本發(fā)明涉及從胎盤中分離干細(xì)胞的方法，特別涉及從胎盤中分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，更特別的是涉及一種使用本發(fā)明所述獨(dú)特配方的消化酶組合物從而從胎盤分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。使用本發(fā)明方法可以有效的提高從胎盤分離間充質(zhì)干細(xì)胞的效率。

背景技術(shù)：

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcell，msc)例如人類的間充質(zhì)干細(xì)胞最早是從骨髓中分離出來的，來源于中胚層的一類具有多向分化潛能和自我更新能力的組織干細(xì)胞，在體內(nèi)和體外特定條件下具有向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌細(xì)胞、肝細(xì)胞等多種成體細(xì)胞分化的能力(caplanai.mesenchymalstemcells.jorthopres.1991,9:641-650.pittengermf,mackayam,becksc,etal.multilineagepotentialofadulthumanmesenchymalstemcells.science.1999；284:143-147)。最新的研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)和造血支持作用，而且易于外源基因?qū)氡磉_(dá)。因此間充質(zhì)干細(xì)胞不但是組織工程化骨、軟骨和心肌構(gòu)建中的種子細(xì)胞，基因治療中重要的載體細(xì)胞，而且由于間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)造血重建和抑制移植物抗宿主反應(yīng)功能，在造血干細(xì)胞移植和器官移植中具有廣泛的應(yīng)用前景。間充質(zhì)干細(xì)胞具有體外貼壁生長的特性，利用這種特性，人們已經(jīng)成功從肝臟、腎臟、胰腺、肌肉、軟骨、皮膚、外周血等多種組織中分離培養(yǎng)出間充質(zhì)干細(xì)胞。

目前所報(bào)道的間充質(zhì)干細(xì)胞主要來源于骨髓，采用密度梯度離心法獲得。雖然分離方法簡便，但供者取髓需要經(jīng)歷一個(gè)比較痛苦的手術(shù)，并在取材過程中及取材后會(huì)有很高的感染機(jī)會(huì)；由于人體骨髓中msc的含量極其稀少，每10⁵～10⁶個(gè)單個(gè)核細(xì)胞中大約只有1個(gè)，而且隨著年齡的增加，骨髓中間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量、增殖和分化能力均顯著下降，使其在研究和應(yīng)用尤其是臨床應(yīng)用中受到限制。起源于胚胎發(fā)育期胚外中胚層的胎盤是由間質(zhì)、血管及滋養(yǎng)細(xì)胞組成，含有大量的間充質(zhì)成分。最新的研究表明胎盤中含有豐富的干細(xì)胞，從胎盤中分離培養(yǎng)出這些多能干細(xì)胞將為實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用開辟一個(gè)嶄新而豐富的來源。

現(xiàn)有的從胎盤中分離干細(xì)胞從而建立胎盤干細(xì)胞庫的方法尚有諸多缺點(diǎn)，例如純度不足、和/或數(shù)量不高，進(jìn)而顯示出這些方法尚不能滿足人們的期待。例如cn101270349a(中國專利申請?zhí)?00810061267.6，公開日2008年9月24日)公開的題為“胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分離和體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法”的發(fā)明；cn101693884a(中國專利申請?zhí)?00910117522.9，公開日2010年4月14日)公開的題為“一種從胎盤、臍帶或脂肪組織中分離提取干細(xì)胞的方法”的發(fā)明；cn102146359a(中國專利申請?zhí)?01110005964.1，公開日2011年8月10日)公開的題為“從胎盤中提取原始間充質(zhì)干細(xì)胞及無血清擴(kuò)增的方法”的發(fā)明。另外，中國專利申請?zhí)?01210044648x公開了一種從胎盤中分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。這些方法在提取物的純度和/或回收率方面是有待進(jìn)一步改善的。

本領(lǐng)域仍然需要有新的從胎盤中分離干細(xì)胞的方法，特別是高效地從胎盤中分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。此外，本領(lǐng)域仍然需要的新的用于從胎盤中分離間充質(zhì)干細(xì)胞方法中使用的消化酶組合物，以期提高從胎盤中分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法效率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有獲取胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞方法的不足，提供一種實(shí)用、簡單、高效的從胎盤中大量分離間充質(zhì)干細(xì)胞并任選地建立胎盤干細(xì)胞庫的方法。同時(shí)，本發(fā)明的另一目的在于為上述從胎盤中大量分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法提供一種消化酶組合物。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)采用特別的操作方法以及特別組方的消化酶組合物，所獲得的細(xì)胞純度高和/或細(xì)胞回收率高。本發(fā)明基于此發(fā)現(xiàn)而得以完成。

因此，本發(fā)明第一方面提供了從胎盤中分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟：

(a)取胎盤小葉，用pbs緩沖液充分沖洗，以去除胎盤中殘留的血液；

(b)將胎盤小葉剪成塊狀，加入含有組織消化酶的pbs緩沖液，再在37℃孵育消化；

(c)將組織塊用銅網(wǎng)過濾，必要時(shí)研磨以促使過濾；

(d)將收集的過濾液離心，分離單個(gè)核細(xì)胞，再用msc培養(yǎng)基懸浮所獲得的細(xì)胞，然后在37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

(e)待散在細(xì)胞形成克隆后，挑取各克隆細(xì)胞，用msc培養(yǎng)基分別培養(yǎng)，待細(xì)胞融合后，用胰酶消化傳代，即得胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞；

以及任選的下列一個(gè)或多個(gè)步驟：

(f)針對步驟(e)所得胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，檢測以下項(xiàng)目的至少一項(xiàng)：細(xì)胞活性、細(xì)胞污染、遺傳病、hla-abc/dr配型；

(g)將步驟(e)所得傳代后的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞于液氮中凍存；

(h)建立包含以上信息的胎盤干細(xì)胞的數(shù)據(jù)庫，并使該數(shù)據(jù)庫與步驟(g)的凍存細(xì)胞進(jìn)行關(guān)聯(lián)。

根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述步驟(a)是在無菌條件下將胎盤小葉剪下，用pbs緩沖液充分沖洗胎盤小葉去除胎盤中殘留的血液。

根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述步驟(a)是在產(chǎn)后四小時(shí)之內(nèi)，在無菌條件下將胎盤小葉剪下，用含10％體積胎牛血清(fbs)的pbs緩沖液充分沖洗胎盤小葉去除胎盤小葉中殘留的血液。

根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述步驟(b)中的組織消化酶是選自下列的一種或多種：dispase、胰酶、脫氧核糖核酸酶i(dnasei)、膠原酶iv、透明質(zhì)酸酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述步驟(b)中的組織消化酶包括：dispase、胰酶、脫氧核糖核酸酶i(dnasei)、膠原酶iv、透明質(zhì)酸酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(b)中，所述pbs緩沖液中包含約0.1mg/mldispase(其亦稱中性蛋白酶或稱分散酶)、約0.25mg/ml胰酶、約0.25mg/mldnasei(其亦稱為脫氧核糖核酸酶i)、約1mg/ml膠原酶iv、和約1mg/ml透明質(zhì)酸酶。

根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(b)中所述含有組織消化酶的pbs緩沖液是在pbs緩沖液中包含：0.02mg/mldispase、0.05mg/ml胰酶、0.02mg/mldnasei、0.05mg/ml膠原酶iv、和0.2mg/ml透明質(zhì)酸酶。

根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(b)中所述含有組織消化酶的pbs緩沖液是在pbs緩沖液中包含：0.02mg/mldispase、0.05mg/ml胰酶、0.02mg/mldnasei、0.05mg/ml膠原酶iv、和0.2mg/ml透明質(zhì)酸酶以及0.2～0.5mg/ml谷氨酸鈉和2～5mg/ml甘露糖，例如該緩沖液中含有約0.2mg/ml、約0.3mg/ml、約0.4mg/ml、或約0.5mg/ml的谷氨酸鈉以及約2mg/ml、約3mg/ml、約4mg/ml、或約5mg/ml的甘露糖。當(dāng)然，該含有組織消化酶的pbs緩沖液所用的配液介質(zhì)是所述pbs緩沖液，即，所述含有組織消化酶的pbs緩沖液中還包含pbs緩沖液；盡管上述含有組織消化酶的pbs緩沖液組成中未提及，在此類情形中本領(lǐng)域通常也不用提及。已經(jīng)出人意料的發(fā)現(xiàn)，向含有組織消化酶的pbs緩沖液中同時(shí)添加少量谷氨酸鈉和甘露醇并大大減少另外五種組織消化酶的濃度，仍然能夠獲得優(yōu)異的效果，這將是具有極其重要意義的，原因在于五種消化酶的價(jià)格均非常昂貴而谷氨酸鈉和甘露醇極其便宜，可以大大降低方法學(xué)成本并且能獲得滿意的技術(shù)效果，例如，上述含有谷氨酸鈉和甘露糖的組合物，其成本大約是包含0.1mg/mldispase、0.25mg/ml胰酶、0.25mg/mldnasei、1mg/ml膠原酶iv、和1mg/ml透明質(zhì)酸酶且不含谷氨酸鈉和甘露糖的組合物成本的5％，并且可以使方法學(xué)總成本降低約90％。

根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(b)中，在37℃孵育10～30分鐘，優(yōu)選10～20分鐘，例如10分鐘、15分鐘或20分鐘。

根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(b)中，將胎盤小葉剪成約1cm³大小的組織塊。

根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(c)中，將組織塊用銅網(wǎng)過濾同時(shí)用注射器研磨。在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(c)中，將組織塊和細(xì)胞懸液一起用160～240目(優(yōu)選200目)銅網(wǎng)過濾同時(shí)用注射器活塞研磨組織塊。

根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(d)中，將收集的過濾液用密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，洗滌，再用msc培養(yǎng)基懸浮所獲得的細(xì)胞，然后在37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(d)中，將收集過濾后的細(xì)胞懸液加入到離心管中，1000rpm離心10分鐘，倒掉上清，用含10％fbs的pbs緩沖液重懸細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(e)中，待散在細(xì)胞形成克隆后，挑取各克隆細(xì)胞，用msc培養(yǎng)基分別培養(yǎng)，待細(xì)胞60～90％融合后，用胰酶消化傳代，即得胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(e)中，當(dāng)散在貼壁細(xì)胞形成克隆后，用0.05％胰蛋白酶/2mmedta消化，傳代培養(yǎng)。

根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(f)中，所述細(xì)胞活性檢測是利用臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)凍存前后活細(xì)胞的數(shù)目。

根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(f)中，所述細(xì)胞污染檢測利用少量細(xì)胞培養(yǎng)，檢測細(xì)胞是否受到真菌和細(xì)菌的污染。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞污染檢測是利用病原學(xué)方法，檢測細(xì)胞是否受到選自下列的一項(xiàng)或多項(xiàng)的感染：乙肝兩對半、丙肝、艾滋病毒、巨細(xì)胞病毒、eb病毒和梅毒、hbsag、hbsab、hbcab、hbeag、hbeab、hcvab、hiv-1/2ab、cmv-igm和ebv-iga、trust。

根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(f)中，所述遺傳病檢測是利用分子遺傳學(xué)的方法，檢測凍存細(xì)胞是否存在遺傳病。

根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(f)中，所述hla-abc/dr配型是檢測細(xì)胞hla-abc/dr表型。

根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(g)中，所述胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞是經(jīng)程序降溫過程凍存于液氮中。

根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(g)中，所述胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞存在于細(xì)胞凍存液中。在一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)胞凍存液包含50％低糖dmem培養(yǎng)液、40％fbs、10％二甲基亞砜。

根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(h)中，所述數(shù)據(jù)庫中包括與所保存的細(xì)胞所有相關(guān)的數(shù)據(jù)，包括但不限于：細(xì)胞的生物學(xué)特性檢測結(jié)果、多向分化潛能鑒定結(jié)果、細(xì)胞分子遺傳學(xué)診斷結(jié)果、胎兒及其父母的詳細(xì)資料。

根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，該方法包括以下步驟：在無菌條件下將胎盤小葉剪下，用pbs緩沖液充分沖洗胎盤小葉去除胎盤中殘留的血液。再將胎盤小葉剪成1cm³大小的組織塊，加入含有多種組織消化酶的pbs緩沖液在37℃孵育15分鐘，將組織塊用銅網(wǎng)過濾同時(shí)用注射器研磨。收集過濾后的液體用密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，洗滌后用msc培養(yǎng)基懸浮所獲得的細(xì)胞放到37℃5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待散在細(xì)胞形成克隆后，將各克隆細(xì)胞挑出用msc培養(yǎng)基分別培養(yǎng)，細(xì)胞80～90％融合后，用胰酶消化傳代，即得胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。將傳代后的細(xì)胞于液氮中凍存并記錄相關(guān)胎兒信息，并進(jìn)行細(xì)胞的生物學(xué)特性及多向分化潛能鑒定，以及對細(xì)胞進(jìn)行分子遺傳學(xué)診斷，保存細(xì)胞的所有相關(guān)數(shù)據(jù)，建立胎盤干細(xì)胞的數(shù)據(jù)庫并與凍存細(xì)胞進(jìn)行關(guān)聯(lián)。

根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，該方法包括以下步驟：產(chǎn)后四小時(shí)之內(nèi)在無菌條件下將胎盤小葉剪下，用含10％體積fbs的pbs緩沖液充分沖洗胎盤小葉去除胎盤小葉中殘留的血液。先將胎盤小葉剪成1cm³大小的組織塊，加入到含有0.1mg/mldispase、0.25mg/ml胰酶、0.25mg/mldnasei、1mg/ml膠原酶iv、1mg/ml透明質(zhì)酸酶的pbs緩沖液中37℃消化15分鐘，加入適量fbs終止消化。再將組織塊和細(xì)胞懸液一起用200目銅網(wǎng)過濾同時(shí)用注射器活塞研磨組織塊，收集過濾后的細(xì)胞懸液加入到離心管中1000rpm離心10分鐘，倒掉上清，用含10％fbs的pbs緩沖液重懸細(xì)胞。然后用密度梯度離心法分離收集單個(gè)核細(xì)胞，pbs緩沖液洗滌單個(gè)核細(xì)胞后用msc培養(yǎng)基懸浮所獲得的細(xì)胞，接種單個(gè)核細(xì)胞的密度為每75cm²(細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)表面積)1×10⁷單個(gè)核細(xì)胞共10mlmsc培養(yǎng)基。最后將培養(yǎng)瓶放到37℃5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72小時(shí)后全量換液去除非貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)瓶中會(huì)有散在的梭型貼壁細(xì)胞，加入新鮮msc培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。10天左右，散在貼壁細(xì)胞形成克隆后，用0.05％胰蛋白酶/2mmedta消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按照3000細(xì)胞/cm²進(jìn)行傳代培養(yǎng)；之后，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70％左右融合時(shí)消化傳代培養(yǎng)，即得胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，該方法包括以下步驟：產(chǎn)后四小時(shí)之內(nèi)在無菌條件下將胎盤小葉剪下，用含10％體積fbs的pbs緩沖液充分沖洗胎盤小葉去除胎盤小葉中殘留的血液。先將胎盤小葉剪成1cm³大小的組織塊，加入到含有0.1mg/mldispase、0.25mg/ml胰酶、0.25mg/mldnasei、1mg/ml膠原酶iv、1mg/ml透明質(zhì)酸酶、0.2～0.5mg/ml谷氨酸鈉和2～5mg/ml甘露糖的pbs緩沖液中37℃消化15分鐘，加入適量fbs終止消化。再將組織塊和細(xì)胞懸液一起用200目銅網(wǎng)過濾同時(shí)用注射器活塞研磨組織塊，收集過濾后的細(xì)胞懸液加入到離心管中1000rpm離心10分鐘，倒掉上清，用含10％fbs的pbs緩沖液重懸細(xì)胞。然后用密度梯度離心法分離收集單個(gè)核細(xì)胞，pbs緩沖液洗滌單個(gè)核細(xì)胞后用msc培養(yǎng)基懸浮所獲得的細(xì)胞，接種單個(gè)核細(xì)胞的密度為每75cm²(細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)表面積)1×10⁷單個(gè)核細(xì)胞共10mlmsc培養(yǎng)基。最后將培養(yǎng)瓶放到37℃5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72小時(shí)后全量換液去除非貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)瓶中會(huì)有散在的梭型貼壁細(xì)胞，加入新鮮msc培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。10天左右，散在貼壁細(xì)胞形成克隆后，用0.05％胰蛋白酶/2mmedta消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按照3000細(xì)胞/cm²進(jìn)行傳代培養(yǎng)；之后，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70％左右融合時(shí)消化傳代培養(yǎng)，即得胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。

此外，在本發(fā)明第一方面方法中，提供了一種胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。因此本發(fā)明第二方面提供了一種胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明第二方面的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，其是根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施方案所述方法獲得的。

根據(jù)本發(fā)明第二方面的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，其細(xì)胞純度大于95％。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)3代以上傳代后，細(xì)胞純度大于95％。

進(jìn)一步，本發(fā)明第三方面提供了一種在從胎盤分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法中使用的消化酶組合物，該消化酶組合物是含有組織消化酶的pbs緩沖液，該含有組織消化酶的pbs緩沖液是在pbs緩沖液中包含選自下列的一種或多種消化酶：dispase、胰酶、脫氧核糖核酸酶i(dnasei)、膠原酶iv、透明質(zhì)酸酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，該消化酶組合物中包含下列的消化酶：dispase、胰酶、脫氧核糖核酸酶i(dnasei)、膠原酶iv、透明質(zhì)酸酶。

根據(jù)本發(fā)明第三方面的消化酶組合物，該消化酶組合物是含有所述消化酶的pbs緩沖液。在一個(gè)實(shí)施方案中，含有所述消化酶的pbs緩沖液中包含：約0.1mg/mldispase、約0.25mg/ml胰酶、約0.25mg/mldnasei、約1mg/ml膠原酶iv、和約1mg/ml透明質(zhì)酸酶。

根據(jù)本發(fā)明第三方面的消化酶組合物，該消化酶組合物是含有所述消化酶的pbs緩沖液。在一個(gè)實(shí)施方案中，含有所述消化酶的pbs緩沖液中包含：0.02mg/mldispase、0.05mg/ml胰酶、0.02mg/mldnasei、0.05mg/ml膠原酶iv、和0.2mg/ml透明質(zhì)酸酶。

根據(jù)本發(fā)明第三方面的消化酶組合物，其是在pbs緩沖液中包含：0.02mg/mldispase、0.05mg/ml胰酶、0.02mg/mldnasei、0.05mg/ml膠原酶iv、和0.2mg/ml透明質(zhì)酸酶以及0.2～0.5mg/ml谷氨酸鈉和2～5mg/ml甘露糖，例如該緩沖液中含有約0.2mg/ml、約0.3mg/ml、約0.4mg/ml、或約0.5mg/ml的谷氨酸鈉以及約2mg/ml、約3mg/ml、約4mg/ml、或約5mg/ml的甘露糖。

根據(jù)本發(fā)明第三方面的消化酶組合物，其中所述從胎盤分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其包括以下步驟：

(a)取胎盤小葉，用pbs緩沖液充分沖洗，以去除胎盤中殘留的血液；

(b)將胎盤小葉剪成塊狀，加入含有組織消化酶的pbs緩沖液，再在37℃孵育消化；

(c)將組織塊用銅網(wǎng)過濾，必要時(shí)研磨以促使過濾；

(d)將收集的過濾液離心，分離單個(gè)核細(xì)胞，再用msc培養(yǎng)基懸浮所獲得的細(xì)胞，然后在37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

(e)待散在細(xì)胞形成克隆后，挑取各克隆細(xì)胞，用msc培養(yǎng)基分別培養(yǎng)，待細(xì)胞融合后，用胰酶消化傳代，即得胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞；

以及任選的下列一個(gè)或多個(gè)步驟：

(f)針對步驟(e)所得胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，檢測以下項(xiàng)目的至少一項(xiàng)：細(xì)胞活性、細(xì)胞污染、遺傳病、hla-abc/dr配型；

(g)將步驟(e)所得傳代后的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞于液氮中凍存；

(h)建立包含以上信息的胎盤干細(xì)胞的數(shù)據(jù)庫，并使該數(shù)據(jù)庫與步驟(g)的凍存細(xì)胞進(jìn)行關(guān)聯(lián)。

根據(jù)本發(fā)明第三方面的消化酶組合物，其中所述步驟(a)是在無菌條件下將胎盤小葉剪下，用pbs緩沖液充分沖洗胎盤小葉去除胎盤中殘留的血液。

根據(jù)本發(fā)明第三方面的消化酶組合物，其中所述步驟(a)是在產(chǎn)后四小時(shí)之內(nèi)，在無菌條件下將胎盤小葉剪下，用含10％體積胎牛血清(fbs)的pbs緩沖液充分沖洗胎盤小葉去除胎盤小葉中殘留的血液。

根據(jù)本發(fā)明第三方面的消化酶組合物，其中所述步驟(b)中的組織消化酶是選自下列的一種或多種：dispase、胰酶、脫氧核糖核酸酶i(dnasei)、膠原酶iv、透明質(zhì)酸酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述步驟(b)中的組織消化酶包括：dispase、胰酶、脫氧核糖核酸酶i(dnasei)、膠原酶iv、透明質(zhì)酸酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(b)中，所述pbs緩沖液中包含約0.1mg/mldispase(其亦稱中性蛋白酶或稱分散酶)、約0.25mg/ml胰酶、約0.25mg/mldnasei(其亦稱為脫氧核糖核酸酶i)、約1mg/ml膠原酶iv、和約1mg/ml透明質(zhì)酸酶。

根據(jù)本發(fā)明第三方面的消化酶組合物，其中步驟(b)中所述含有組織消化酶的pbs緩沖液是在pbs緩沖液中包含：0.02mg/mldispase、0.05mg/ml胰酶、0.02mg/mldnasei、0.05mg/ml膠原酶iv、和0.2mg/ml透明質(zhì)酸酶。

根據(jù)本發(fā)明第三方面的消化酶組合物，其中步驟(b)中所述含有組織消化酶的pbs緩沖液是在pbs緩沖液中包含：0.02mg/mldispase、0.05mg/ml胰酶、0.02mg/mldnasei、0.05mg/ml膠原酶iv、和0.2mg/ml透明質(zhì)酸酶以及0.2～0.5mg/ml谷氨酸鈉和2～5mg/ml甘露糖，例如該緩沖液中含有約0.2mg/ml、約0.3mg/ml、約0.4mg/ml、或約0.5mg/ml的谷氨酸鈉以及約2mg/ml、約3mg/ml、約4mg/ml、或約5mg/ml的甘露糖。當(dāng)然，該含有組織消化酶的pbs緩沖液所用的配液介質(zhì)是所述pbs緩沖液，即，所述含有組織消化酶的pbs緩沖液中還包含pbs緩沖液；盡管上述含有組織消化酶的pbs緩沖液組成中未提及，在此類情形中本領(lǐng)域通常也不用提及。已經(jīng)出人意料的發(fā)現(xiàn)，向含有組織消化酶的pbs緩沖液中同時(shí)添加少量谷氨酸鈉和甘露醇并大大減少另外五種組織消化酶的濃度，仍然能夠獲得優(yōu)異的效果，這將是具有極其重要意義的，原因在于五種消化酶的價(jià)格均非常昂貴而谷氨酸鈉和甘露醇極其便宜，可以大大降低方法學(xué)成本并且能獲得滿意的技術(shù)效果，例如，上述含有谷氨酸鈉和甘露糖的組合物，其成本大約是包含0.1mg/mldispase、0.25mg/ml胰酶、0.25mg/mldnasei、1mg/ml膠原酶iv、和1mg/ml透明質(zhì)酸酶且不含谷氨酸鈉和甘露糖的組合物成本的5％，并且可以使方法學(xué)總成本降低約90％。

根據(jù)本發(fā)明第三方面的消化酶組合物，在步驟(b)中，在37℃孵育10～30分鐘，優(yōu)選10～20分鐘，例如10分鐘、15分鐘或20分鐘。

根據(jù)本發(fā)明第三方面的消化酶組合物，在步驟(b)中，將胎盤小葉剪成約1cm³大小的組織塊。

根據(jù)本發(fā)明第三方面的消化酶組合物，在步驟(c)中，將組織塊用銅網(wǎng)過濾同時(shí)用注射器研磨。在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(c)中，將組織塊和細(xì)胞懸液一起用160～240目(優(yōu)選200目)銅網(wǎng)過濾同時(shí)用注射器活塞研磨組織塊。

根據(jù)本發(fā)明第三方面的消化酶組合物，在步驟(d)中，將收集的過濾液用密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，洗滌，再用msc培養(yǎng)基懸浮所獲得的細(xì)胞，然后在37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(d)中，將收集過濾后的細(xì)胞懸液加入到離心管中，1000rpm離心10分鐘，倒掉上清，用含10％fbs的pbs緩沖液重懸細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明第三方面的消化酶組合物，在步驟(e)中，待散在細(xì)胞形成克隆后，挑取各克隆細(xì)胞，用msc培養(yǎng)基分別培養(yǎng)，待細(xì)胞60～90％融合后，用胰酶消化傳代，即得胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(e)中，當(dāng)散在貼壁細(xì)胞形成克隆后，用0.05％胰蛋白酶/2mmedta消化，傳代培養(yǎng)。

根據(jù)本發(fā)明第三方面的消化酶組合物，在步驟(f)中，所述細(xì)胞活性檢測是利用臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)凍存前后活細(xì)胞的數(shù)目。

根據(jù)本發(fā)明第三方面的消化酶組合物，在步驟(f)中，所述細(xì)胞污染檢測利用少量細(xì)胞培養(yǎng)，檢測細(xì)胞是否受到真菌和細(xì)菌的污染。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞污染檢測是利用病原學(xué)方法，檢測細(xì)胞是否受到選自下列的一項(xiàng)或多項(xiàng)的感染：乙肝兩對半、丙肝、艾滋病毒、巨細(xì)胞病毒、eb病毒和梅毒、hbsag、hbsab、hbcab、hbeag、hbeab、hcvab、hiv-1/2ab、cmv-igm和ebv-iga、trust。

根據(jù)本發(fā)明第三方面的消化酶組合物，在步驟(f)中，所述遺傳病檢測是利用分子遺傳學(xué)的方法，檢測凍存細(xì)胞是否存在遺傳病。

根據(jù)本發(fā)明第三方面的消化酶組合物，在步驟(f)中，所述hla-abc/dr配型是檢測細(xì)胞hla-abc/dr表型。

根據(jù)本發(fā)明第三方面的消化酶組合物，在步驟(g)中，所述胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞是經(jīng)程序降溫過程凍存于液氮中。

根據(jù)本發(fā)明第三方面的消化酶組合物，在步驟(g)中，所述胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞存在于細(xì)胞凍存液中。在一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)胞凍存液包含50％低糖dmem培養(yǎng)液、40％fbs、10％二甲基亞砜。

根據(jù)本發(fā)明第三方面的消化酶組合物，在步驟(h)中，所述數(shù)據(jù)庫中包括與所保存的細(xì)胞所有相關(guān)的數(shù)據(jù)，包括但不限于：細(xì)胞的生物學(xué)特性檢測結(jié)果、多向分化潛能鑒定結(jié)果、細(xì)胞分子遺傳學(xué)診斷結(jié)果、胎兒及其父母的詳細(xì)資料。

根據(jù)本發(fā)明第三方面的消化酶組合物，所述從胎盤分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法包括以下步驟：在無菌條件下將胎盤小葉剪下，用pbs緩沖液充分沖洗胎盤小葉去除胎盤中殘留的血液。再將胎盤小葉剪成1cm³大小的組織塊，加入含有多種組織消化酶的pbs緩沖液在37℃孵育15分鐘，將組織塊用銅網(wǎng)過濾同時(shí)用注射器研磨。收集過濾后的液體用密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，洗滌后用msc培養(yǎng)基懸浮所獲得的細(xì)胞放到37℃5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待散在細(xì)胞形成克隆后，將各克隆細(xì)胞挑出用msc培養(yǎng)基分別培養(yǎng)，細(xì)胞80～90％融合后，用胰酶消化傳代，即得胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。將傳代后的細(xì)胞于液氮中凍存并記錄相關(guān)胎兒信息，并進(jìn)行細(xì)胞的生物學(xué)特性及多向分化潛能鑒定，以及對細(xì)胞進(jìn)行分子遺傳學(xué)診斷，保存細(xì)胞的所有相關(guān)數(shù)據(jù)，建立胎盤干細(xì)胞的數(shù)據(jù)庫并與凍存細(xì)胞進(jìn)行關(guān)聯(lián)。

根據(jù)本發(fā)明第三方面的消化酶組合物，所述從胎盤分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法包括以下步驟：產(chǎn)后四小時(shí)之內(nèi)在無菌條件下將胎盤小葉剪下，用含10％體積fbs的pbs緩沖液充分沖洗胎盤小葉去除胎盤小葉中殘留的血液。先將胎盤小葉剪成1cm³大小的組織塊，加入到含有0.1mg/mldispase、0.25mg/ml胰酶、0.25mg/mldnasei、1mg/ml膠原酶iv、1mg/ml透明質(zhì)酸酶的pbs緩沖液中37℃消化15分鐘，加入適量fbs終止消化。再將組織塊和細(xì)胞懸液一起用200目銅網(wǎng)過濾同時(shí)用注射器活塞研磨組織塊，收集過濾后的細(xì)胞懸液加入到離心管中1000rpm離心10分鐘，倒掉上清，用含10％fbs的pbs緩沖液重懸細(xì)胞。然后用密度梯度離心法分離收集單個(gè)核細(xì)胞，pbs緩沖液洗滌單個(gè)核細(xì)胞后用msc培養(yǎng)基懸浮所獲得的細(xì)胞，接種單個(gè)核細(xì)胞的密度為每75cm²(細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)表面積)1×10⁷單個(gè)核細(xì)胞共10mlmsc培養(yǎng)基。最后將培養(yǎng)瓶放到37℃5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72小時(shí)后全量換液去除非貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)瓶中會(huì)有散在的梭型貼壁細(xì)胞，加入新鮮msc培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。10天左右，散在貼壁細(xì)胞形成克隆后，用0.05％胰蛋白酶/2mmedta消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按照3000細(xì)胞/cm²進(jìn)行傳代培養(yǎng)；之后，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70％左右融合時(shí)消化傳代培養(yǎng)，即得胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明第三方面的消化酶組合物，所述從胎盤分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法包括以下步驟：產(chǎn)后四小時(shí)之內(nèi)在無菌條件下將胎盤小葉剪下，用含10％體積fbs的pbs緩沖液充分沖洗胎盤小葉去除胎盤小葉中殘留的血液。先將胎盤小葉剪成1cm³大小的組織塊，加入到含有0.1mg/mldispase、0.25mg/ml胰酶、0.25mg/mldnasei、1mg/ml膠原酶iv、1mg/ml透明質(zhì)酸酶、0.2～0.5mg/ml谷氨酸鈉和2～5mg/ml甘露糖的pbs緩沖液中37℃消化15分鐘，加入適量fbs終止消化。再將組織塊和細(xì)胞懸液一起用200目銅網(wǎng)過濾同時(shí)用注射器活塞研磨組織塊，收集過濾后的細(xì)胞懸液加入到離心管中1000rpm離心10分鐘，倒掉上清，用含10％fbs的pbs緩沖液重懸細(xì)胞。然后用密度梯度離心法分離收集單個(gè)核細(xì)胞，pbs緩沖液洗滌單個(gè)核細(xì)胞后用msc培養(yǎng)基懸浮所獲得的細(xì)胞，接種單個(gè)核細(xì)胞的密度為每75cm²(細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)表面積)1×10⁷單個(gè)核細(xì)胞共10mlmsc培養(yǎng)基。最后將培養(yǎng)瓶放到37℃5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72小時(shí)后全量換液去除非貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)瓶中會(huì)有散在的梭型貼壁細(xì)胞，加入新鮮msc培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。10天左右，散在貼壁細(xì)胞形成克隆后，用0.05％胰蛋白酶/2mmedta消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按照3000細(xì)胞/cm²進(jìn)行傳代培養(yǎng)；之后，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70％左右融合時(shí)消化傳代培養(yǎng)，即得胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。

下面對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。本發(fā)明所引用的文獻(xiàn)，以及該文獻(xiàn)中所引用的文獻(xiàn)，它們的全部內(nèi)容通過引用并入本文。

在本發(fā)明中，本發(fā)明任一方面的任一技術(shù)方案中，其任一技術(shù)特征同樣適用于本發(fā)明的任一方面的任一實(shí)施方案，只要它們不會(huì)引起矛盾，并且這種相互適用在必要時(shí)可以作適當(dāng)?shù)男薷摹?/p>

在本發(fā)明中，術(shù)語“胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞”是指來源于胎盤的間充質(zhì)干細(xì)胞。因此在本發(fā)明中，特別是涉及本發(fā)明的語境中，術(shù)語“胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞”可以與“胎盤干細(xì)胞”、“干細(xì)胞”、“間充質(zhì)干細(xì)胞”互換使用，除非另有明確指明。

在本發(fā)明中，術(shù)語“pbs緩沖液”或者“pbs”是指磷酸鹽緩沖液。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知在本發(fā)明情形下使用的pbs的一般性配方和配制方法以及它們的一般性質(zhì)例如ph值或ph范圍，并且這些pbs緩沖液通常是可以通過商業(yè)途徑獲得的預(yù)配液(或預(yù)配粉)，例如用于本發(fā)明領(lǐng)域的pbs通常是ph7.4(±0.1)的商品化緩沖液，例如hyclone品牌的pbs緩沖液；本領(lǐng)域經(jīng)典的應(yīng)用時(shí)的pbs緩沖液組成中包括137mm氯化鈉、2.7nm氯化鉀和10mm磷酸根，在本發(fā)明中如未另外特別說明，所用pbs使用時(shí)的組成均為該組成。

在本發(fā)明中，術(shù)語“胎盤”是指新生兒胎盤，特別是指產(chǎn)后4小時(shí)之內(nèi)的胎盤。

在本發(fā)明中，術(shù)語“msc培養(yǎng)基”是指間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的專用培養(yǎng)基，本發(fā)明是含10％fbs的dmem-f12的pbs緩沖液培養(yǎng)基。

本發(fā)明的發(fā)明人曾利用灌流法從胎盤中分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，獲得了純度很高的間充質(zhì)干細(xì)胞。但是經(jīng)過灌流后仍然會(huì)有大量干細(xì)胞滯留在胎盤組織中，不能有效地被分離出來。因此可以認(rèn)為，采用灌流法不能最大限度的得到間充質(zhì)干細(xì)胞。

本發(fā)明公開了一種從胎盤中大量分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，并利用這種方法保存胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞并建立胎盤干細(xì)胞庫。本發(fā)明的發(fā)明人在總結(jié)以往分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的基礎(chǔ)上，利用多種組織消化酶混合消化胎盤小葉組織塊，結(jié)合貼壁培養(yǎng)法，成功自胎盤中分離得到大量間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明方法得到的間充質(zhì)干細(xì)胞純度高、數(shù)量多，具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相同的生物學(xué)特性，能向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等分化。由于胎盤中干細(xì)胞較成體干細(xì)胞幼稚，含量豐富，在臨床上具有廣泛的應(yīng)用前景，我們運(yùn)用常規(guī)的細(xì)胞凍存方法將間充質(zhì)干細(xì)胞像臍血一樣凍存起來，建立胎盤干細(xì)胞庫，為以后干細(xì)胞的深入研究和臨床治療奠定基礎(chǔ)。

由于臍血中含有豐富的造血干細(xì)胞，人們建立臍血庫把臍血造血干細(xì)胞這一重要的生物資源儲(chǔ)存起來，為多種血液系統(tǒng)疾病和免疫系統(tǒng)疾病提供一種治療手段。同樣胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞作為一種更加重要的干細(xì)胞資源，我們運(yùn)用常規(guī)的細(xì)胞凍存方法將其冷凍在-196攝氏度的深低溫液氮中長期保存，建立胎盤干細(xì)胞庫，為日后的干細(xì)胞治療保存種子。

本發(fā)明的目的是提供一種實(shí)用簡單的從胎盤中大量分離間充質(zhì)干細(xì)胞并建立胎盤干細(xì)胞庫的方法，包括如下步驟：在無菌條件下將胎盤小葉剪下，用pbs緩沖液充分沖洗胎盤小葉去除胎盤中殘留的血液。再將胎盤小葉剪成1cm³大小的組織塊，加入含有多種組織消化酶的的pbs緩沖液在37℃孵育15分鐘，將組織塊用銅網(wǎng)過濾同時(shí)用注射器研磨。收集過濾后的液體用密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，洗滌后用msc培養(yǎng)基懸浮所獲得的細(xì)胞放到37℃5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待散在細(xì)胞形成克隆后，將各克隆細(xì)胞挑出用msc培養(yǎng)基分別培養(yǎng)，細(xì)胞80～90％融合后，用胰酶消化傳代，將傳代后的細(xì)胞于液氮中凍存并記錄相關(guān)胎兒信息，并進(jìn)行細(xì)胞的生物學(xué)特性及多向分化潛能鑒定，以及對細(xì)胞進(jìn)行分子遺傳學(xué)診斷，保存細(xì)胞的所有相關(guān)數(shù)據(jù)，建立胎盤干細(xì)胞的數(shù)據(jù)庫并與凍存細(xì)胞進(jìn)行關(guān)聯(lián)。

根據(jù)本發(fā)明的方法，例如根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例1、2的方法，一個(gè)重量為750克的胎盤可以分得8×10⁹單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)過貼壁培養(yǎng)平均1×10⁶單個(gè)核細(xì)胞中可以獲得12個(gè)克隆，鑒定后平均有3個(gè)克隆具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特性，即750g胎盤中可分得24000個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞克隆。這些干細(xì)胞經(jīng)過體外短期培養(yǎng)可以很快達(dá)到細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)以及臨床治療所需數(shù)量。然而，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，按照cn1548529a中實(shí)施例一的方法，一個(gè)重量為750克的胎盤大約可分離得到3000個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞克隆，經(jīng)3代傳代后，細(xì)胞純度大于約為95％。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(b)中所述pbs緩沖液中包含約0.1mg/mldispase、約0.25mg/ml胰酶、約0.25mg/mldnasei、約1mg/ml膠原酶iv、和約1mg/ml透明質(zhì)酸酶；本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該pbs緩沖液中的5種酶，缺少任一種或多種時(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞收率和細(xì)胞純度均遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到上述750g胎盤中可分得24000個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞克隆的結(jié)果；此外，5種酶的濃度作適當(dāng)變化，特別是在低于上述各自濃度的50％或者高于上述各自濃度的200％時(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞收率和細(xì)胞純度均明顯比上述750g胎盤中可分得24000個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞克隆的結(jié)果差；例如當(dāng)pbs緩沖液中的dispase濃度為0.04mg/ml(低于本發(fā)明上述濃度的50％)或者為0.25mg/ml(高于本發(fā)明上述濃度的200％)時(shí)，750g胎盤中約可分得8000個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞克隆且細(xì)胞純度低于90％。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是在步驟(b)中，所述pbs緩沖液中包含0.05～0.2mg/mldispase、0.125～0.5mg/ml胰酶、0.125～0.5mg/mldnasei、0.5～2mg/ml膠原酶iv、和0.5～2mg/ml透明質(zhì)酸酶。

另外，本發(fā)明人在此處提供如下補(bǔ)充的試驗(yàn)(即補(bǔ)充試驗(yàn)1至補(bǔ)充試驗(yàn)3)。補(bǔ)充試驗(yàn)1：參照本發(fā)明實(shí)施例1至實(shí)施例2進(jìn)行胎盤msc的分離、傳代培養(yǎng)及其凍存，接著參照實(shí)施例3和實(shí)施例4進(jìn)行相關(guān)項(xiàng)目的檢測，不同的僅是在實(shí)施例1操作中將剪成1cm³大小的胎盤小葉組織塊加入到含有0.02mg/mldispase、0.05mg/ml胰酶、0.02mg/mldnasei、0.05mg/ml膠原酶iv、和0.2mg/ml透明質(zhì)酸酶以及0.3mg/ml谷氨酸鈉和3mg/ml甘露糖的pbs緩沖液中，進(jìn)行消化及后續(xù)處理。補(bǔ)充試驗(yàn)2：參照本發(fā)明實(shí)施例1至實(shí)施例2進(jìn)行胎盤msc的分離、傳代培養(yǎng)及其凍存，接著參照實(shí)施例3和實(shí)施例4進(jìn)行相關(guān)項(xiàng)目的檢測，不同的僅是在實(shí)施例1操作中將剪成1cm³大小的胎盤小葉組織塊加入到含有0.02mg/mldispase、0.05mg/ml胰酶、0.02mg/mldnasei、0.05mg/ml膠原酶iv、和0.2mg/ml透明質(zhì)酸酶以及0.2mg/ml谷氨酸鈉和5mg/ml甘露糖的pbs緩沖液中，進(jìn)行消化及后續(xù)處理。補(bǔ)充試驗(yàn)3：參照本發(fā)明實(shí)施例1至實(shí)施例2進(jìn)行胎盤msc的分離、傳代培養(yǎng)及其凍存，接著參照實(shí)施例3和實(shí)施例4進(jìn)行相關(guān)項(xiàng)目的檢測，不同的僅是在實(shí)施例1操作中將剪成1cm³大小的胎盤小葉組織塊加入到含有0.02mg/mldispase、0.05mg/ml胰酶、0.02mg/mldnasei、0.05mg/ml膠原酶iv、和0.2mg/ml透明質(zhì)酸酶以及0.5mg/ml谷氨酸鈉和2mg/ml甘露糖的pbs緩沖液中，進(jìn)行消化及后續(xù)處理。結(jié)果顯示，補(bǔ)充試驗(yàn)1至補(bǔ)充試驗(yàn)3三個(gè)補(bǔ)充試驗(yàn)所得結(jié)果與實(shí)施例1至實(shí)施例4所得結(jié)果基本一致，甚至在間充質(zhì)干細(xì)胞收率方面比實(shí)施例1至實(shí)施例4更高，例如補(bǔ)充試驗(yàn)1至補(bǔ)充試驗(yàn)3中從750g胎盤中可分別分離獲得30000～32000個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞克隆，例如補(bǔ)充試驗(yàn)1從750g胎盤中可分離獲得31500個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞克隆，補(bǔ)充試驗(yàn)1至補(bǔ)充試驗(yàn)3三個(gè)補(bǔ)充試驗(yàn)所得細(xì)胞純度均在96～98％范圍內(nèi)，例如補(bǔ)充試驗(yàn)1經(jīng)3代以上傳代后，細(xì)胞成分均一，與圖2結(jié)果類似，純度在95％以上，又例如補(bǔ)充試驗(yàn)1中流式細(xì)胞術(shù)檢測胎盤msc的細(xì)胞周期時(shí)得到與圖3類似的結(jié)果，即經(jīng)測定第3代和第6代細(xì)胞的dna含量，細(xì)胞周期分析，g0/g1期、s期和g2m期所占比例分別為96.32％、96.75％，1.13％、0.09％，和2.52％、3.30％，結(jié)果表明體外培養(yǎng)的細(xì)胞具有典型的干細(xì)胞增殖特點(diǎn)，即只有少數(shù)細(xì)胞處于活躍的增殖期(1.13％、0.09％)，大部分的細(xì)胞處于靜息期(96.32％、96.75％)。在進(jìn)一步的補(bǔ)充試驗(yàn)中，分別參照上述補(bǔ)充試驗(yàn)1，不同的僅是消化液中未添加谷氨酸鈉或者未添加甘露醇，結(jié)果顯示未添加二者之一的情況下間充質(zhì)干細(xì)胞克隆收率顯示降低，分別降至21000個(gè)克隆/750g和18000個(gè)克隆/750g，并且所得細(xì)胞純度分別為93.3％和93.7％。

另外，本發(fā)明人在此處提供如下補(bǔ)充的試驗(yàn)(即補(bǔ)充試驗(yàn)4至補(bǔ)充試驗(yàn)5)。補(bǔ)充試驗(yàn)4：參照本發(fā)明實(shí)施例1至實(shí)施例2進(jìn)行胎盤msc的分離、傳代培養(yǎng)及其凍存，接著參照實(shí)施例3和實(shí)施例4進(jìn)行相關(guān)項(xiàng)目的檢測，不同的僅是在實(shí)施例1操作中將剪成1cm³大小的胎盤小葉組織塊加入到用#264e1型消化酶混合液(#264e1型消化酶混合液的配比為：i型膠原酶1μg/ml、中性蛋白酶0.5μg/ml、脫氧核糖核酸酶2μg/ml、pbs100ml)中，進(jìn)行消化及后續(xù)處理。補(bǔ)充試驗(yàn)5：參照本發(fā)明實(shí)施例1至實(shí)施例2進(jìn)行胎盤msc的分離、傳代培養(yǎng)及其凍存，接著參照實(shí)施例3和實(shí)施例4進(jìn)行相關(guān)項(xiàng)目的檢測，不同的僅是在實(shí)施例1操作中將剪成1cm³大小的胎盤小葉組織塊加入到用#500e1型消化酶混合液(#500e1型消化酶混合液的配制為：ii型膠原酶250u/ml、中性蛋白酶100u/ml、透明質(zhì)酸酶10u/ml，37℃溶解于dmem/f12培養(yǎng)基，過濾0.22μm的濾器除菌)中，進(jìn)行消化及后續(xù)處理。結(jié)果顯示，補(bǔ)充試驗(yàn)4至補(bǔ)充試驗(yàn)5兩個(gè)補(bǔ)充試驗(yàn)所得結(jié)果明顯的比實(shí)施例1至實(shí)施例4所得結(jié)果差，例如在間充質(zhì)干細(xì)胞收率方面從750g胎盤中僅可分別分離獲得15000～17000個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞克隆且所得細(xì)胞純度均在91～93％范圍內(nèi)。

本發(fā)明操作簡單，方便實(shí)用，能得到大量的間充質(zhì)干細(xì)胞，分化性能好，具有向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等細(xì)胞分化的能力。與現(xiàn)有方法的比較:目前msc主要采用手術(shù)法抽取供者骨髓或灌流法分離胎盤，貼壁培養(yǎng)獲得。該法分得細(xì)胞數(shù)量少，而且供者在取髓中和取髓后均有感染的可能。本發(fā)明成功自胎盤中分離獲得大量純度較高的間充質(zhì)干細(xì)胞，并運(yùn)用此法建立胎盤干細(xì)胞庫來儲(chǔ)備這種極具應(yīng)用前景的干細(xì)胞。該法簡便易行，且由于胎盤與臍血一樣，細(xì)胞成份較幼稚，來源廣泛，方便易得，因此本發(fā)明的方法在干細(xì)胞的臨床應(yīng)用上將具有廣泛的前景。

附圖說明

圖1為顯微鏡下對細(xì)胞生長的形態(tài)學(xué)觀察。其中：a為培養(yǎng)3天后可見散在的貼壁細(xì)胞；b為7～10天形成克??；c為經(jīng)篩選克隆形成致密貼壁細(xì)胞；d、e、f為瑞氏姬姆薩染色。

圖2為流式細(xì)胞術(shù)鑒定msc表面標(biāo)志結(jié)果。各圖中縱坐標(biāo)“counts”表示計(jì)數(shù)量。

圖3為胎盤msc細(xì)胞周期的分析結(jié)果。其中，p3為培養(yǎng)第三代細(xì)胞的dna含量，分析細(xì)胞周期，可見大部分細(xì)胞處于靜止期(g0/g1期，96.66％)，極少細(xì)胞處于增殖期(s期，3.25％)。p6為培養(yǎng)第六代的細(xì)胞的dna含量，分析細(xì)胞周期，可見大部分細(xì)胞處于靜止期(g0/g1期，96.35％)，極少細(xì)胞處于增殖期(s期，2.54％)。各圖中縱坐標(biāo)“counts”表示計(jì)數(shù)量，橫坐標(biāo)標(biāo)“dnacontent”表示dna含量。

圖4為胎盤msc細(xì)胞生長曲線圖。

圖5為胎盤msc多向分化潛能鑒定的成骨誘導(dǎo)細(xì)胞圖。

圖6為胎盤msc多向分化潛能鑒定的成脂肪誘導(dǎo)細(xì)胞圖。

圖7為胎盤msc多向分化潛能鑒定的成軟骨誘導(dǎo)細(xì)胞圖。

圖8為rt-pcr檢測胎盤msc多向分化潛能的電泳照片。

具體實(shí)施方式

通過下面的實(shí)施例可以對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述，然而，本發(fā)明的范圍并不限于下述實(shí)施例。本領(lǐng)域的專業(yè)人員能夠理解，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可以對本發(fā)明進(jìn)行各種變化和修飾。本發(fā)明對試驗(yàn)中所使用到的材料以及試驗(yàn)方法進(jìn)行一般性和/或具體的描述。雖然為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的許多材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的，但是本發(fā)明仍然在此作盡可能詳細(xì)的描述。

實(shí)施例1、胎盤msc的分離

在產(chǎn)后四小時(shí)之內(nèi)，在無菌條件下將胎盤小葉剪下，用含10％體積fbs的pbs緩沖液充分沖洗胎盤小葉去除胎盤小葉中殘留的血液。先將胎盤小葉剪成1cm³大小的組織塊，加入到含有0.1mg/mldispase、0.25mg/ml胰酶、0.25mg/mldnasei、1mg/ml膠原酶iv、1mg/ml透明質(zhì)酸酶的pbs緩沖液中37℃消化15分鐘，加入適量fbs終止消化。再將組織塊和細(xì)胞懸液一起用200目銅網(wǎng)過濾同時(shí)用注射器活塞研磨組織塊，收集過濾后的細(xì)胞懸液加入到離心管中1000rpm離心10分鐘，倒掉上清，用含10％fbs的pbs緩沖液重懸細(xì)胞。然后用密度梯度離心法分離收集單個(gè)核細(xì)胞，pbs緩沖液洗滌單個(gè)核細(xì)胞后用msc培養(yǎng)基懸浮所獲得的細(xì)胞，接種單個(gè)核細(xì)胞的密度為每75cm²(細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)表面積)1×10⁷單個(gè)核細(xì)胞共10mlmsc培養(yǎng)基。最后將培養(yǎng)瓶放到37℃5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72小時(shí)后全量換液，去除非貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)瓶中會(huì)有散在的梭型貼壁細(xì)胞，再加入新鮮msc培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

實(shí)施例2、胎盤msc的傳代培養(yǎng)及其凍存

在約10天后，待散在貼壁細(xì)胞形成克隆后，用0.05％胰蛋白酶/2mmedta消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按照3000細(xì)胞/cm²進(jìn)行傳代培養(yǎng)。之后，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70％左右融合時(shí)消化傳代培養(yǎng)。消化后取3×10⁶細(xì)胞加入到1ml細(xì)胞凍存液(含50％低糖dmem培養(yǎng)液、40％fbs、10％二甲基亞砜)中，經(jīng)過程序降溫最后進(jìn)入到液氮管中凍存。

實(shí)施例3、胎盤msc的生物學(xué)特性鑒定

1、細(xì)胞生長及其形態(tài)學(xué)特點(diǎn)

通過實(shí)施例1和實(shí)施例2的分離培養(yǎng)，胎盤單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)后在顯微鏡下可明顯見到梭形貼壁細(xì)胞(圖1a)，10天左右會(huì)形成渦輪狀細(xì)胞克隆(圖1b、圖1d)，消化傳代后會(huì)形成80％左右融合的貼壁層(圖1c、圖1e、圖1f)。培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞形態(tài)相對均一，增殖速度快，貼壁速度快，易被胰酶消化，傳代至15代以上，其形態(tài)及生長特點(diǎn)亦無明顯改變。

2、流式細(xì)胞術(shù)鑒定msc表面標(biāo)志

分別取第3、6、9、12、15代細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志，動(dòng)態(tài)觀察培養(yǎng)過程中細(xì)胞表面標(biāo)志的變化。消化收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)后取8×10⁶個(gè)細(xì)胞，分裝16管；pbs洗一次，1500rpm離心10min；棄上清，殘留100～200μl，吹打混勻細(xì)胞；加入pe標(biāo)記的cd14、cd29、cd31、cd34、cd44、cd54、cd73、cd80、cd86、cd166抗體以及fitc標(biāo)記的cd45、cd105、hla-abc、hla-dr、uea-1抗體各10μl，并設(shè)一管為空白對照；在4℃下，避光反應(yīng)30min；pbs洗一次，1500rpm離心10min；直接標(biāo)記的細(xì)胞棄上清，加入200μlpbs吹打混勻細(xì)胞，200μl的1％多聚甲醛固定，置4℃待測，3天內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的表面標(biāo)志，動(dòng)態(tài)觀察第3、6、9、12、15代的細(xì)胞，無明顯改變。不表達(dá)造血細(xì)胞表面標(biāo)志即cd14、cd31、cd34(hspc及內(nèi)皮細(xì)胞陽性)、cd45(白細(xì)胞陽性)、cd54(icam-1)、cd80(b7-1)、cd86(b7-2)、hla-dr(mhc-ii類分子)持續(xù)陰性，cd29和cd44(纖維蛋白和透明脂酸鹽的受體，基質(zhì)細(xì)胞表達(dá))、cd73(即sh-3、4)、cd105(即sh-2)、cd166(間充質(zhì)細(xì)胞表達(dá))、hla-abc(mhc-i類分子)和uea-1(內(nèi)皮細(xì)胞的表面標(biāo)志)持續(xù)為陽性。經(jīng)3代以上傳代后，細(xì)胞成分均一，純度在95％以上。(圖2)

3、流式細(xì)胞術(shù)檢測胎盤msc的細(xì)胞周期

細(xì)胞長至80％左右融合時(shí)，消化收集細(xì)胞約1×10⁶個(gè)，pbs洗一次，加入70％的乙醇固定，4℃待測。檢測時(shí)，先離心去乙醇，再用pbs洗一次，加入rnasei500u，37℃反應(yīng)30min，pbs洗一次，加入碘化丙啶(pi，終濃度50μg/ml)1ml，室溫避光反應(yīng)20min，上機(jī)檢測細(xì)胞dna含量。

經(jīng)測定第3代和第6代細(xì)胞的dna含量，細(xì)胞周期分析，g0/g1期、s期和g2m期所占比例分別為96.35％、96.66％，1.11％、0.09％，和2.54％、3.25％。結(jié)果表明體外培養(yǎng)的細(xì)胞具有典型的干細(xì)胞增殖特點(diǎn)，即只有少數(shù)細(xì)胞處于活躍的增殖期(1.11％、0.09％)，大部分的細(xì)胞處于靜息期(96.35％、96.66％)。(圖3)

4、胎盤msc生長曲線的繪制及對數(shù)生長期倍增時(shí)間的測定

取對數(shù)生長期細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)，以10％fbs的lg-dmem培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液(2×10⁴/ml)，24孔板中每孔接種0.5ml，37℃，5％co2，飽和濕度下培養(yǎng)。每天取3復(fù)孔，臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值，連續(xù)觀察7天。以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸，繪制細(xì)胞生長曲線。以patterson公式計(jì)算細(xì)胞在對數(shù)生長期的倍增時(shí)間，即td＝tlg2/lg(nt/no)，td：倍增時(shí)間(h)，t：細(xì)胞由no增至nt所用的時(shí)間(h)，n：細(xì)胞數(shù)。

通過每天細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果繪制細(xì)胞生長曲線，計(jì)算倍增時(shí)間。由細(xì)胞生長曲線可以看出，細(xì)胞在第2-4天處于指數(shù)生長期。根據(jù)公式計(jì)算出第5代細(xì)胞在指數(shù)生長期的倍增時(shí)間分別為22.6h。(圖4)

5、胎盤msc多向分化潛能的鑒定

(1)成骨誘導(dǎo)

3代以上msc，按1×10⁵/孔接種六孔板，放于37℃、5％co2、飽和濕度下，msc培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，換用含10％經(jīng)篩選fbs的dmem-hg并加入地塞米松0.1μm、抗壞血酸磷酸鹽50μm、β-磷酸甘油10mm，放于37℃、5％co2、在飽和濕度下培養(yǎng)，每3天半量換液，共誘導(dǎo)2-4周。堿性磷酸酶染色鑒定成骨細(xì)胞形成，vonkossa染色鑒定骨結(jié)節(jié)形成。

在含10％經(jīng)篩選fbs的dmem-hg，加入地塞米松0.1μm、抗壞血酸磷酸鹽50μm、β-磷酸甘油10mm培養(yǎng)1周，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的改變，由紡錘形的成纖維細(xì)胞樣變?yōu)槎嘟切危愃朴谏窠?jīng)元細(xì)胞樣，細(xì)胞周邊出現(xiàn)長絲狀突出，并可向周圍延伸。繼續(xù)培養(yǎng)2周以上后，細(xì)胞基質(zhì)中出現(xiàn)鈣化斑，礦化物逐漸出現(xiàn)，并且開始形成多層小結(jié)結(jié)構(gòu)，至培養(yǎng)4周后，可見明顯鈣化結(jié)節(jié)。2周時(shí)堿性磷酸酶染色呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，達(dá)到95％以上，而未加以誘導(dǎo)的對照組則大部分為陰性，只有不到5％顯示為弱陽性，表明細(xì)胞已向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。vonkossa染色可將骨結(jié)節(jié)中沉積的鈣染成黑色，誘導(dǎo)組可見大量的黑色骨結(jié)節(jié)，有明顯的立體結(jié)構(gòu)，而對照組在任何時(shí)間都沒有陽性反應(yīng)。(圖5)

(2)成脂肪誘導(dǎo)

3代以上msc，按1×10⁵/孔接種于六孔板，放于37℃、5％co2、飽和濕度下，在msc培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，換用含10％經(jīng)篩選fbs的高糖dmem，并加入地塞米松1μm、消炎痛60μm、ibmx0.5mm、胰島素5μg/ml，放于37℃，5％co2，飽和濕度下培養(yǎng)，每3天半量換液，共誘導(dǎo)2周，油紅染色鑒定脂滴形成。

在含10％經(jīng)篩選fbs的dmem-hg，加入地塞米松1μm、消炎痛200μm、ibmx0.5mm、胰島素10μg/ml培養(yǎng)3天，細(xì)胞即發(fā)生形態(tài)改變，由紡錘形的成纖維細(xì)胞樣逐漸收縮變短，90％以上細(xì)胞成為立方形或多角形；連續(xù)培養(yǎng)7天，鏡下可見細(xì)胞內(nèi)有微小脂滴出現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，脂滴逐漸增大并融合，至培養(yǎng)2周時(shí)，可見融合成團(tuán)的脂滴充滿整個(gè)細(xì)胞。油紅o染色可見細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的脂肪被特異性染成紅色。(圖6)

(3)成軟骨誘導(dǎo)

3代以上細(xì)胞，按照每管2×10⁵細(xì)胞分裝到15ml聚丙烯離心管，低速離心使細(xì)胞在試管中形成微團(tuán)，在含2.5％fbs的dmem-hg中加入胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鈉各6.25μg/ml，bsa1.25μg/ml，丙酮酸鈉1mm/l，抗壞血酸磷酸37.5μg/ml，tgf-β150ng/ml，放于37℃、5％co2、飽和濕度下培養(yǎng)，每3天半量換液，連續(xù)培養(yǎng)2周。

誘導(dǎo)2周后將細(xì)胞微團(tuán)打散涂片，阿辛藍(lán)(alcianblue)染色可見ii型膠原形成細(xì)胞外基質(zhì)呈藍(lán)色，對照組無藍(lán)染。(圖7)

6、rt-pcr檢測胎盤msc多向分化潛能

收集誘導(dǎo)后的細(xì)胞，應(yīng)用trizol試劑提取細(xì)胞總rna，以之為模板進(jìn)行rt-pcr，反轉(zhuǎn)錄以及pcr操作按照rt-pcr試劑盒說明書進(jìn)行，引物名稱、引物序列、pcr產(chǎn)物大小、特異性等如cn102676451a之[0086]～[0087]之表1所示。

圖8中，從左至右分別為：胎盤msc細(xì)胞、誘導(dǎo)成為脂肪細(xì)胞、誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞、誘導(dǎo)為軟骨細(xì)胞的rt-pcr電泳照片，其中從左至右，normal泳道為誘導(dǎo)前細(xì)胞基因表達(dá)情況，adipogenic泳道、osteogenic泳道、chondrogenic泳道為誘導(dǎo)后細(xì)胞基因表達(dá)情況。結(jié)果表明，體外誘導(dǎo)后細(xì)胞能表達(dá)系列特異性mrna：成脂肪誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)ppar-γ，成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)骨橋蛋白(osteopontin)，成軟骨誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)膠原ii(collagenii)，說明所得到的msc細(xì)胞具有成骨、成脂肪、成軟骨分化能力，符合公認(rèn)的msc標(biāo)準(zhǔn)。

通過以上一系列數(shù)據(jù)指標(biāo)的檢測，顯示出應(yīng)用本發(fā)明方法分離得到的msc，具有向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞分化的能力，證實(shí)本發(fā)明方法獲得的msc具有干細(xì)胞特性。

實(shí)施例4、胎盤干細(xì)胞庫的建立

1、細(xì)胞活性的檢測

利用臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)凍存前后活細(xì)胞的數(shù)目。

2、細(xì)胞污染的檢測

利用少量細(xì)胞培養(yǎng)，檢測細(xì)胞是否受到真菌和細(xì)菌的污染。利用病原學(xué)方法，檢測細(xì)胞是否受到乙肝兩對半、丙肝、艾滋、巨細(xì)胞病毒、eb病毒和梅毒、hbsag、hbsab、hbcab、hbeag、hbeab、hcvab、hiv-1/2ab、cmv-igm和ebv-iga、trust感染。

3、遺傳病的檢測

利用分子遺傳學(xué)的方法，檢測凍存細(xì)胞是否存在遺傳病。

4、hla-abc/dr配型

檢測細(xì)胞hla-abc/dr表型，并記錄在案。

5、細(xì)胞來源的調(diào)查

記錄胎兒及其父母的詳細(xì)資料，并記錄在案。

6、胎盤干細(xì)胞數(shù)據(jù)庫的建立

在保存正常的胎盤干細(xì)胞后，建立胎盤干細(xì)胞的數(shù)據(jù)庫，其中包括前六項(xiàng)資料，并建立與凍存細(xì)胞的關(guān)聯(lián)。