，基因療法有顯著優(yōu)勢，這是由眼疾的遺傳基礎(chǔ)和眼部隔室的獨特性所決定的。由于眼睛的解剖結(jié)構(gòu)明確，物理空間封閉有限，這為局部給藥提供了獨特優(yōu)勢。血眼屏障有助于眼部免疫特權(quán)，針對基因治療產(chǎn)品的免疫反應有限。而且，眼睛的視網(wǎng)膜細胞不再進行分裂，可允許持續(xù)的基因表達且不會整合入基因組。最主要的是一系列眼部疾病(包括遺傳性失明)的潛在遺傳因素已被鑒定出來。此外，近來相關(guān)動物模型的開發(fā)也讓眼科研究取得重大進展，有利于開展眼部基因治療試驗。重組腺相關(guān)病毒載體(raav)是眼部基因治療的主要載體，在治療性基因遞送中，aav單鏈脫氧核糖核酸(ssdna)基因組中編碼調(diào)節(jié)蛋白(rep)和結(jié)構(gòu)蛋白(cap)脫氧核糖核酸(dna)序列被所需的goi表達盒所替換，稱為重組腺相關(guān)病毒載體(raav)。

4、在過去的十年中，僅3種體內(nèi)基因療法獲得了批準：2012年歐洲的glybera，2017年和2019年美國的luxturna和zolgensma，且它們均使用aav作為載體，即野生型衣殼(aav1，aav2和aav9)。luxturna需要視網(wǎng)膜下注射，視網(wǎng)膜下注射是外科手術(shù)，需要全身麻醉，且需要住院。若通過玻璃體內(nèi)注射，普通的護士在幾分鐘內(nèi)就可以操作完成，方便且安全。視網(wǎng)膜色素上皮(rpe)是黃斑病變的主要組織靶點，大多數(shù)aav衣殼變體都不能有效轉(zhuǎn)導視網(wǎng)膜色素上皮細胞(rpe)，如最近已經(jīng)開發(fā)出幾種重組腺相關(guān)病毒載體，如aav2-quadyf+tv或aav2-7m8，它們主要轉(zhuǎn)導其他類型的細胞如光感受器(rgc)而不是視網(wǎng)膜色素上皮(rpe)。又如專利cn110724673b、cn109476707b以及wo2020219933a1中記載的具有變異衣殼的腺相關(guān)病毒病毒體，可成功轉(zhuǎn)導玻璃體腔注射后的rpe，但轉(zhuǎn)導率不夠高。除非通過視網(wǎng)膜下注射，這是一種昂貴且高風險的外科手術(shù)。視網(wǎng)膜下注射會導致一系列并發(fā)癥，加重機械損傷，導致視功能受損，并且手術(shù)操作困難，安全性低。玻璃體注射相對更安全和容易，但對視網(wǎng)膜色素上皮細胞(rpe)轉(zhuǎn)導率低，因此在治療靶向視網(wǎng)膜色素上皮細胞(rpe)的疾病如黃斑病變中使用率有限。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、基于此，有必要提供一種能夠提高視網(wǎng)膜色素上皮細胞(rpe)轉(zhuǎn)導率的重組腺相關(guān)病毒載體，用于制備治療視網(wǎng)膜病的藥物。

2、本技術(shù)的第一個方面，提供了一種腺相關(guān)病毒變體衣殼蛋白，包含vp1、vp2和vp3衣殼；

3、其中，相較于天然aav5衣殼蛋白，所述腺相關(guān)病毒變體衣殼蛋白具有至少80％同一性的序列，所述vp3衣殼區(qū)域具有以下至少一個突變：

4、t376、e377、n378、s518、a581、n694、d695、q697和t706；或/和，

5、相較于aav2.5t衣殼蛋白，所述腺相關(guān)病毒變體衣殼蛋白具有至少80％同一性的序列，所述vp3衣殼區(qū)域具有以下至少一個突變：

6、t377、e378、n379、s519、n695、d696、q698和t707。

7、在其中一個實施例中，相較于天然aav5衣殼蛋白，所述vp3衣殼區(qū)域具有以下至少一個突變：

8、t376e、e377k、n378h、s518k、a581t、n694s、d695e、q697e和t706a。

9、在其中一個實施例中，相較于天然aav5衣殼蛋白，所述vp3衣殼區(qū)域具有以下突變：

10、t376e、e377k、n378h、s518k、a581t、n694s、d695e、q697e和t706a。

11、在其中一個實施例中，相較于aav2.5t，所述vp3衣殼區(qū)域具有以下至少一個突變：

12、t377e、e378k、n379h、s519k、n695s、d696e、q698t和t707a。

13、在其中一個實施例中，相較于aav2.5t衣殼蛋白，所述vp3衣殼區(qū)域具有以下突變：

14、t377e、e378k、n379h、s519k、n695s、d696e、q698t和t707a。

15、本技術(shù)的第二個方面，提供了一種腺相關(guān)病毒變體衣殼蛋白，包含vp1、vp2和vp3衣殼；

16、其中，相較于天然aav5衣殼蛋白，所述腺相關(guān)病毒變體衣殼蛋白具有至少80％同一性的序列，所述vp3衣殼區(qū)域中的以下片段中至少一個片段具有突變：

17、ntenp、qgsnt、apatg、yndpq和dstge；或/和，

18、相較于aav2.5t衣殼蛋白，所述腺相關(guān)病毒變體衣殼蛋白具有至少80％同一性的序列，所述vp3衣殼區(qū)域中的以下片段中至少一個片段具有突變：

19、ntenp、qgsnt、yndpq和dstge。

20、在其中一個實施例中，相較于天然aav5衣殼蛋白，所述vp3衣殼區(qū)域中的以下片段中分別至少有一個氨基酸發(fā)生突變：

21、ntenp、qgsnt、apatg、yndpq和dstge。

22、在其中一個實施例中，相較于aav2.5t衣殼蛋白，所述vp3衣殼區(qū)域中的以下片段中分別至少有一個氨基酸發(fā)生突變：

23、ntenp、qgsnt、yndpq和dstge。

24、在其中一個實施例中，所述vp1衣殼和/或vp2衣殼的獨特區(qū)域來源于以下aav中的一個：aav1、aav2、aav3b、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav13、牛aav、aav2.5t和aav-lk03。

25、本技術(shù)的第三個方面，提供了一種核酸，包含編碼所述的腺相關(guān)病毒變體衣殼蛋白的核苷酸片段。

26、在其中一個實施例中，所述核酸片段的序列如seq?id?no:3所示。

27、本技術(shù)的第四個方面，提供了一種重組質(zhì)粒載體，包含所述的編碼腺相關(guān)病毒變體衣殼蛋白的核酸；

28、可選地，還包括參與病毒復制的基因。

29、本技術(shù)的第五個方面，提供了一種病毒包裝系統(tǒng)，包含所述的重組質(zhì)粒載體以及phelper質(zhì)粒。

30、本技術(shù)的第六個方面，提供了一種重組腺相關(guān)病毒載體，所述重組腺相關(guān)病毒載體具有所述的腺相關(guān)病毒變體衣殼蛋白，或者所述重組腺相關(guān)病毒載體由所述的病毒包裝系統(tǒng)在宿主細胞內(nèi)包裝而成。

31、本技術(shù)的第七個方面，提供了一種重組腺相關(guān)病毒載體的制備方法，包括如下步驟：

32、使用所述的病毒包裝系統(tǒng)轉(zhuǎn)染宿主細胞，制備重組腺相關(guān)病毒載體。

33、在其中一個實施例中，所述宿主細胞選自293細胞、hela細胞和sf9細胞中的一種。

34、本技術(shù)的第八個方面，提供了一種藥物組合物，包含所述的重組腺相關(guān)病毒載體。

35、本技術(shù)的第九個方面，提供了所述重組腺相關(guān)病毒載體在制備用于治療視網(wǎng)膜病的藥物中的應用；可選地，所述視網(wǎng)膜病為黃斑病。

36、與傳統(tǒng)的技術(shù)相比，本技術(shù)還具有如下有益效果：

37、本技術(shù)通過對編碼aav病毒衣殼進行氨基酸定點突變，制備了一種腺相關(guān)病毒變體衣殼蛋白，通過該腺相關(guān)病毒變體衣殼蛋白制備獲得了一種能高效轉(zhuǎn)導視網(wǎng)膜色素上皮細胞(rpe)的腺相關(guān)病毒突變載體。將所述重組腺相關(guān)病毒載體直接注入小鼠玻璃體腔，提高了rpe轉(zhuǎn)導率，對于視網(wǎng)膜色素上皮細胞病變的基因治療具有重要的意義。