本申請是申請日為2016-08-18，申請?zhí)枮?01610687850.2，發(fā)明名稱為“一種用于抑制靶基因mrna表達的寡核酸分子及其成套組合物”的發(fā)明專利申請的分案申請。本發(fā)明涉及分子生物學領域，尤其涉及一種用于抑制靶基因mrna表達的寡核酸分子及其成套組合物。
背景技術：
：自andrewfire和craigmello等人1998年在線蟲(caenorhabditiselegans)中首次發(fā)現(xiàn)rnai現(xiàn)象，tuschl和philsharp等人2001年證實在哺乳動物中也存在rnai之后，關于rnai的機制原理、基因功能和臨床應用等研究取得了一系列的進展。rnai不僅在防御病毒感染，防轉座子跳躍等多種機體保護機制中發(fā)揮關鍵作用(huntvagneretal,2001；tuschl,2001；waterhouseetal,2001；zamore2001)，其相關產(chǎn)品也是十分有前景的候選藥物。elbashir等人在2001年發(fā)現(xiàn)sirna抑制哺乳動物細胞中特異基因的沉默，研究表明sirna可特異的同序列互補的靶mrna結合，并使其降解。長片段的雙鏈rna被dicer酶切割成21-23個堿基長度短片段rna，其中兩條鏈中同靶mrna結合的鏈稱為反義鏈或引導鏈，另一條鏈稱為正義鏈或過客鏈。研究發(fā)現(xiàn)體外化學合成的sirna進入細胞后也同樣發(fā)揮rnai作用，而且有效降低了長鏈rna引起的免疫反應。但由于sirna的有效性受序列特異性，靶細胞特異性、靶點等多種因素影響，基于現(xiàn)有設計原則獲得的sirna并不是每個都能達到有效的沉默效果；一般設計的sirna約有50％以上具有沉默靶mrna的效果，僅25％的sirna具有75％以上的沉默效果，因此后續(xù)對設計合成的sirna還需要實驗驗證、篩選或優(yōu)化，費時耗力；基于此，一種通用、高效、快速的rnai技術與產(chǎn)品亟待開發(fā)。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個目的是提供一種抑制或降低birc5靶基因表達的sirna。本發(fā)明提供的sirna，由正義鏈和與其反向互補(完全反向互補)的反義鏈組成；所述正義鏈由19-27個核苷酸組成，且所述正義鏈從5’末端起5-9個連續(xù)核苷酸和從3’末端起5-9個連續(xù)核苷酸均進行2＇-o-核糖修飾。所述反義鏈與所述靶基因上的區(qū)段反向互補，所述靶基因為birc5；所述正義鏈的堿基組成序列選自seqidno.1,seqidno.3,seqidno.5,seqidno.7,seqidno.13；所述反義鏈的堿基組成序列選自seqidno.2,seqidno.4,seqidno.6,seqidno.8,seqidno.14。sirna通過其反義鏈與靶基因上的靶序列反向互補結合；在發(fā)明的一些實施例中,sirna分子中至少包括一個非天然的核苷酸，如經(jīng)化學修飾的核苷酸，優(yōu)選在正義鏈或正義區(qū)的化學修飾。在一些實施例中，核糖的2＇-o-核糖修飾具體為2＇-o-甲基修飾，2＇-o-氟代修飾，2＇-moe修飾。本發(fā)明的正義鏈修飾可起到：(1)增強sirna分子穩(wěn)定性；(2)減少sirna分子脫靶性；(3)提高sirna分子特異性；(4)減少免疫激活反應等作用。上述sirna中，所述正義鏈由24、25或26個核苷酸組成；或，所述正義鏈從5’末端起6或7或8個連續(xù)核苷酸和從3’末端起6或7或8個連續(xù)核苷酸均進行2＇-o-核糖修飾。上述sirna中，所述2＇-o-核糖修飾為2＇-o-甲基(2＇-o-me)修飾、2＇-o-氟代修飾、或2＇-moe修飾。本發(fā)明另一個目的是提供一種抑制或降低靶基因表達的成套sirna。本發(fā)明提供的成套sirna，包括至少5個上述的sirna。每個sirna對應同一靶基因的不同靶序列。上述成套sirna中，所述成套sirna由5、6、7、8、9或10個sirna組成。上述成套sirna中，所述成套sirna中單個sirna分子的物質的量可以是隨機的，任2個sirna的物質的量比為1:1-1:5；優(yōu)選單個sirna分子的物質的量相等1:1。本發(fā)明另一個目的是提供另一種如下1)或2)物質。本發(fā)明提供的1)或2)物質：1)抑制或降低靶基因表達的試劑，其為如下a或b：a包括上述的sirna和轉染試劑；b包括上述成套sirna和轉染試劑；2)抑制或降低靶基因表達的試劑盒，其包括上述sirna或上述的成套sirna或所述試劑。上述物質中，所述成套sirna中所有sirna分子在所述試劑中的總濃度為2-100nm；每個sirna分子在所述試劑中的濃度均為10-20nm；上述sirna或上述的成套sirna或上述的物質在抑制或降低靶基因表達中的應用也是本發(fā)明保護的范圍；或上述sirna或上述的成套sirna或上述的物質在抑制或降低細胞中靶基因表達中的應用也是本發(fā)明保護的范圍；或上述sirna或上述的成套sirna或上述的物質在制備抑制或降低靶基因表達產(chǎn)品中的應用也是本發(fā)明保護的范圍；或上述sirna或上述的成套sirna或上述的物質在制備抑制或降低細胞中靶基因表達中產(chǎn)品的應用也是本發(fā)明保護的范圍；或上述sirna或上述的成套sirna或上述的物質在制備預防或緩解或治療由靶基因表達引起的疾病中的產(chǎn)品中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：將抑制或降低靶基因表達的sirna的正義鏈從5’末端起5-9個連續(xù)核苷酸和從3’末端起5-9個連續(xù)核苷酸均進行2＇-o-核糖修飾；所述sirna由正義鏈和與其反向互補的反義鏈組成；所述正義鏈由19-27個核苷酸組成；所述反義鏈與所述靶基因上的區(qū)段反向互補?；蛩?＇-o-核糖修飾具體為2＇-o-甲基修飾、2＇-o-氟代修飾、或2＇-moe修飾。本發(fā)明第四個目的是提供一種產(chǎn)品。本發(fā)明提供的產(chǎn)品，包括上述sirna或上述的成套sirna或上述的物質；和/或，所述產(chǎn)品具有如下1)-3)中至少一種功能：1)抑制或降低靶基因表達；2)抑制或降低細胞中靶基因表達；3)預防或緩解或治療由靶基因表達引起的疾病。上述中，所述靶基因為腫瘤、癌癥、心血管疾病、炎癥、傳染病或罕見病相關基因；或，所述腫瘤、癌癥、心血管疾病、炎癥、傳染病或罕見病相關基因具體為birc5；所述細胞具體為脊椎動物細胞、哺乳類動物細胞、靈長類動物細胞、人類細胞；或，靶基因異常表達的(表達水平高于正常受試者)或有基因缺陷的(如染色體異?；蚧蛲蛔?的癌細胞、腫瘤細胞、炎性細胞、血液細胞、白細胞、腦細胞、肝細胞、肺細胞、腎細胞、乳腺細胞、宮頸細胞、內皮細胞、神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質細胞；或，所述細胞具體為hela、293t、a549或huvec細胞；或，所述產(chǎn)品具體為藥物。上述靶基因可以是腫瘤或癌癥相關基因，優(yōu)選birc5基因。上述靶基因對應的sirna如下：靶基因為birc5，其對應的成套sirna為rb-bir-d1、rb-bir-d2、rb-bir-d3、rb-bir-d4、rb-bir-d5、rb-bir-d6、rb-bir-d7中至少6個。本發(fā)明還包括一種降低細胞中靶基因表達的方法，所述方法包括使用上述的混合物，方法包括a)獲得sirna分子或其混合物，所述sirna分子混合物至少包括5,6,7,8,9,10個sirna；b)將sirna分子混合物遞送進細胞。sirna分子混合物(成套sirna)中本發(fā)明是通過向細胞引入sirna分子或其混合物，抑制靶基因的表達；引入可以為直接引入或間接引入，除使用轉染試劑外，其他已知的各種將sirna分子遞送如細胞的方式都可采用，如注射、載體轉染(載體可以是質?；虿《?、電穿孔，脂質體轉染等?！盎パa”是指核堿基之間配對的能力。本發(fā)明中也可用堿基或堿基長度來表示核苷酸或rna分子鏈的長度。本發(fā)明的sirna分子的耐受錯配為至少1-5個核苷酸，其優(yōu)選耐受位置在單鏈或雙鏈末端，耐受的堿基個數(shù)受互補區(qū)長度的影響?！板e配”是指核堿基不能配對。sirna分子混合物優(yōu)選固相合成法獲得，也可通過轉錄法或其他方法合成。本發(fā)明的試劑盒除sirna分子和/或sirna分子混合物外，還可包括緩沖液、標記物(標記物可以是染料、放射性標記物質或熒光標記物質，標記的位置可以在反義鏈或正義鏈末端)，轉染試劑，容器，試管，退火試劑，對照sirna(包括nc對照，n對照)等；試劑盒中的sirna分子混合物可以按單個分裝也可組合后放放置在一個容器中；試劑盒成分可以是凍干粉或溶液。本發(fā)明的實驗證明，單個的sirna分子穩(wěn)定性好，一方面提升了體外或體內抑制試驗中對核酸酶的抗性；另一方面有利于儲存和運輸；同時降低了sirna分子的脫靶效應。成套sirna更是一種通用、有效、快速的rnai工具，其優(yōu)勢在于：(1)能確保60％以上的抑制率，75％以上的sirna分子混合物能達到75％以上的抑制率，50％以上的sirna分子混合物能達到85％以上的抑制率，相對于單個sirna分子，整體提高了沉默的機率與沉默的效率；在現(xiàn)有技術中，一般設計的sirna僅有50％的概率能抑制靶基因表達，僅25％的sirna能達到75％以上的抑制率。(2)不需特殊設計，后續(xù)不需對sirna進行篩選、優(yōu)化，或對其效果進行實驗驗證，省時省力。(3)解決了在不同細胞系中、不同轉染試劑處理時，sirna作用不一致的問題，可在多個細胞系中有效沉默靶基因，且不受轉染試劑的影響。(4)增強了單個sirna分子的基因沉默效果，起到了協(xié)同增效的作用。(5)降低了sirna分子的脫靶效應。本發(fā)明中sirna分子混合物可以影響至少50％,55％，60％,65％70％,75％，80％,85％，90％的細胞中靶基因的表達，抑制率至少為45％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％。本發(fā)明的sirna分子混合物在不同細胞系中、不同轉染試劑處理時可以確保至少60％的靶基因抑制效果。本發(fā)明的“抑制”或類似表達可指rna或蛋白水平或相關生化指標的表達、活性或指標相對陰性對照的降低。附圖說明圖1為sirna體外穩(wěn)定性測定結果。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、sirna的制備設計的所有單個sirna均能靶向靶基因的所有轉錄本,設計方法參照elbashiretal.2002；paddisonetal.2002；reynoldsetal.2004；ui-teietal.2004等人的方法(elbashir,s.m.,harborth,j.,weber,k.,andtuschl,t.2002.analysisofgenefunctioninsomaticmammaliancellsusingsmallinterferingrnas.methods26:199–213；paddison,p.j.,caudy,a.a.,bernstein,e.,hannon,g.j.,andconklin,d.s.2002.shorthairpinrnas(shrnas)inducesequence-specificsilencinginmammaliancells.genes&dev.16:948–958；reynolds,a.,leake,d.,boese,q.,scaringe,s.,marshall,w.s.,andkhvorova,a.2004.rationalsirnadesignforrnainterference.nat.biotechnol.22:326–330；ui-tei,k.,naito,y.,takahashi,f.,haraguchi,t.,ohki-hamazaki,h.,juni,a.,ueda,r.,andsaigo,k.2004.guidelinesfortheselectionofhighlyeffectivesirnasequencesformammalianandchickrnainterference.nucleicacidsres.32:936–948)；為保證sirna的特異性，使用blast(basiclocalalignmentsearchtoo，http://www.ncbi.nlm.gov))分析序列同一性(identity)，選擇與其他序列同一性最小的序列。sirna由25個核苷酸組成的ss正義鏈和與其反向互補的反義鏈as組成，且為平末端；每個sirna通過其反義鏈與所述靶基因上的靶序列反向互補結合；as鏈和ss鏈完全反向互補，as鏈與靶基因上的靶序列完全反向互補，ss的從5’末端起7個連續(xù)核苷酸和從3’末端起7個連續(xù)核苷酸均經(jīng)過2＇-o-me修飾。靶基因如表1所示，靶基因對應的sirna具體序列如表2所示。表1為靶基因表2為sirna分子序列表上述表中，ma、mu、mc和mg分別為2＇-o-me修飾后a、2＇-o-me修飾后u、2＇-o-me修飾后c和2＇-o-me修飾后g。實施例2、sirna細胞水平抑制試驗將實施例1制備的表2所示的birc5靶基因對應的sirna分別單獨轉染hela細胞(來源于atcc)，具體如下：1、lf2k轉染100μllf2k轉染體系：1μllf2k(invitrogen，11668019)，5μlsirna(終濃度為100nm)和94μlopti-mem細胞培養(yǎng)基(thermofisherscientific，31985070)。上述sirna分別為實施例1制備的tp53、birc5、ctnnb1、cops5、stat3、vegfa、kras靶基因對應的sirna。在細胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)hela細胞，再向每個孔中加入上述100μl轉染體系，轉染48h，得到轉染不同靶基因對應sirna的細胞。2、rt-pcr檢測抑制率轉染48h后，收集轉染不同靶基因對應sirna的細胞，trizol法提取rna，reversetranscriptionmix反轉錄試劑盒用于反轉錄(廣州市銳博生物科技有限公司，c10170)，得到轉染不同靶基因對應sirna的細胞的cdna。以cdna為模板，用表3所示的sirna對應的靶基因的引物對進行rt-pcr擴增，以人的看家基因actin作為內參基因(forward:5-tcaagatcattgctcctcctgag-3(seqidno.15)；reverse:5-acatctgctggaaggtggaca-3seqidno.16))，利用real-timepcr試劑盒sybrpremix(2×)(bio-rad750000131)進行實時熒光定量pcr反應。一個樣品的9個重復(每個單獨的樣品在轉染時有3個重復，在qpcr時每個重復做3個復孔)的ct誤差在±0.5，然后用cfx2.1進行相對定量分析。spss19.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件數(shù)據(jù)分析，表中數(shù)據(jù)為其平均值，p值均<0.05。nc陰性對照組：轉染的sirna為無關非特異sirna，5'uucuccgaacgugucacgudtdt3'(seqidno.17)5'acgugacacguucggagaadtdt3'；(seqidno.18)n空白對照組：正常細胞，無sirna轉染。real-timepcr抑制率計算方式：抑制率＝nc陰性對照組mrna相對表達水平-sirna組的mrna相對表達水平nc陰性對照組mrna相對表達水平nc陰性對照組mrna的相對表達水平為1。表3為引物序列結果如表4所示，可以看出，針對birc5靶基因，設計的sirna均起到了抑制靶基因表達的作用。表4為hela細胞中單個sirna的抑制率比較上述表中的d1-d7分別為針對birc5靶基因的7個sirna。實施例3、成套sirna的制備1、設計原則成套sirna由5-10個sirna分子組成；每個sirna由25個核苷酸組成的ss正義鏈和與其反向互補的反義鏈as組成，且為平末端；每個sirna通過其反義鏈與靶基因上的靶序列互補結合；as鏈和ss鏈完全反向互補，as鏈與靶基因上的靶序列完全反向互補，ss的從5’末端起7個連續(xù)核苷酸和從3’末端起7個連續(xù)核苷酸均經(jīng)過2＇-o-me修飾。靶基因如表1所示，靶基因對應的sirna如表2所示。靶基因的成套sirna可以包括5、6、7或10個sirna，分組情況如表5所示。表5靶基因的成套sirna組成分別將上述成套sirna組rm-2(7個sirna混合)、rm-3(6個sirna混合)、中的每個sirna按照表5所示的分組要求混合，且各個sirna為等摩爾比混合。實施例4、成套sirna抑制靶基因表達的研究下面的實施例用表5中的成套sirna組rm-2(7個sirna混合)為例進行實驗：一、成套sirna組rm-2與單個sirna分子對hela細胞中靶基因抑制率比較將實施例3中表5所示的birc5靶基因對應的成套sirna組rm-2分別轉染hela細胞，方法與實施例2相同，其中，rm-2混合物中所有sirna分子的總濃度為100nm，且每個sirna分子為等的物質的量混合。以轉染單個sirna分子為對照，其中，單個sirna分子的濃度為100nm。成套sirna組rm-2抑制率和單個sirna抑制率結果如表6所示，可以看出，針對7個靶基因，成套sirna組rm-2抑制效果均大于90％；且成套sirna組rm-2與其相同濃度的7個單個sirna分子相比，起到了協(xié)同增效的作用。表6hela細胞中rm-2與單個sirna的比較基因rm-2d1d2d3d4d5d6d7birc59390929173191750上述表中的d1-d7分別為birc5靶基因對應的7個sirna,rm-2為每個靶基因對應的7個sirna的混合樣品。二、不同細胞系中成套sirnarm-2的抑制效果比較將實施例3中表5所示的birc5靶基因對應的成套sirna組rm-2分別轉染4種不同的細胞系(人胚腎細胞293t,宮頸癌細胞hela,非小細胞肺癌細胞a549與人臍靜脈內皮細胞huvec(均來源于atcc)接種培養(yǎng)24h后觀察細胞，狀態(tài)良好開始轉染。1、轉染(1)50μlribofect轉染體系，5μlribofecttmcpreagent(廣州市銳博生物科技有限公司，c10511-05)，5μl實施例3制備的成套sirna組rm-2(所有sirna的總濃度為100nm)和40μlribofecttmcpbuffer(廣州市銳博生物科技有限公司，c10511-05)。(2)100μllf2k轉染體系：1μllf2k(invitrogen，11668019)，5μl實施例3制備的成套sirna組rm-2(所有sirna的總終濃度為100nm)和94μlopti-mem細胞培養(yǎng)基(thermofisherscientific，31985070)。將4種不同的細胞系培養(yǎng)板的每個孔中分別加入上述50μlribofect轉染體系或100μllf2k轉染體系，轉染48h后收集細胞，trizol法提取rna，reversetranscriptionmix反轉錄試劑盒用于反轉錄(廣州市銳博生物科技有限公司，c10170)得到cdna。2、rt-pcr檢測抑制率方法與實施例2相同。結果如表7所示，相對nc對照，針對不同的靶基因，在不同的細胞系中，使用不同的轉染試劑，rm-2混合物均能達到60％以上的抑制效果。表7不同細胞系中rm-2的抑制率比較(％)三、hela細胞中rm-2混合物與通常結構的sirna分子的混合物抑制結果比較選取sod1、eif4e兩個靶基因，比較其對應的rm-2混合物與通常結構的sirna分子的混合物在hela細胞中抑制效果。上述各基因的通常結構sirna的核苷酸序列與實施例3制備的各基因對應的rm-2不同的是通常結構sirna中每個核苷酸均沒有2′-o-me修飾，長度為19bp(分別去掉正義鏈5’端的6個核苷酸和反義鏈3’端的6個核苷酸),末端有2個dtdt懸垂，其余均相同。方法與上述一相同，不同的是將實施例3制備的sod1、eif4e對應的成套sirna組rm-2轉染hela細胞(m)。以轉染sod1、eif4e對應的通常結構的sirna分子的混合物為對照(s)。轉染試劑為lf2k。上述轉染中，sirna的總濃度為100nm。結果如表8所示，針2個靶基因，rm-2結構的混合物的抑制效果優(yōu)于通常結構的sirna分子的混合物。表8hela細胞中rm-2修飾結果比較四、不同組的成套sirna轉染hela細胞的抑制效果比較選取sod1、myc這2個靶基因，比較不同成套sirna組在hela細胞中抑制效果。方法與上述一相同，不同的是將實施例3制備的sod1、myc對應的成套sirna組rm-2、rm-3和rm-6分別轉染hela細胞。轉染試劑為lf2k。結果如表9所示，表9不同sirna條數(shù)混合而成的sirnas混合物結果表明，混合物rm-1，rm-3，rm-2，rm-6均能起到高效抑制多種基因的作用。實施例5、體外穩(wěn)定性測定將各sirnarb-kra-d1、rb-tp5-d6、rb-eif-d3經(jīng)無rna酶水稀釋至5μm后加入等體積的新鮮大鼠血清(為上海遠慕生物科技有限公司產(chǎn)品),然后在37℃孵育6小時后取樣進行電泳觀察不同sirna的完整性。結果如圖1所示，看出，sirna在血清中穩(wěn)定，預計其在體內具有更好的效力。其它sirna的穩(wěn)定性測定實驗結果相同，具體圖省略。所述實施例的各技術特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術特征的組合不存在矛盾，都應當認為是本說明書記載的范圍。以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。序列表<110>廣州市銳博生物科技有限公司<120>用于抑制birc5靶基因mrna表達的寡核酸分子及其成套組合物<130>1<160>20<170>patentinversion3.5<210>1<211>25<212>rna<213>人工序列<220><223><400>1gaccaccgcaucucuacauucaaga25<210>2<211>25<212>rna<213>人工序列<220><223><400>2ucuugaauguagagaugcggugguc25<210>3<211>25<212>rna<213>人工序列<220><223><400>3ccagacuuggcccaguguuucuucu25<210>4<211>25<212>rna<213>人工序列<220><223><400>4agaagaaacacugggccaagucugg25<210>5<211>25<212>rna<213>人工序列<220><223><400>5gcaaaggaaaccaacaauaagaaga25<210>6<211>25<212>rna<213>人工序列<220><223><400>6ucuucuuauuguugguuuccuuugc25<210>7<211>25<212>rna<213>人工序列<220><223><400>7agaauuugaggaaacugcggagaaa25<210>8<211>25<212>rna<213>人工序列<220><223><400>8uuucuccgcaguuuccucaaauucu25<210>9<211>25<212>rna<213>人工序列<220><223><400>9cacagugaaugugucuggaccucau25<210>10<211>25<212>rna<213>人工序列<220><223><400>10augagguccagacacauucacugug25<210>11<211>25<212>rna<213>人工序列<220><223><400>11ccucuguacucaucuaagcugcuua25<210>12<211>25<212>rna<213>人工序列<220><223><400>12uaagcagcuuagaugaguacagagg25<210>13<211>25<212>rna<213>人工序列<220><223><400>13caaccgccuagacuuucuuucagau25<210>14<211>25<212>rna<213>人工序列<220><223><400>14aucugaaagaaagucuaggcgguug25<210>15<211>23<212>rna<213>人工序列<220><223><400>15tcaagatcattgctcctcctgag23<210>16<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223><400>16acatctgctggaaggtggaca21<210>17<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223><400>17uucuccgaacgugucacgutt21<210>18<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223><400>18acgugacacguucggagaatt21<210>19<211>20<212>rna<213>人工序列<220><223><400>19agaactggcccttcttggag20<210>20<211>20<212>rna<213>人工序列<220><223><400>20agaactggcccttcttggag20當前第1頁12