本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。更具體地，涉及一種腸道細(xì)菌抗生素抗性基因的定量檢測方法。
背景技術(shù)：
：近年來由于抗生素在養(yǎng)殖業(yè)和畜牧業(yè)中的大量使用，導(dǎo)致其對(duì)環(huán)境污染的問題日趨嚴(yán)重，已成為當(dāng)前國際上的研究熱點(diǎn)之一。我國是凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖大國，但近年來由于水產(chǎn)養(yǎng)殖污染加劇，造成養(yǎng)殖環(huán)境質(zhì)量不斷惡化，病原生物種類增多和傳播速度加快，養(yǎng)殖病害日趨嚴(yán)重，水產(chǎn)養(yǎng)殖中的病害問題特別是細(xì)菌性病害在密集型養(yǎng)殖系統(tǒng)中發(fā)生頻繁且影響嚴(yán)重，這極大地限制了我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。目前病害防治的主要方法是使用抗生素類藥物，抗生素作為飼料添加劑在動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)中使用非常普遍。抗生素的長期濫用很可能會(huì)誘導(dǎo)動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生抗生素抗性基因（antibioticsresistancegenes，args），args經(jīng)排泄后將對(duì)養(yǎng)殖區(qū)域及其周邊環(huán)境造成潛在基因污染。隨著抗生素類藥物不斷的大量使用，許多細(xì)菌都有了耐藥性，且情況日益嚴(yán)重，抗生素抗性基因已經(jīng)成為一種新型的環(huán)境污染物。目前在不同介質(zhì)如水體、沉積物、水生生物腸道中細(xì)菌均已檢出args的存在，并且有研究還發(fā)現(xiàn)args能夠通過可移動(dòng)的遺傳元件（geneticmobileelements）在細(xì)菌之間傳播，進(jìn)而在環(huán)境中擴(kuò)散，這將會(huì)對(duì)公共健康和食品安全構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。針對(duì)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)大量使用抗生素這一現(xiàn)狀，開展腸道抗生素抗性基因污染的研究，建立凡納濱對(duì)蝦腸道細(xì)菌抗生素抗性基因定量檢測方法，揭示抗生素抗性基因在漁業(yè)環(huán)境中的擴(kuò)散和傳播規(guī)律，對(duì)于評(píng)價(jià)抗生素抗性基因的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)十分必要。不僅能確保我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展，而且對(duì)于我國的生態(tài)安全和經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前，人們普遍認(rèn)為抗生素對(duì)腸道微生物的耐藥性的選擇和誘導(dǎo)可能是其環(huán)境效應(yīng)最重要的部分?？股貙?duì)耐藥菌株抗性基因args的誘導(dǎo)具專一性，因此可以認(rèn)為抗生素本身在環(huán)境中的遷移、轉(zhuǎn)化及歸趨等環(huán)境行為與其所誘導(dǎo)的抗生素抗性基因在環(huán)境中的廣泛傳播在理論上應(yīng)該具有很大的相似性和一致性。己有一些研究證實(shí)了抗性基因的存在與抗生素的使用之間存在很好的相關(guān)性。研究表明，攜帶args的微生物菌株死亡后，攜帶args的dna可釋放到周圍環(huán)境中并持久存在，原因是在脫氧核糖核酸酶的保護(hù)下，防止其被降解，裸露的dna分子最終又可以轉(zhuǎn)入到其他細(xì)胞內(nèi)。抗生素抗性基因的分子檢出可以確定無疑地證明細(xì)菌的耐藥性，闡釋細(xì)菌耐藥機(jī)理，更可以檢查耐藥因子的起源及傳播擴(kuò)散途徑和動(dòng)態(tài)。利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)測定抗生素抗性基因的核酸序列還可用來檢測抗生素抗性基因的變異，用來追蹤某一抗生素抗性基因的系統(tǒng)發(fā)生和進(jìn)化演化，并通過計(jì)算機(jī)分子結(jié)構(gòu)建模而預(yù)測該抗生素抗性基因表達(dá)產(chǎn)物耐藥譜的演化。目前的抗生素抗性基因的定量檢測方法主要是利用平板法培養(yǎng)腸道總細(xì)菌，對(duì)腸道細(xì)菌的數(shù)量進(jìn)行測定，并用抗性平板法篩選出抗性細(xì)菌，測定攜帶抗生素抗性基因的細(xì)菌數(shù)量，得到攜帶抗生素抗性基因的細(xì)菌的比例。然后從培養(yǎng)的菌體中提取dna，再利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（pcr）檢測抗性基因的種類。由于腸道中許多微生物難以平板培養(yǎng)，主要是因?yàn)閷?duì)其最適生長溫度、ph、氧、營養(yǎng)成分等不十分清楚。因此，以傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)的方法難免低估了腸道微生物的數(shù)量，對(duì)于評(píng)價(jià)腸道細(xì)菌抗性基因的攜帶量有較大的偏差。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供一種腸道細(xì)菌抗生素抗性基因的定量檢測方法。所述方法安全環(huán)保，價(jià)格低廉，步驟簡單，耗時(shí)短，結(jié)果穩(wěn)定可靠。本發(fā)明的目的是提供一種腸道細(xì)菌抗生素抗性基因的定量檢測方法。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案給予實(shí)現(xiàn)的：一種腸道細(xì)菌抗生素抗性基因的定量檢測方法，包括如下步驟：s1.提取腸道細(xì)菌總dna；s2.以腸道細(xì)菌總dna為模板，pcr擴(kuò)增抗生素抗性基因和16srrna基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接至克隆載體，然后轉(zhuǎn)化宿主菌，獲得陽性克?。粚㈥栃钥寺U(kuò)繁后抽提質(zhì)粒，測定其拷貝濃度，10倍梯度稀釋成標(biāo)準(zhǔn)品模板，通過熒光定量pcr檢測建立拷貝數(shù)與ct值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線；s3.將陽性質(zhì)粒和樣品進(jìn)行熒光定量pcr擴(kuò)增，計(jì)算樣品中攜帶的抗生素抗性基因拷貝數(shù)，得到抗生素抗性基因的相對(duì)含量。優(yōu)選地，所述抗生素抗性基因?yàn)猷Z酮類抗生素抗性基因qnrb、qnrd、qnrs；或磺胺類抗生素抗性基因sul1、sul2、sul3。優(yōu)選地，所述喹諾酮類抗生素抗性基因qnrb、qnrd、qnrs的pcr引物序列依次如seqidno:1～6所示。優(yōu)選地，所述磺胺類抗生素抗性基因sul1、sul2、sul3的pcr引物序列依次如seqidno:7～12所示。優(yōu)選地，所述喹諾酮類抗生素抗性基因qnrb、qnrd、qnrs的pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30，55～57℃退火30s，72℃延伸10s，共30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸7min。優(yōu)選地，所述磺胺類抗生素抗性基因sul1、sul2、sul3的pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30，55～59℃退火30s，72℃延伸10s，共30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸7min。優(yōu)選地，所述16srrna基因的pcr引物序列如seqidno:13～14所示。優(yōu)選地，所述，16srrna基因的pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30，57℃退火30s，72℃延伸10s，共30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸7min。由于凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)大量使用抗生素，因此，上述腸道細(xì)菌抗生素抗性基因的定量檢測方法尤其適用于凡納濱對(duì)蝦腸道抗生素抗性基因的定量檢測。因此，優(yōu)選地，所述腸道細(xì)菌為凡納濱對(duì)蝦腸道細(xì)菌。優(yōu)選地，所述凡納濱對(duì)蝦腸道細(xì)菌dna的提取方法包括如下步驟：s1.在無菌環(huán)境中解剖凡納濱對(duì)蝦，取出對(duì)蝦腸道，加入dna保存液，置于4℃保存；s2.從保存液中取出對(duì)蝦腸道，加入pbs緩沖液，再加入玻璃破碎珠和氧化鋯破碎珠，4000～5000rpm振蕩8～10s，9000～11000g離心40～60s，除去上清液.；再加入tenp溶液，渦旋20～30s，9000～11000g離心40～60s，除去上清液，重復(fù)2～4次；離心后得到的沉淀，用試劑盒提取dna。優(yōu)選地，步驟s1所述dna保存液的配方為75%乙醇，22%無菌水，3%0.5medta（ph=8.0）。優(yōu)選地，步驟s1所述dna保存液的用量為1～3ml（優(yōu)選1ml）。優(yōu)選地，步驟s2所述pbs緩沖液的用量為1～3ml（優(yōu)選1ml）。優(yōu)選地，所述玻璃破碎珠和氧化鋯破碎珠的粒徑為0.1～0.2mm（優(yōu)選0.1mm）。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明建立的腸道細(xì)菌抗生素抗性基因的定量檢測方法有效，安全環(huán)保，價(jià)格低廉，步驟簡單，耗時(shí)短，結(jié)果穩(wěn)定可靠。檢測結(jié)果準(zhǔn)確，穩(wěn)定，重復(fù)性好，靈敏度高，實(shí)用性強(qiáng)，簡便快速，可運(yùn)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖生物和養(yǎng)殖環(huán)境抗生素抗性菌株篩選和鑒定及相關(guān)分析，具有很高的理論研究意義和實(shí)用價(jià)值。附圖說明圖1為qnrb相對(duì)含量變化圖，cont為對(duì)照組，ciph為高濃度環(huán)丙沙星組，cipl為低濃度環(huán)丙沙星組。圖2為qnrd相對(duì)含量變化圖，cont為對(duì)照組，ciph為高濃度環(huán)丙沙星組，cipl為低濃度環(huán)丙沙星組。圖3為qnrs相對(duì)含量變化圖，cont為對(duì)照組，ciph為高濃度環(huán)丙沙星組，cipl為低濃度環(huán)丙沙星組。圖4為sul1相對(duì)含量變化圖，cont為對(duì)照組，sulh為高濃度磺胺二甲嘧啶組，sull為低濃度磺胺二甲嘧啶組。圖5為sul2相對(duì)含量變化圖，cont為對(duì)照組，sulh為高濃度磺胺二甲嘧啶組，sull為低濃度磺胺二甲嘧啶組。圖6為sul3相對(duì)含量變化圖，cont為對(duì)照組，sulh為高濃度磺胺二甲嘧啶組，sull為低濃度磺胺二甲嘧啶組。具體實(shí)施方式以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本
技術(shù)領(lǐng)域：
常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。除非特別說明，以下實(shí)施例所用試劑和材料均為市購。實(shí)施例1抗生素抗性菌株篩選和鑒定1、在茂名市冠利海洋生物科技公司進(jìn)行樣品采集。凡納濱對(duì)蝦規(guī)格為50～60尾/斤，體長約13～15cm，體重約10g。將對(duì)蝦在水族箱暫養(yǎng)2天后，隨機(jī)分為5組，每組80尾對(duì)蝦。根據(jù)蝦體重量，添加不同濃度抗生素，如表1所示?？股厝芙夂笈c飼料混勻后投喂到水族箱中，飼料用量為1%蝦體重。表1分組設(shè)計(jì)情況組類型抗生素類型抗生素濃度cont對(duì)照組不使用ciph高濃度環(huán)丙沙星組環(huán)丙沙星40mg/千克蝦體重cipl低濃度環(huán)丙沙星組環(huán)丙沙星20mg/千克蝦體重sulh高濃度磺胺二甲嘧啶組磺胺二甲嘧啶200mg/千克蝦體重sull低濃度磺胺二甲嘧啶組磺胺二甲嘧啶100mg/千克蝦體重在投喂抗生素前、投喂后第1天、投喂后第2天、投喂后第3天、投喂后第4天，從每組中隨機(jī)挑取4條對(duì)蝦用于抗生素抗性基因檢測。2、對(duì)蝦腸道細(xì)菌總dna的提?。?）在無菌環(huán)境中解剖，取出對(duì)蝦腸道，加入1mldna保存液，置于4℃保存。保存液配方為：75%乙醇，22%無菌水，3%0.5medta（ph=8.0）。（2）從保存液中取出對(duì)蝦腸道，放入無菌的2ml離心管中，加入1mlpbs緩沖液，加入0.1g0.1mm玻璃破碎珠和0.1g1mm氧化鋯破碎珠，使用biospec研磨珠均質(zhì)器以5000rpm振蕩10s。10000g離心1分鐘，除去上清液。（3）加入1mltenp溶液，渦旋30秒，10000g離心1分鐘，除去上清液，重復(fù)3次。tenp溶液配方為：20mmol/ledta（ph=8.0），50mmol/ltris（ph=8.0）,1%pvpp,100mmol/lnacl,ph=8.0。（4）離心后得到的沉淀，以mobiopowerfecaldnaisolationkit試劑盒提取dna。3、熒光定量pcr標(biāo)準(zhǔn)品的制備（1）取制備的腸道細(xì)菌dna模板液，以表2所述引物對(duì)進(jìn)行抗生素抗性基因和16srrna基因的pcr擴(kuò)增（引物由華大基因合成）。表2抗生素抗性基因的pcr擴(kuò)增引物引物名稱序列（5’-3’）seqidno：1qnrb-f5’-gcgacgttcagtggttcag-3’seqidno：2qnrb-r5’-tgtccaacttaacgccttgtaa-3’seqidno：3qnrd-f5’-agtgagtgtttagctcaaggag-3’seqidno：4qnrd-r5’-cagtgccattccagcgatt-3’seqidno：5qnrs-f5’-gtatagagttccgtgcgtgtga-3’seqidno：6qnrs-r5’-ggttcgttcctatccagcgatt-3’seqidno：7sul1-f5’-cgcaccggaaacatcgctgcac-3’seqidno：8sul1-r5’-tgaagttccgccgcaaggctcg-3’seqidno：9sul2-f5’-gctcaaggcagatggcattc-3’seqidno：10sul2-r5’-cataacgacgagtttggcagat-3’seqidno：11sul3-f5’-tccgttcagcgaattggtgcag-3’seqidno：12sul3-r5’-ttcgttcacgccttacaccagc-3’seqidno：1316srrna-f5’-cgaatatggaatccctagtaact-3’seqidno：1416srrna-r5’-gcccactcagttcgatacgc-3’pcr反應(yīng)體系為40μl，內(nèi)含2×pcrreactionmix、10μm的引物、含50～150ng的dna模板溶液、ddh2o。具體成分見表3，（其中2×pcrreactionmix購買于北京康潤科技有限公司）。表3pcr反應(yīng)體系成分體積dna模板2μl上游引物2μl下游引物2μl2×pcrreactionmix20μlddh2o14μl擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，退火30s，72℃延伸10s，共30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5min。具體退火溫度如表4所示：表4擴(kuò)增基因的退火溫度基因退火溫度qnrb55℃qnrd57℃qnrs55℃sul155℃sul259℃sul355℃16srrna57℃擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其大小、純度及亮度。（2）采用omega公司（美國）的e.z.n.agelextractionkit進(jìn)行割膠純化后，使用nanovue測定pcr回收產(chǎn)物濃度。（3）使用北京全式金生物技術(shù)有限公司的peasyt1cloningkit構(gòu)建攜帶抗生素抗性基因質(zhì)粒。得到連接產(chǎn)物后，取5μl產(chǎn)物于50μl的dh5α感受態(tài)細(xì)胞，冰浴20分鐘。42℃水浴熱激30秒，立即置于冰上2分鐘。加入250μllb液體培養(yǎng)基，在37℃培養(yǎng)1小時(shí)。取100μl菌液均勻涂在lb平板上，在37℃培養(yǎng)16h，挑取單菌落鑒定陽性克隆，并接種到新的lb液體培養(yǎng)基中。（4）取1ml菌液接種到10ml新鮮的lb液體培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)12小時(shí)。使用omega公司（美國）的plasmidminikit回收質(zhì)粒。使用nanovue測定質(zhì)粒濃度，計(jì)算dna拷貝數(shù)。計(jì)算公式為：copynumber=（dna/ng×6.022×1023）/（質(zhì)粒長度/bp×109×660）。（5）將args質(zhì)粒以10倍稀釋法進(jìn)行稀釋，拷貝數(shù)從n×108稀釋到n×101，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品的dna稀釋至50～100ng/μl，使用promega公司（美國）的gotaqqpcrmastermix試劑盒進(jìn)行定量pcr，各基因的熒光定量引物與前面普通pcr克隆的定性引物相同，根據(jù)ct值計(jì)算拷貝數(shù)。以16srrna基因作為參照基因，抗生素抗性基因相對(duì)含量計(jì)算方法為：抗生素抗性基因拷貝數(shù)/16srrna基因拷貝數(shù)。計(jì)算攜帶args基因的細(xì)菌的比例。實(shí)施例2凡納濱對(duì)蝦腸道細(xì)菌抗性基因的實(shí)時(shí)定量檢測1、利用實(shí)施例1建立的方法分別對(duì)在投喂抗生素前、投喂后第1天、投喂后第2天、投喂后第3天、投喂后第4天的抗生素抗性基因進(jìn)行定量pcr檢測。在投喂環(huán)丙沙星前，腸道內(nèi)qnrbcopies/16scopies為3.37×10-3，qnrdcopies/16scopies為5.34×10-4，qnrscopies/16scopies為3.30×10-3。投喂磺胺二甲嘧啶前，sul1copies/16scopies為2.53×10-3，sul2copies/16scopies為2.21×10-2，sul3copies/16scopies為5.55×10-4。2、抗生素抗性基因的變化（1）對(duì)于qnrb基因，在ciph組，qnrbcopies/16copies從投喂后第1天到第4天依次為6.73×10-2、9.74×10-2、1.15×10-1、1.11×10-1。在cipl組，qnrbcopies/16copies從投喂后第1天到第4天依次為3.19×10-2、1.06×10-1、1.28×10-1、1.20×10-1（圖1）。投喂環(huán)丙沙星后，攜帶qnrb基因的細(xì)菌比例上升。（2）對(duì)于qnrd基因，在ciph組，qnrdcopies/16copies從投喂后第1天到第4天依次為1.16×10-3、3.15×10-3、3.97×10-3、2.27×10-3。在cipl組，qnrdcopies/16copies從投喂后第1天到第4天依次為1.78×10-3、2.95×10-3、3.28×10-3、1.79×10-3（圖2）。投喂環(huán)丙沙星后，攜qnrd基因的細(xì)菌比例上升。（3）對(duì)于qnrs基因，在ciph組，qnrscopies/16copies從投喂后第1天到第4天依次為1.69×10-3、1.98×10-3、3.67×10-3、3.78×10-3。在cipl組，qnrscopies/16copies從投喂后第1天到第4天依次為2.50×10-3、3.06×10-3、3.19×10-3、1.86×10-3（圖3）。投喂環(huán)丙沙星后，攜帶qnrs基因的細(xì)菌比例上升。（4）對(duì)于sul1基因，在sulh組，sul1copies/16copies從投喂后第1天到第4天依次為4.32×10-3、3.45×10-3、4.28×10-3、4.80×10-3。在sull組，sul1copies/16copies從投喂后第1天到第4天依次為3.81×10-3、2.94×10-3、2.54×10-3、2.42×10-3（圖4）。投喂高濃度磺胺二甲嘧啶后，攜帶sul1基因的細(xì)菌比例從第1天至第4天持續(xù)增加。投喂低濃度磺胺二甲嘧啶后，攜帶sul1基因的細(xì)菌比例從第1天至第3天持續(xù)增加，第4天略有降低，但仍高于對(duì)照組。（5）對(duì)于sul2基因，在sulh組，sul2copies/16copies從投喂后第1天到第4天依次為2.92×10-2、3.91×10-2、3.54×10-2、2.63×10-2。在sull組，sul2copies/16copies從投喂后第1天到第4天依次為2.07×10-2、2.12×10-2、3.13×10-2、1.13×10-2（圖5）。投喂高濃度磺胺二甲嘧啶后，攜帶sul2基因的細(xì)菌比例從第1天至第4天持續(xù)增加。投喂低濃度磺胺二甲嘧啶后，攜帶sul2基因的細(xì)菌比例在第2天增加，從第3天開始降低。（6）對(duì)于sul3基因，在sulh組，sul3copies/16copies從投喂后第1天到第4天依次為1.77×10-3、3.77×10-3、2.72×10-3、2.32×10-4。在sull組，sul3copies/16copies從投喂后第1天到第4天依次為3.17×10-3、8.90×10-3、4.94×10-3、3.39×10-4（圖6）。投喂高濃度磺胺二甲嘧啶后，攜帶sul3基因的細(xì)菌比例從第1天至第2天增加，第3天開始降低，第4天降低至比投喂前水平更低。投喂低濃度磺胺二甲嘧啶后，攜帶sul3基因的細(xì)菌比例從第1天至第2天增加，第3天開始降低，第4天降低至比投喂前水平更低?？梢?，本發(fā)明針對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道細(xì)菌抗生素抗性基因的定量檢測方法，有效，安全環(huán)保，價(jià)格低廉，步驟簡單，耗時(shí)短，結(jié)果穩(wěn)定可靠。運(yùn)用熒光定量pcr檢測抗性基因結(jié)果準(zhǔn)確，穩(wěn)定，重復(fù)性好，靈敏度高，實(shí)用性強(qiáng)，簡便快速，具有十分廣闊的應(yīng)用前景，可運(yùn)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖生物和養(yǎng)殖環(huán)境抗生素抗性菌株篩選和鑒定及相關(guān)分析，具有很高的理論研究意義和實(shí)用價(jià)值。sequencelisting<110>中山大學(xué)<120>腸道細(xì)菌抗生素抗性基因的定量檢測方法<130>2017<160>14<170>patentinversion3.3<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列<400>1gcgacgttcagtggttcag19<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<400>2tgtccaacttaacgccttgtaa22<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列<400>3agtgagtgtttagctcaaggag22<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列<400>4cagtgccattccagcgatt19<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列<400>5gtatagagttccgtgcgtgtga22<210>6<211>22<212>dna<213>人工序列<400>6ggttcgttcctatccagcgatt22<210>7<211>22<212>dna<213>人工序列<400>7cgcaccggaaacatcgctgcac22<210>8<211>22<212>dna<213>人工序列<400>8tgaagttccgccgcaaggctcg22<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列<400>9gctcaaggcagatggcattc20<210>10<211>22<212>dna<213>人工序列<400>10cataacgacgagtttggcagat22<210>11<211>22<212>dna<213>人工序列<400>11tccgttcagcgaattggtgcag22<210>12<211>22<212>dna<213>人工序列<400>12ttcgttcacgccttacaccagc22<210>13<211>23<212>dna<213>人工序列<400>13cgaatatggaatccctagtaact23<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列<400>14gcccactcagttcgatacgc20當(dāng)前第1頁12