本申請(qǐng)為分案申請(qǐng)，其原申請(qǐng)的申請(qǐng)日為2008年11月24日，申請(qǐng)?zhí)枮?00880126212.7，名稱為“與多重基因組獲得和丟失分析相關(guān)的方法和組合物”。

相關(guān)申請(qǐng)的參引

本申請(qǐng)要求2008年11月21日提交的流水號(hào)為12/275,895的美國(guó)專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，所述美國(guó)專利申請(qǐng)為2008年3月26日提交的流水號(hào)為12/055,919的美國(guó)專利申請(qǐng)的部分繼續(xù)申請(qǐng)，美國(guó)專利申請(qǐng)no.12/055,919要求2007年12月5日提交的流水號(hào)為60/992,489的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)。每一份申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容通過(guò)參引納入本申請(qǐng)。

本文描述的技術(shù)大體涉及核酸檢測(cè)用方法和組合物。更具體而言，所描述的是基因組獲得和丟失分析用方法和組合物。

背景技術(shù)：

通過(guò)對(duì)基因組獲得和丟失的檢測(cè)分析可以對(duì)構(gòu)成疾病、行為和認(rèn)知病癥以及其他遺傳病變的病因的遺傳性異常進(jìn)行檢測(cè)和診斷。

array-cgh(acgh)是一種多重分析方法，其中固定的dna探針捕獲來(lái)自測(cè)試樣本和參照樣本的經(jīng)標(biāo)記的互補(bǔ)基因組dna序列。每一個(gè)探針都會(huì)產(chǎn)生一個(gè)由探針序列界定的組成序列中的一個(gè)序列的測(cè)試量/參照量的比值。在acgh中，通常使用細(xì)菌人工染色體(bac)作為固定到陣列固體支持物上的探針材料。典型的bac序列長(zhǎng)度介于大約100kb至大約250kb之間，通常的長(zhǎng)度為175kb。這一長(zhǎng)度的探針?lè)浅＿m合acgh，原因在于它們長(zhǎng)到足以形成大的雜交信號(hào)，并且不會(huì)對(duì)小的突變?nèi)鐂np產(chǎn)生響應(yīng)，然而又短到足以提供充分的基因組解析力，從而較為精確地檢測(cè)基因組獲得或者丟失的斷點(diǎn)(breakpoint)。例如，一個(gè)設(shè)計(jì)精良的bac陣列可以檢測(cè)微缺失綜合征如1p36缺失綜合征或digeorge綜合征中不同大小的缺失區(qū)域，其中跨越疾病相關(guān)區(qū)域的不同部分的缺失可以對(duì)應(yīng)不同的表型。

所謂組成型acgh微陣列的設(shè)計(jì)正趨于使用多種單獨(dú)的探針，例如與先天dna障礙相關(guān)的每一個(gè)基因組區(qū)域中的bac探針，從而以較高的解析力檢測(cè)基因組獲得和丟失的程度。較高的解析力會(huì)揭示出更多有關(guān)獲得或丟失區(qū)域的確切大小和邊界的信息。但是，存在可能并不需要對(duì)獲得或者丟失區(qū)域的確切大小和邊界進(jìn)行高解析力檢測(cè)的情況。

非整倍性是基因組獲得-丟失異常的實(shí)例，其中以高解析力檢測(cè)斷點(diǎn)不再可行。非整倍性是一條完整的染色體(平均大小超過(guò)100mb)的獲得(最為典型，如三體性)或丟失，這與微缺失障礙相反，在后者中，缺失區(qū)域的典型長(zhǎng)度可能僅1至10mb左右。在acgh分析中，非整倍性檢測(cè)(也稱為染色體計(jì)數(shù)法)可以使用少到一種bac探針來(lái)進(jìn)行，但是從所述單種探針獲得的樣本/正常比值的噪音會(huì)使得結(jié)果不確切。使用靶向受試者染色體的多種探針(其中大多數(shù)探針全都表現(xiàn)出相同的獲得或丟失)為采用acgh分析的非整倍性檢測(cè)結(jié)果提供了更多的可信度，并且這是cgh分析的常規(guī)構(gòu)建方法。在明確地“稱為”或確定為獲得或者丟失之前，大部分陣列分析都需要某個(gè)區(qū)域中的至少兩種或三種或更多種bac探針的一致的比值信號(hào)。

獲得或者丟失區(qū)域中額外的個(gè)體探針?lè)肿訒?huì)增加獲得或者丟失檢測(cè)的可信度，這在分析信號(hào)比有噪音的情況下是有價(jià)值的。噪音因?yàn)槎喾N原因而存在于分析之中。有時(shí)，分析有噪音僅僅是因?yàn)樘结樄潭ɑ蛘邩颖痉跤龡l件不一致或者是因?yàn)闃?biāo)記、雜交、洗滌或干燥中條件并非最佳。在其他情況下，噪音可能是由于使用全基因組擴(kuò)增(wga)如phi-29或doppcr方法擴(kuò)增的樣本所引起的，其中擴(kuò)增樣本表現(xiàn)出序列特異性擴(kuò)增偏好。在初始的樣本量有限時(shí)，例如來(lái)自單個(gè)細(xì)胞或者來(lái)自僅幾個(gè)細(xì)胞的dna時(shí)，使用wga。這樣的擴(kuò)增樣本具有隨基因組的不同部分而改變的dna產(chǎn)物產(chǎn)量(擴(kuò)增偏好)，從而將基因組獲得-丟失噪音疊加到通常會(huì)導(dǎo)致在多種分別排列或分析的bac探針之間形成顯著的樣本/參照比值反應(yīng)差異的分析上。補(bǔ)償這一噪音的標(biāo)準(zhǔn)方法是使用多種探針以跨越目的基因組序列區(qū)域，并以某些方式，例如將貫穿基因組區(qū)域的比值反應(yīng)取平均值、利用多種探針的復(fù)合結(jié)果來(lái)作出貫穿該區(qū)域的獲得-丟失結(jié)論。在寡核苷酸cgh陣列中，將多種分別排列或者分析的探針之間的比值取平均值是特別常見(jiàn)的，這通常表現(xiàn)出比bac陣列更大的探針與探針之間的比值差異。

遺憾的是，為了增加可信度而使用針對(duì)同一區(qū)域的多種分別排列或分析的探針可能受到限制。例如，存在這樣的固定探針陣列的布局，其中使用多種分別排列或分析的探針來(lái)檢測(cè)各非整倍性問(wèn)題重重。一些cgh陣列形式局限于其能容納的探針數(shù)目。所述陣列的一個(gè)實(shí)例是印在微量板孔底部的陣列，或者印在顯微鏡用載玻片基底上一個(gè)小區(qū)域上的陣列，所述基底被構(gòu)造成可在單個(gè)基底上容納多個(gè)獨(dú)立的樣本。這些陣列通常使用9(3×3點(diǎn)陣列矩陣)至100(10×10)種探針。在所述100重的例子中，最多能容納4種探針來(lái)對(duì)24條染色體(1-22，x和y)中的每一條進(jìn)行計(jì)數(shù)，并且對(duì)于染色體計(jì)數(shù)法而言，陣列的整個(gè)容量將被有效地用盡。

除了平面微陣列之外，另一種同時(shí)使用多種探針來(lái)測(cè)量樣本中的基因組獲得和丟失的方法是使用一系列固定有探針的編碼顆?；蛭⑶颉Ｊ褂米顬閺V泛的顆粒平臺(tái)是luminexxmap系統(tǒng)，所述系統(tǒng)使用熒光顏色編碼來(lái)區(qū)分一百個(gè)不同的微球或小球類型。在基因組獲得-丟失分析中，該系統(tǒng)可以支持最多達(dá)100種不同的探針。同微陣列一樣，這一編碼微球平臺(tái)并不支持對(duì)由競(jìng)爭(zhēng)性雜交得到比值的雙染雙色讀數(shù)，但是通過(guò)對(duì)各測(cè)試樣本和參照樣本進(jìn)行獨(dú)立的并行分析、進(jìn)行恰當(dāng)?shù)貥?biāo)準(zhǔn)化并計(jì)算比值可以生成相同的比值。

在最大探針數(shù)受到局限的這些多重分析形式中，一直都需要對(duì)最多24條染色體(1-22，加上x(chóng)和y)的非整倍性進(jìn)行可靠地分析、但不為此目的而使用全部或者即使大部分的可能的探針系列。例如，在先天性障礙分析系列中，通常最希望的是不僅要探測(cè)非整倍性，還要探測(cè)幾種微缺失障礙。同樣地，使用一種或者兩種低分辨力的探針而非更多的常規(guī)探針，可以穩(wěn)定地進(jìn)行微缺失障礙分析(例如wolf-hirschhorn、willams-beuren、cri-du-chat等)，從而在探針受限的平臺(tái)上分析更多障礙。類似地，在癌癥細(xì)胞遺傳學(xué)中，除了所需解析力為整條染色體或者染色體臂丟失的其他區(qū)域之外，通常還有幾個(gè)需要相當(dāng)高解析力的獲得-丟失數(shù)據(jù)的區(qū)域。當(dāng)僅需要低解析力的基因組區(qū)域并不利用系列中相當(dāng)數(shù)量的探針，從而為更多針對(duì)需要更高解析力的區(qū)域的探針騰出了分析平臺(tái)容量時(shí)，這些系列將更為有用。

因此，需要這樣的方法和組合物，其能可靠地分析染色體水平和染色體臂水平的獲得和丟失，同時(shí)使得可以選擇用一種或者多種較高解析力的探針同時(shí)地分析其他的基因組區(qū)域。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本文描述了一種分析dna樣本的方法，所述方法包括提供一種與基底相連的復(fù)合核酸探針。所述復(fù)合核酸探針含有與參照基因組的基因組區(qū)域中兩個(gè)或者更多個(gè)基因組座位特異性雜交的核酸序列。所述基因組區(qū)域的特征在于具有第一末端和第二末端以及置于所述末端之間的至少400kb的中間區(qū)域。所述復(fù)合核酸探針包含基本上與含有所述基因組區(qū)域第一末端的完整第一基因組座位特異性地雜交的核酸序列，以及基本上與含有所述第二末端的完整第二基因組座位特異性地雜交的核酸序列。所述第一基因組座位和第二基因組座位通常各自含有至少約100kb。任選地，復(fù)合探針的核酸序列與所述基因組內(nèi)的其他座位特異性地雜交。

與基底相連的復(fù)合核酸探針在足以實(shí)現(xiàn)特異性雜交的嚴(yán)格度下與樣本基因組dna雜交。與基底相連的復(fù)合核酸探針也與參照基因組dna雜交。

檢測(cè)指示所述與基底相連的復(fù)合核酸探針與所述樣本基因組dna特異性雜交的第一信號(hào)，同時(shí)檢測(cè)指示所述與基底相連的復(fù)合核酸探針與所述參照基因組dna特異性雜交的第二信號(hào)。將所述第一信號(hào)與所述第二信號(hào)進(jìn)行比較，從而檢測(cè)所述第一和第二信號(hào)之間的差異，所述差異指示所述樣本dna和所述參照dna之間的差異。

與參照基因組的基因組區(qū)域中的兩個(gè)或者更多個(gè)基因組座位特異性雜交的核酸序列可以來(lái)源于兩個(gè)或者更多個(gè)大插入dna載體。例如，所述核酸序列來(lái)源于兩個(gè)或者更多個(gè)大插入dna載體，例如細(xì)菌人工染色體、酵母人工染色體、人類人工染色體、黏粒、質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體dna和f黏粒。與參照基因組的基因組區(qū)域中的兩個(gè)或者更多個(gè)基因組座位特異性雜交的核酸序列可以來(lái)源于分離的染色體和/或分離的染色體片段。

在一個(gè)具體的可選方案中，與參照基因組的基因組區(qū)域中的兩個(gè)或者更多個(gè)基因組座位特異性雜交的核酸序列為來(lái)源于兩個(gè)或者更多個(gè)大插入dna載體、分離的染色體、分離的染色體片段或者這些或者其他核酸來(lái)源的組合的擴(kuò)增子。

在一個(gè)具體的可選方案中，基底為多個(gè)顆粒如多個(gè)編碼顆粒。在另一個(gè)可選方案中，所述基底為平面基底。

與參照基因組的基因組區(qū)域中的兩個(gè)或者更多個(gè)基因組座位特異性雜交的核酸序列各自的長(zhǎng)度范圍為約20-250,000個(gè)核苷酸，包括端值。

本文提供了一種分析樣本核酸的方法，所述方法包括提供包含兩個(gè)或者更多個(gè)編碼顆粒系列的混合物的多重試劑，所述編碼顆粒系列被編碼，從而使得每一編碼顆粒系列的各個(gè)顆粒均可檢測(cè)地區(qū)別于其他每一編碼顆粒系列的各個(gè)顆粒。所述編碼顆粒含有所連接的與參照基因組的至少一個(gè)基因組座位特異性雜交的核酸序列，并且至少一個(gè)編碼顆粒系列含有所連接的復(fù)合核酸探針。

所述多重試劑可同時(shí)地或者平行地與樣本基因組核酸并與參照核酸雜交。

檢測(cè)指示所述連接的核酸序列與可檢測(cè)地標(biāo)記的樣本核酸特異性雜交的第一信號(hào)以及指示所述連接的核酸序列與可檢測(cè)地標(biāo)記的參照核酸特異性雜交的第二信號(hào)。然后鑒定所述編碼顆粒，從而將顆粒編碼情況與所述第一信號(hào)或與所述第二信號(hào)聯(lián)系起來(lái)。然后比較各個(gè)編碼顆粒系列的所述第一信號(hào)和所述第二信號(hào)，并且所述第一和第二信號(hào)的差異指示所述樣本和所述參照核酸之間的差異。

本文提供了一種用于分析核酸的試劑，所述試劑含有與固體基底相連的第一復(fù)合核酸探針。所述第一復(fù)合核酸探針包含與參照基因組的基因組區(qū)域中兩個(gè)或者更多個(gè)基因組座位特異性雜交的核酸序列。所述基因組區(qū)域的特征在于具有第一末端和第二末端以及置于所述第一末端和第二末端之間的至少400kb的中間區(qū)域。所述第一復(fù)合核酸探針包含基本上與含有所述基因組區(qū)域第一末端的完整第一基因組座位特異性雜交的核酸序列，以及基本上與含有所述基因組區(qū)域第二末端的完整第二基因組座位特異性雜交的核酸序列。

在一個(gè)具體的可選方案中，用于分析核酸的試劑含有至少兩種復(fù)合探針，并且可以包括更多種復(fù)合探針。例如，與固體基底相連的第二復(fù)合核酸探針含有與參照基因組的第二基因組區(qū)域中兩個(gè)或者更多個(gè)基因組座位特異性雜交的核酸序列。所述第二基因組區(qū)域的特征是具有第一末端和第二末端，并且具有置于所述第一末端和第二末端之間的至少400kb的中間區(qū)域。所述第二復(fù)合核酸探針包含基本上與含有所述第二基因組區(qū)域第一末端的完整第一基因組座位、以及基本上與含有所述第二基因組區(qū)域第二末端的完整第二基因組座位特異性雜交的核酸序列。

在一個(gè)可選方案中，所述固體基底是平面基底。含有一種或者多種復(fù)合探針的陣列可以包含在平面基底上。在另一個(gè)可選方案中，非復(fù)合探針也可以包含在該平面基底上，從而提供一組復(fù)合探針和其他探針。

在另一方面，所述固體基底為第一種多個(gè)顆粒。第二種復(fù)合探針或非復(fù)合探針可以與第二種多個(gè)顆粒連接。

所述第一種多個(gè)顆粒和所述第二種多個(gè)顆粒被可區(qū)別地編碼，用于某些分析類型中。任選地，混合所述第一種多個(gè)和第二種多個(gè)可區(qū)別地編碼顆粒，從而提供一種多重分析試劑。連接有額外探針的額外顆?？梢砸远嘀胤治鲂问交蛘擢?dú)立分析形式用于本文所描述的核酸分析中。

本文提供了一種制備用于分析dna的與基底相連的復(fù)合核酸探針試劑的方法，所述方法包括分離基本上與含有參照基因組的基因組區(qū)域的第一末端的完整第一基因組座位特異性雜交的第一核酸序列。所述方法包括分離基本上與含有參照基因組的基因組區(qū)域的第二末端的完整第二基因組座位特異性雜交的第二核酸序列?；旌纤龅谝缓退龅诙怂嵝蛄?，從而制備復(fù)合探針，并隨后將所述復(fù)合探針連接到固體基底，從而制備與基底相連的復(fù)合核酸探針試劑，用于分析核酸如基因組dna。

在一個(gè)具體的可選方案中，所述第一核酸序列分離自第一種大插入載體，所述第二核酸序列分離自第二種大插入載體。例如，所述第一核酸序列分離自第一種bac，所述第二核酸序列分離自第二種bac。

任選地，在混合之前或者之后擴(kuò)增所述第一和所述第二核酸序列。

具體實(shí)施方案提供了利用兩種或者多種參照樣本的方法。

具體實(shí)施方案提供了分析dna樣本的方法，所述方法包括：提供與基底相連的核酸探針；使所述與基底相連的核酸探針與獲自受試者的樣本基因組dna雜交；

使所述與基底相連的核酸探針與第一種參照基因組dna雜交；并使所述與基底相連的核酸探針與第二種參照基因組dna雜交。隨后檢測(cè)指示所述與基底相連的核酸探針與所述樣本基因組dna特異性雜交的第一信號(hào)、指示所述與基底相連的核酸探針與所述第一種參照基因組dna特異性雜交的第二信號(hào)以及指示所述與基底相連的核酸探針與所述第二種參照基因組dna特異性雜交的第三信號(hào)。比較所述第一信號(hào)和所述第二信號(hào)，從而檢測(cè)所述第一信號(hào)和第二信號(hào)之間的差異，所述第一和第二信號(hào)的差異指示所述樣本dna和所述第一種參照dna之間的差異。還比較所述第一信號(hào)和所述第三信號(hào)，從而檢測(cè)所述第一和第三信號(hào)之間的差異，所述第一和第三信號(hào)之間的差異指示所述樣本dna和所述第二種參照dna之間的差異。

任選地，根據(jù)分析所述dna樣本的方法的實(shí)施方案，將所述樣本dna和所述第一種參照dna之間的差異與所述樣本dna和所述第二種參照dna之間的差異進(jìn)行比較。

在又一個(gè)可選方案中，所述第一種參照基因組dna包括男性特異的基因組dna，所述第二種參照基因組dna包括女性特異的基因組dna，從而使得對(duì)所述第一和第二信號(hào)的差異的比較以及所述第一和第三信號(hào)的差異的比較可指示受試者的性別。

在另一個(gè)可選方案中，所述第一種參照基因組dna包括第一種病癥特異的基因組dna，所述第二種參照基因組dna包括第二種病癥特異的基因組dna。因此，對(duì)所述第一和第二信號(hào)的差異的比較與所述第一和第三信號(hào)的差異的比較可指示所述受試者的疾病狀態(tài)。

一些實(shí)施方案提供了這樣的方法，其中所述第一種參照基因組dna包括第一種病癥特異的基因組dna，所述第二種參照基因組dna包括第二種病癥特異的基因組dna，并且對(duì)所述第一和第二信號(hào)之間的差異的比較以及對(duì)所述第一和第三信號(hào)之間的差異的比較指示了所述受試者的新陳代謝年齡。

所述與基底相連的核酸探針可以包含多個(gè)編碼顆粒和/或一個(gè)平面基底。任選地，所述與基底相連的核酸探針包括多種寡核苷酸和/或多種擴(kuò)增子。所述與基底相連的核酸探針可以包括分離自大插入dna載體和/或分離的染色體dna的插入dna。

本發(fā)明的實(shí)施方案提供了分析dna樣本的方法，所述方法包括：提供含有連接有擴(kuò)增子的編碼顆粒的第一編碼顆粒系列。所述擴(kuò)增子包含合在一起基本上代表完整第一模板dna序列的隨機(jī)核酸序列。使所述第一編碼顆粒系列的擴(kuò)增子與可檢測(cè)地標(biāo)記的樣本dna、可檢測(cè)地標(biāo)記的第一種參照dna以及可檢測(cè)地標(biāo)記的第二種參照dna雜交。檢測(cè)指示所述第一編碼顆粒系列的擴(kuò)增子與可檢測(cè)地標(biāo)記的樣本dna特異性雜交的第一信號(hào)。檢測(cè)指示所述第一編碼顆粒系列的擴(kuò)增子與可檢測(cè)地標(biāo)記的第一種參照dna特異性雜交的第二信號(hào)。檢測(cè)指示所述第一編碼顆粒系列的擴(kuò)增子與可檢測(cè)地標(biāo)記的第二種參照dna特異性雜交的第三信號(hào)。比較所述第一信號(hào)和所述第二信號(hào)，以檢測(cè)所述第一和第二信號(hào)之間的差異，所述第一和第二信號(hào)的差異指示所述樣本dna和所述參照dna之間的差異。比較所述第一信號(hào)和所述第三信號(hào)，以檢測(cè)所述第一和第三信號(hào)之間的差異，所述第一和第三信號(hào)的差異指示所述樣本dna和所述第二種參照dna之間的差異。

在一個(gè)任選方案中，所述擴(kuò)增子的長(zhǎng)度范圍為大約500-1200個(gè)核苷酸，包括端值。

具體實(shí)施方案的方法還包括提供含有連接有擴(kuò)增子的編碼顆粒的第二編碼顆粒系列，其中所述擴(kuò)增子包含合在一起基本上代表完整第二模板dna序列的隨機(jī)核酸序列。使所述第二編碼顆粒系列的擴(kuò)增子與可檢測(cè)地標(biāo)記的樣本dna、可檢測(cè)地標(biāo)記的第一種參照dna和可檢測(cè)地標(biāo)記的第二種參照dna雜交。檢測(cè)指示所述第二編碼顆粒系列的擴(kuò)增子與可檢測(cè)地標(biāo)記的樣本dna特異性雜交的第一信號(hào)。檢測(cè)指示所述第二編碼顆粒系列的擴(kuò)增子與可檢測(cè)地標(biāo)記的第一種參照dna特異性雜交的第二信號(hào)。檢測(cè)指示所述第二編碼顆粒系列的擴(kuò)增子與可檢測(cè)地標(biāo)記的第二種參照dna特異性雜交的第三信號(hào)。比較所述指示所述第二編碼顆粒系列的擴(kuò)增子的特異性雜交的第一信號(hào)和所述指示所述第二編碼顆粒系列的擴(kuò)增子的特異性雜交的第二信號(hào)，以檢測(cè)所述第一信號(hào)和第二信號(hào)之間的差異，所述第一和第二信號(hào)的差異指示所述樣本dna和所述第一種參照dna之間的差異。比較所述指示所述第二編碼顆粒系列的擴(kuò)增子的特異性雜交的第一信號(hào)和所述指示所述第二編碼顆粒系列的擴(kuò)增子的特異性雜交的第三信號(hào)，以檢測(cè)所述第一和第三信號(hào)之間的差異，所述第一和第三信號(hào)的差異指示所述樣本dna和所述第二種參照dna之間的差異。

任選地，所述第一和第二編碼顆粒系列以混合物的形式提供。檢測(cè)顆粒編碼情況，從而將各顆粒系列的身份與通過(guò)樣本和參照dna雜交獲得的具體信號(hào)聯(lián)系起來(lái)。

附圖說(shuō)明

圖1是示出一個(gè)實(shí)施方案的流程圖，該實(shí)施方案包括使用兩個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)由模板dna制備擴(kuò)增子，并將擴(kuò)增子作為探針固定于一系列編碼小球上，其中該系列中的小球均具有相同的id代碼；

圖1a是示出一個(gè)實(shí)施方案的流程圖，該實(shí)施方案包括由單個(gè)bac克隆制備bac擴(kuò)增子，并將該擴(kuò)增子作為探針固定到一系列編碼小球上，從而形成一個(gè)小球系列，其中該系列中的小球全都具有相同的id代碼；

圖2是示出一個(gè)實(shí)施方案的流程圖，所述實(shí)施方案包括混合m個(gè)不同的編碼小球系列，各系列均具有其各自被固定的bac-擴(kuò)增子探針dna，它們合在一起形成多重編碼小球系列；

圖3是示出一個(gè)實(shí)施方案的流程圖，所述實(shí)施方案包括使用多重編碼小球系列在n個(gè)樣本上進(jìn)行多重基因組獲得和丟失分析；

圖3a為示出一個(gè)實(shí)施方案的流程圖，所述實(shí)施方案包括使用多重編碼小球系列在n個(gè)樣本上進(jìn)行多重基因組獲得和丟失分析；

圖4為sbs標(biāo)準(zhǔn)的96孔微孔板的模式圖，其示出了平行地對(duì)46份樣本運(yùn)行分析的兩份對(duì)照和兩份樣本的示例性位置；

圖5為使用男性的13號(hào)染色體上具有三體性的corielldna樣本所形成的數(shù)據(jù)的一個(gè)實(shí)例；

圖6為使用男性的18號(hào)染色體上具有三體性的corielldna樣本所形成的數(shù)據(jù)的一個(gè)實(shí)例；

圖7為使用女性的21號(hào)染色體上具有三體性的corielldna樣本所形成的數(shù)據(jù)的一個(gè)實(shí)例；

圖8為使用具有x染色體5拷貝擴(kuò)增的corielldna樣本所形成的數(shù)據(jù)的一個(gè)實(shí)例；

圖9為一張圖表，其示出了用于在示例性分析中形成固定到編碼小球上的擴(kuò)增子的bac克隆、其染色體和cytoband位置、陰性對(duì)照寡核苷酸的序列和固定有各擴(kuò)增子探針的小球系列的小球id(luminex小球區(qū))；

圖10a是示出根據(jù)本文所述方法的一個(gè)方面的一種制備復(fù)合探針的方法的簡(jiǎn)化流程圖；

圖10b是示出根據(jù)本文所述方法的一個(gè)方面的一種制備復(fù)合探針的方法的簡(jiǎn)化流程圖；

圖11是示出根據(jù)本文所述方法的一個(gè)方面的一種制備復(fù)合探針的方法的簡(jiǎn)化流程圖；

圖12是由測(cè)試分析獲得的數(shù)據(jù)繪制的圖，示出了復(fù)合探針與digeorge綜合征參照dna樣本的使用；

圖13是一幅示出由使用兩種參照基因組dna樣本的luminex小球陣列獲得-丟失分析得到的比值數(shù)據(jù)的圖；和

圖14是一幅示出由使用兩種參照基因組dna樣本的luminex小球陣列獲得-丟失分析得到的比值數(shù)據(jù)的圖。

具體實(shí)施方式

本文提供了與染色體獲得和丟失分析相關(guān)的方法和組合物。泛泛的說(shuō)，本文描述了與使用與基底相連的核酸探針的基因組dna獲得和丟失分析相關(guān)的方法和組合物。

本文使用的科技術(shù)語(yǔ)旨在具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的含義。這些術(shù)語(yǔ)在多部權(quán)威的參考書中被定義和使用，所述參考書例如包括j.sambrookandd.w.russell,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress；3rded.,2001；f.m.ausubel,ed.,shortprotocolsinmolecularbiology,currentprotocols；5thed.,2002；b.albertsetal.,molecularbiologyofthecell,4thed.,garland,2002；d.l.nelsonandm.m.cox,lehningerprinciplesofbiochemistry,4thed.,w.h.freeman&company,2004；和herdewijn,p.(ed.),oligonulceotidesynthesis:methodsandapplications,methodsinmolecularbiology,humanapress,2004。

本文所使用的術(shù)語(yǔ)“核酸”是指任何形式(包括單鏈、雙鏈的寡核苷酸或多核苷酸)的具有多于1個(gè)核苷酸的rna或dna分子。

探針

本文所使用的術(shù)語(yǔ)“探針”是指用于識(shí)別靶核酸的核酸，所述靶核酸與所述探針特異性結(jié)合。

用于本文所述分析中的核酸探針可以包括細(xì)胞或者生物體的基因組的全部的或者部分。所述核酸探針可以包括表現(xiàn)為一條或者多條染色體、染色體的一部分、基因座、基因或基因的一部分的dna。所述核酸探針可以為任何形式如載體中的插入物，所述載體例如包括細(xì)菌人工染色體、酵母人工染色體、人類人工染色體、黏粒、質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體dna或f黏粒。所述核酸探針可以是顯微切割的染色體dna形式。因此，盡管本文描述的具體實(shí)例是作為核酸探針dna來(lái)源的bac，但是也可以使用其他類型的克隆，如pac、yac、黏粒、f黏粒、cdna等。

在具體應(yīng)用中，核酸被用作用于擴(kuò)增的模板材料，所得到的擴(kuò)增子或其部分被用作探針。

用于形成核酸探針、樣本或者參照的核酸均通過(guò)本領(lǐng)域已知方法獲得，例如如j.sambrookandd.w.russell,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress；3rded.,2001或f.m.ausubel,ed.,shortprotocolsinmolecularbiology,currentprotocols；5thed.,2002所述。核酸還可以購(gòu)買獲得和/或使用市售試劑盒獲得。

復(fù)合探針

具體實(shí)施方案提供了一種復(fù)合核酸探針，所述復(fù)合核酸探針含有與參照基因組中目標(biāo)基因組區(qū)域的兩個(gè)或者更多個(gè)基因組座位特異性雜交的核酸序列。所述基因組區(qū)域的特征是具有第一末端和第二末端以及置于所述末端之間的至少400kb的中間區(qū)域。復(fù)合核酸探針包含基本上與含有基因組區(qū)域第一末端的完整第一基因組座位特異性雜交的核酸序列，以及基本上與含有第二末端的完整第二基因組座位特異性地雜交的核酸序列。第一基因組座位和第二基因組座位通常分別都含有至少大約100kb，并且可以更大。

與參照基因組的基因組區(qū)域中兩個(gè)或者更多個(gè)基因組座位特異性雜交的核酸序列可以來(lái)源于兩個(gè)或者更多個(gè)大插入dna載體。例如，所述核酸序列來(lái)源于兩個(gè)或者更多個(gè)大插入dna載體，如細(xì)菌人工染色體、酵母人工染色體、人類人工染色體、pl來(lái)源的人工染色體(pac)、黏粒、質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體dna和f黏粒。與參照基因組的基因組區(qū)域中兩個(gè)或者更多個(gè)基因組座位特異性雜交的核酸序列也可以來(lái)源于分離的染色體和/或分離的染色體片段。

在一個(gè)具體的可選方案中，與參照基因組的基因組座位中兩個(gè)或者更多個(gè)基因組座位特異性雜交的核酸序列為由來(lái)源于兩個(gè)或者更多個(gè)大插入dna載體、分離的染色體、分離的染色體片段或者這些或其他核酸來(lái)源的組合的模板擴(kuò)增得到的擴(kuò)增子。

在具體實(shí)施方案中，與參照基因組的基因組區(qū)域中兩個(gè)或者更多個(gè)基因組座位特異性雜交的核酸序列以寡核苷酸和/或多核苷酸的形式提供，其各自的長(zhǎng)度范圍為大約20-250,000個(gè)核苷酸，包括端值，并且合在一起基本上可與含有所述基因組區(qū)域第一末端的完整第一基因組座位特異性雜交，并基本上與含有所述基因組區(qū)域第二末端的完整第二基因組座位特異性雜交。

因此，復(fù)合探針可以含有2種或更多種bac的匯集物(pool)，或者來(lái)源于2種或更多種bac的插入dna。任選地，所述匯集物可以含有來(lái)源于4種至約100種bac(包括端值)的插入dna。所述探針dna可以提取自經(jīng)培養(yǎng)的bac，或者在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，可以為利用例如簡(jiǎn)并寡核苷酸引物(dop)pcr或連接反應(yīng)介導(dǎo)的pcr由bacdna獲得的擴(kuò)增子?？梢允褂闷渌蟛迦胛锟寺∪鏿ac、yac、黏粒、f黏粒等來(lái)替代bac。也可以使用大量寡核苷酸的匯集物。

在一個(gè)具體的方面，固定的復(fù)合探針可以是來(lái)源于經(jīng)分選的染色體的dna?？梢允褂梅诌x細(xì)胞的流式細(xì)胞儀(也稱為熒光激活的細(xì)胞分選儀；facs)來(lái)形成經(jīng)分選染色體的匯集物，其中所述分選以對(duì)基因組的at富集區(qū)和gc富集區(qū)特異的染料之間的信號(hào)比為基礎(chǔ)。由所述經(jīng)分選染色體提取的dna可以通過(guò)wga擴(kuò)增，并用熒光染料標(biāo)記，以在中期染色體fish分析中用作染色體涂染探針。類似地，染色體臂涂染探針也可以通過(guò)以下方式制備：對(duì)利用激光捕獲顯微切割從中期染色體展片(metaphasespread)分離的經(jīng)分選染色體臂的dna進(jìn)行擴(kuò)增。以微點(diǎn)陣形式固定或者固定在編碼顆粒上的固定全染色體或染色體臂探針產(chǎn)生分別代表跨越所述全染色體或臂的平均獲得或者丟失情況的雜交比信號(hào)，其方式與跨越整個(gè)染色體或臂的頗為大量的bac匯集物相似。

復(fù)合探針在多重基因組獲得-丟失分析(例如本文所述的多重基因組獲得-丟失分析)中起到多種作用。它們包括染色體計(jì)數(shù)(非整倍性檢測(cè))、微缺失或其他綜合征的檢測(cè)或者作為對(duì)照。將復(fù)合探針用作對(duì)照來(lái)確定正常的常染色體應(yīng)答(當(dāng)前樣本/參照比值的水平＝1.0)可以對(duì)較大跨度的基因組上的應(yīng)答取平均，從而可以降低個(gè)體之間的正常拷貝數(shù)差異所引起的比值噪音。

制備復(fù)合探針的方法

本文提供了一種制備與基底相連的用于分析dna的復(fù)合核酸探針試劑的方法。分離基本上與含有參照基因組的基因組區(qū)域第一末端的完整第一基因組座位特異性雜交的第一核酸序列。另外，分離至少一種基本上與含有所述參照基因組dna的所述基因組區(qū)域第二末端的完整第二基因組座位特異性雜交的第二核酸序列。術(shù)語(yǔ)“分離”在用于核酸時(shí)是指核酸與同其天然一起存在的其他物質(zhì)(如細(xì)胞、蛋白和其他核酸)基本分離。混合所述第一和所述第二核酸序列，從而制備復(fù)合探針，并在隨后將所述復(fù)合探針連接到固體基底，從而制備與基底相連的復(fù)合核酸探針試劑，用于分析核酸如基因組dna。

在一個(gè)具體的可選方案中，所述第一核酸序列分離自第一種大插入載體，所述第二核酸序列分離自第二種大插入載體。例如，所述第一核酸序列為分離自第一種bac的dna插入物，所述第二核酸序列為分離自第二種bac的dna插入物。

在又一個(gè)可選方案中，所述第一核酸序列為分離自第一種bac的人類基因組dna插入物，所述第二核酸序列為分離自第二種bac的人類基因組dna插入物。

任選地，在混合之前或者之后擴(kuò)增所述核酸序列。例如，在混合之前或者之后擴(kuò)增所述第一和所述第二或者更多的核酸序列。

由復(fù)合探針中核酸序列靶向的基因組座位的數(shù)目并不局限于兩種，可以為三種、四種或更多種，如大約4-100種或更多種。因此，同樣地，與基因組座位特異性雜交的具體核酸序列的數(shù)目也不局限于兩種，可以為三種、四種或更多種，如大約4-100種或更多種。

復(fù)合探針的一個(gè)實(shí)例是使用來(lái)自五種bac的插入dna制備的復(fù)合探針，所述插入dna被定位到與digeorge微缺失綜合征相對(duì)應(yīng)的cytoband22p11.2。所用五種bac的中心座位跨越大約0.45mb(445kb)，對(duì)于175kb的典型bac長(zhǎng)度，所述總跨度略高于600kb。對(duì)從所述五種bac中每一種分離的插入dna進(jìn)行擴(kuò)增，并將所得到的擴(kuò)增子匯集起來(lái)制備復(fù)合探針。隨后將所述復(fù)合探針連接到一個(gè)系列的luminex編碼多重微球，所述微球全都具有相同的小球編碼身份，用于在多重基因組獲得-丟失分析中用作22p11.2cytoband探針。

因此，在一個(gè)具體的實(shí)例中，2種、3種、4種、5種或更多種，(如6-100種或更多種)來(lái)自bac或其他大插入載體的插入物，可以用作與確定基因組區(qū)域中具體基因組座位特異性雜交的核酸序列。

基底

用于連接探針(包括復(fù)合探針)的固體基底(包括半固體基底)，可以為多種材料中的任何一種，如玻璃；塑料，如聚丙烯、聚苯乙烯、尼龍；紙；硅；硝酸纖維素；或核酸可以與之連接以用于進(jìn)行分析的任何其他材料。所述基底可以為多種形式或者形狀中的任何一種，包括平面的(如硅片和玻璃板)和三維的(如顆粒、微量滴定板、微量滴定孔、針、纖維等)。

在具體的方面，與探針相連的固體基底為顆粒。

與探針相連的顆粒可以為任何探針可與之相連的固體或半固體顆粒，該顆粒適合核酸雜交分析，并且在雜交和檢測(cè)條件下是穩(wěn)定的且不溶的。所述顆?？梢詾槿魏涡螤?如圓柱形、球形等)、尺寸、組成或具有任何理化特征。可以對(duì)粒度或組成進(jìn)行選擇，從而使得顆?？梢栽诶缇哂刑囟讖降倪^(guò)濾器上或者通過(guò)一些其他的物理性質(zhì)(如磁性)與流體相分離。

所使用的微粒如微球的直徑可以小于一毫米，例如，直徑的尺寸范圍為約0.1至約1,000微米(包括端值)，如直徑為約3-25微米(包括端值)，或者直徑為約5-10微米(包括端值)。所使用的納米顆粒如納米小球的直徑可為約1納米(nm)至約100,000nm(包括端值)，例如，尺寸范圍為約10-1,000nm(包括端值)，或者例如，尺寸范圍為200-500nm(包括端值)。在某些實(shí)施方案中，所使用的顆粒為小球，特別是微球和納米小球。

舉例來(lái)說(shuō)，顆粒為有機(jī)或無(wú)機(jī)顆粒，如玻璃或金屬顆粒，并且可以為合成的或者天然的聚合物的顆粒，所述聚合物如聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚硅酮(silicon)、尼龍、纖維素、瓊脂糖、葡聚糖和聚丙烯酰胺。在具體的實(shí)施方案中，顆粒為乳膠小球。

在具體的實(shí)施方案中，所使用的顆粒含有用于連接核酸的官能團(tuán)。例如，顆?？梢院恤驶?、氨基、羧酸基團(tuán)、鹵素、酯、醇、脲、醛、氯甲基、氧化硫、一氧化氮、環(huán)氧基和/或甲苯磺?；倌軋F(tuán)。顆粒的官能團(tuán)、對(duì)其的修飾及其與化學(xué)部分(如核酸)的連接為本領(lǐng)域所熟知，例如如fitch,r.m.,polymercolloids:acomprehensiveintroduction,academicpress,1997中所述。美國(guó)專利no.6,048,695描述了一種用于將核酸探針如擴(kuò)增子連接到基底如顆粒上的示例性方法。在另一個(gè)具體的實(shí)例中，1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳化二亞胺鹽酸鹽(edc或edac化學(xué)品)可以用來(lái)將核酸連接到編碼顆粒。

編碼顆粒為基于某個(gè)特征可以與其他顆粒區(qū)分開(kāi)的顆粒，所述特征例如包括光學(xué)性質(zhì)如顏色、反射指數(shù)和/或壓印圖案或光學(xué)可檢測(cè)的圖案。例如，可以使用光學(xué)標(biāo)簽、化學(xué)標(biāo)簽、物理標(biāo)簽或者電學(xué)標(biāo)簽來(lái)編碼顆粒。編碼顆粒可以含有一個(gè)或者多個(gè)熒光團(tuán)或與之相連，所述熒光團(tuán)可以通過(guò)例如激發(fā)和/或發(fā)射波長(zhǎng)、發(fā)射強(qiáng)度、激發(fā)態(tài)壽命或這些的組合、或者其他光學(xué)特征進(jìn)行區(qū)分?？梢允褂霉鈱W(xué)條形碼來(lái)對(duì)顆粒進(jìn)行編碼。

在具體的實(shí)施方案中，一個(gè)顆粒系列的各顆粒均用相同的代碼進(jìn)行編碼，從而使得一個(gè)顆粒系列的各顆粒都可以與另一個(gè)顆粒系列的各顆粒區(qū)分開(kāi)。在其他實(shí)施方案中，可以對(duì)單個(gè)顆粒系列使用兩種或者多種代碼。例如，各顆粒都可以含有獨(dú)特的代碼。在某些實(shí)施方案中，顆粒編碼包含一個(gè)代碼，但不包含顆粒與對(duì)基因組dna特異的核酸探針之間的聯(lián)系，或者兼而有之。

在具體的實(shí)施方案中，代碼鑲嵌在例如顆粒內(nèi)部，或者以在雜交和分析期間穩(wěn)定存在的方式與顆粒相連?？赏ㄟ^(guò)任何可檢測(cè)的方式提供代碼，如通過(guò)全息編碼，通過(guò)熒光性質(zhì)、顏色、形狀、尺寸、光發(fā)射、量子點(diǎn)發(fā)射等，以鑒定顆粒，并由此鑒定固定于其上的捕獲探針。在一些實(shí)施方案中，代碼不是由核酸提供。

一個(gè)示例性平臺(tái)利用浸漬于聚合物顆粒內(nèi)的熒光染料的混合物，作為鑒定固定有特定俘獲探針的顆粒系列的每個(gè)成員的工具。另一個(gè)示例性平臺(tái)使用全息條碼來(lái)鑒定圓柱形玻璃顆粒。例如，chandler等人(美國(guó)專利no.5,981,180)描述了一種基于顆粒的系統(tǒng)，其中不同的顆粒類型由不同比例的兩種或更多種浸漬于聚合物顆粒內(nèi)的熒光染料的混合物編碼。soini(美國(guó)專利no.5,028,545)描述了一種基于顆粒的多重分析系統(tǒng)，該系統(tǒng)采用時(shí)間分辨熒光進(jìn)行顆粒鑒定。fulwyler(美國(guó)專利no.4,499,052)描述了一種使用通過(guò)顏色和/或尺寸區(qū)分的顆粒的示例性方法。美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)文本20040179267、20040132205、20040130786、20040130761、20040126875、20040125424和20040075907描述了由全息條碼編碼的示例性顆粒。美國(guó)專利no.6,916,661描述了與納米顆粒有關(guān)的聚合物微粒，所述納米顆粒具有為顆粒提供代碼的染料。

盡管本文詳細(xì)描述的一個(gè)實(shí)施方案利用的是luminex編碼小球平臺(tái)，但是也可以使用其他類型的編碼顆粒分析平臺(tái)，如veracode小球和beadxpress系統(tǒng)(illuminainc.，sandiegoca)、xmap3d(luminex)等?？梢允褂么判詌uminex小球，該小球使得可以使用板狀磁鐵和移液管而不使用過(guò)濾板和多頭抽真空裝置進(jìn)行洗滌步驟。這其中的每一個(gè)平臺(tái)通常都以羰基小球的形式提供，但是也可以對(duì)其進(jìn)行構(gòu)建，從而使其含有不同的偶聯(lián)化學(xué)組成，如氨基-硅烷。

與基底的連接

核酸探針與基底的連接可以通過(guò)將核酸有效地鍵合到固體或半固體基底的多種方法中的任何一種實(shí)現(xiàn)，舉例說(shuō)來(lái)，所述方法包括吸附和化學(xué)鍵合。核酸可以直接地鍵合至所述編碼顆粒的材料，或者間接地(例如通過(guò)鍵合至分布于顆粒之上的包衣或接頭)鍵合至所述編碼顆粒?？梢院铣珊怂幔⑶?或者在合成后對(duì)其進(jìn)行修飾，從而使其含有用于將所述核酸鍵合至顆粒的官能團(tuán)。例如，用作探針的核酸序列可以含有羰基、胺、氨基、羧酸基團(tuán)、鹵素、酯、醇、脲、醛、氯甲基、氧化硫、一氧化氮、環(huán)氧基和/或甲苯磺酰基官能團(tuán)。

與基底相連的探針(包括復(fù)合探針)可以為單鏈的和/或雙鏈的核酸。在具體實(shí)施方案中，在雙鏈核酸被連接時(shí)，在將其固定于基底之后使其變性成為單鏈以進(jìn)行制備，從而用于分析方法的某些實(shí)施方案中。任選地，在固定之前使雙鏈核酸探針變性，然后將單鏈的核酸連接至基底。

擴(kuò)增子試劑組合物

在具體實(shí)施方案中，提供了一種用于分析核酸的試劑，所述試劑包含連接有作為探針的擴(kuò)增子的多個(gè)編碼顆粒。

在其他具體實(shí)施方案中，所連接的擴(kuò)增子由多于一種模板擴(kuò)增得到，從而形成了復(fù)合探針。

在某些實(shí)施方案中，與多個(gè)編碼顆粒連接的擴(kuò)增子每一個(gè)都含有與模板基因組核酸的一部分相同或者完全互補(bǔ)的核酸序列，并且所述擴(kuò)增子合在一起基本上代表完整的模板基因組核酸。

圖1示出一種制備用于分析基因組dna的試劑的方法的一個(gè)實(shí)施方案。如圖1所示，提供了一個(gè)模板核酸(1)。使用簡(jiǎn)并寡核苷酸引物(dop)在第一擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增所述模板(2)，從而產(chǎn)生第一擴(kuò)增產(chǎn)物。

所述模板核酸可以是能夠使用核酸擴(kuò)增方法被復(fù)制的任何核酸。

用于所述第一擴(kuò)增反應(yīng)的模板dna任選地為基因組dna，其大小范圍通常為約20-300kb，但是該模板也可以更小或者更大。術(shù)語(yǔ)“基因組的”指細(xì)胞或者生物體的基因組的dna，其不僅包括由細(xì)胞或者生物體的基因組的dna復(fù)制得到的dna(如克隆得到的dna)，還包括從細(xì)胞或生物體直接分離得到的dna(如顯微切割的染色體dna)。模板dna可以包括細(xì)胞或者生物體的全部的或者部分的基因組。模板dna可以包括表現(xiàn)為一種或者多種染色體、染色體的一部分、基因座、基因或基因的一部分的dna。模板dna可以為任何形式，如載體中的插入物，所述載體例如包括細(xì)菌人工染色體、酵母人工染色體、人類人工染色體、黏粒、質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體dna或f黏粒。模板dna可以是顯微切割的染色體dna形式。因此，盡管本文描述的具體實(shí)例是以bac作為模板dna來(lái)源，但是也可以使用其他類型的克隆，如pac、yac、黏粒、f黏粒、cdna等。

根據(jù)具體的實(shí)施方案，可以一起或者分別地?cái)U(kuò)增來(lái)自于這些或者其他來(lái)源中任何一種的多個(gè)模板，合并得到的來(lái)自所述多個(gè)模板的擴(kuò)增子為復(fù)合探針。

模板基因組dna通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法獲得，例如描述于以下文獻(xiàn)中的方法：j.sambrookandd.w.russell,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress；3rded.,2001，或者f.m.ausubel,ed.,shortprotocolsinmolecularbiology,currentprotocols；5thed.,2002。模板dna還可以購(gòu)買獲得和/或使用分離基因組dna的商用試劑盒獲得。

使用體外擴(kuò)增方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)模板dna的擴(kuò)增。術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增方法”指這樣一種方法或技術(shù)，即所述方法或技術(shù)用于復(fù)制模板核酸，由此產(chǎn)生包括所述模板核酸的全部或者部分的多個(gè)拷貝的核酸，所產(chǎn)生的核酸也稱為擴(kuò)增子。

擴(kuò)增子任選地含有存在于引物中且不存在于原始dna模板中的核酸序列。所述引物來(lái)源的核酸增加了功能性，例如用于其他擴(kuò)增反應(yīng)的引物結(jié)合位點(diǎn)，和/或與基底進(jìn)行化學(xué)鍵合的官能團(tuán)。

舉例而言，擴(kuò)增方法包括pcr、連接反應(yīng)介導(dǎo)的pcr(lm-pcr)、phi-29pcr和其他核酸擴(kuò)增方法，例如如c.w.dieffenbachetal.,pcrprimer:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,2003；和v.demidovetal.,dnaamplification:currenttechnologiesandapplications,taylor&francis,2004中所述。

可以使用具體的dna模板來(lái)源和核酸擴(kuò)增方法的多種結(jié)合。

術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸引物”指能夠在合適的反應(yīng)條件下?lián)?dāng)引物延伸產(chǎn)物的合成起始位點(diǎn)的核酸。寡核苷酸引物的長(zhǎng)度通常為約10–30個(gè)連續(xù)的核苷酸。寡核苷酸引物與模板核酸的一個(gè)區(qū)域完全互補(bǔ)或者基本互補(bǔ)，因而在雜交條件下，所述寡核苷酸引物與模板核酸的所述互補(bǔ)區(qū)域退火。引物延伸產(chǎn)物合成的合適反應(yīng)條件包括存在合適的反應(yīng)組分(包括但不限于聚合酶和核苷三磷酸)。對(duì)于適合用于擴(kuò)增反應(yīng)中的寡核苷酸引物的設(shè)計(jì)為本領(lǐng)域所熟知，例如如a.yuryevetal.,pcrprimerdesign,humanapress，2007中所述。

術(shù)語(yǔ)“簡(jiǎn)并寡核苷酸引物”指含有具有隨機(jī)或者半隨機(jī)核苷酸序列的核酸的引物。對(duì)于適合用于具體核酸擴(kuò)增反應(yīng)的簡(jiǎn)并寡核苷酸引物的設(shè)計(jì)為本領(lǐng)域所熟知，例如如a.yuryevetal.,pcrprimerdesign,humanapress,2007中所述?？梢允褂镁哂写蠹s5-8個(gè)核苷酸的隨機(jī)或半隨機(jī)核苷酸序列。在其他實(shí)施方案中，隨機(jī)或半隨機(jī)核苷酸六聚體包含在用于第一擴(kuò)增反應(yīng)的簡(jiǎn)并寡核苷酸引物中。

在具體的實(shí)施方案中所使用的簡(jiǎn)并寡核苷酸引物每一個(gè)均包含一個(gè)5'恒定dna區(qū)段、一個(gè)中間隨機(jī)dna區(qū)段和一個(gè)3'錨定區(qū)段，例如如fiegleretal.,geneschromosomescancer,36(4):361-74，2003；和telenius，etal.,genomics13:718-25，1992中所述。5'恒定dna區(qū)段任選地具有在所有dop中均相同的核苷酸序列。3'錨定區(qū)段任選地具有經(jīng)測(cè)定在模板核酸中具有所需出現(xiàn)頻率的核苷酸序列。對(duì)具體的核酸序列出現(xiàn)頻率的分析為本領(lǐng)域所熟知，例如如milosavljic,a.andjurka,j.,1993,comput.applic.biosci.,9:407-411；pesole,g.etal.,1992，nucleicacids,res.,20:2871-2875；和hutchinson,g.b.,1996,comput.appl.biosci.,12:391-398中所述。

在具體的實(shí)施方案中，dop含有約17-25個(gè)連續(xù)的核苷酸，其中約7-12個(gè)連續(xù)的核苷酸包含于5'恒定dna區(qū)段之中，約5-8個(gè)連續(xù)的核苷酸包含于隨機(jī)dna區(qū)段之中，約5-8個(gè)連續(xù)的核苷酸包含于3'錨定區(qū)段之中。

第一擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生含有多個(gè)擴(kuò)增子的第一反應(yīng)產(chǎn)物。第一反應(yīng)產(chǎn)物中的各擴(kuò)增子均含有與dna模板的一個(gè)隨機(jī)部分相同或者完全互補(bǔ)的一段dna序列以及與第一種反應(yīng)引物的5'恒定dna序列相同的一段dna序列。

本文中使用的術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)的”是指核苷酸之間的沃森-克里克堿基配對(duì)，具體地指核苷酸通過(guò)氫鍵彼此鍵合，胸腺嘧啶或尿嘧啶殘基通過(guò)兩個(gè)氫鍵與腺嘌呤殘基相連，而胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤殘基通過(guò)三個(gè)氫鍵相連。通常，核酸所包含的核苷酸序列被描述為與指定的第二核苷酸序列具有某一“百分比的互補(bǔ)度”。例如，一段核苷酸序列可以與指定的第二核苷酸序列具有80％、90％或100％的互補(bǔ)度，這表明一段10個(gè)核苷酸的序列中有8個(gè)、9個(gè)或者10個(gè)核苷酸與指定的第二核苷酸序列互補(bǔ)。例如，核苷酸序列3'-tcga-5'與核苷酸序列5'-agct-3'100％互補(bǔ)。另外，核苷酸序列3'-tcga-與核苷酸序列5'-ttagctgg-3'的一個(gè)區(qū)域100％互補(bǔ)或完全互補(bǔ)。

參照?qǐng)D1，使用第一反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)增子作為模板dna進(jìn)行第二擴(kuò)增反應(yīng)(3)。第二擴(kuò)增反應(yīng)(3)包括“通用”寡核苷酸引物，之所以這樣稱謂是因?yàn)樵撏ㄓ靡锱c在第一擴(kuò)增反應(yīng)中使用的dop的5'恒定dna區(qū)段相同或者完全互補(bǔ)。通用寡核苷酸引物包含在第一擴(kuò)增反應(yīng)中使用的dop的5'恒定dna區(qū)段，所述5'恒定dna區(qū)段位于該通用引物的3'末端。通用寡核苷酸引物任選地在其5’末端含有其他連續(xù)的核苷酸。

在一個(gè)具體的可選方案中，在通用寡核苷酸引物的5’端含有一個(gè)官能團(tuán)，用于將由第二擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的擴(kuò)增子連接至編碼固體或半固體基底如編碼顆粒。例如，在通用寡核苷酸引物的5’端含有一個(gè)胺基基。在另一個(gè)可選方案中，可以對(duì)由第二擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的擴(kuò)增子進(jìn)行修飾，從而使其含有用于鍵合至固體或者半固體基底的官能團(tuán)。修飾核酸從而使其含有能夠鍵合至固體或者半固體基底的官能團(tuán)為本領(lǐng)域所熟知。

在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，與顆粒相連的每一個(gè)單獨(dú)的擴(kuò)增子均含有與模板dna序列的一個(gè)隨機(jī)部分相同的一個(gè)dna區(qū)段。每一個(gè)單獨(dú)的擴(kuò)增子均還含有一個(gè)恒定dna區(qū)段，所述恒定dna區(qū)段同與模板dna序列的一個(gè)隨機(jī)部分相同的dna區(qū)段毗鄰。擴(kuò)增子的恒定dna區(qū)段任選地含有一個(gè)末端官能團(tuán)，用于將擴(kuò)增子連接到編碼顆粒。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述擴(kuò)增子的恒定dna區(qū)段含有一個(gè)5'末端胺基團(tuán)，用于將擴(kuò)增子連接到編碼顆粒。

如圖1所示，將第二反應(yīng)產(chǎn)物的擴(kuò)增子固定于第一種多個(gè)編碼顆粒上(4)。第二擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增子與所述編碼顆粒的連接可通過(guò)多種可有效地鍵合核酸與固體或者半固定基底的方法之一實(shí)現(xiàn)，所述方法例如包括吸附和化學(xué)鍵合。擴(kuò)增子可以與編碼顆粒的材料直接鍵合，或者與編碼顆粒間接鍵合，例如，通過(guò)鍵合至分布于顆粒上的包衣或接頭?？梢院铣蓴U(kuò)增子，并且/或者在合成后對(duì)其進(jìn)行修飾，從而使其含有一個(gè)用于將擴(kuò)增子鍵合到顆粒上的官能團(tuán)。例如，擴(kuò)增子可以含有羰基、胺、氨基、羧酸基團(tuán)、鹵素、酯、醇、脲、醛、氯甲基、氧化硫、一氧化氮、環(huán)氧基和/或甲苯磺?；倌軋F(tuán)。

通常，作為第二擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物的擴(kuò)增子是雙鏈的，并且該雙鏈的擴(kuò)增子與顆粒相連。因此，所述雙鏈擴(kuò)增子的兩條鏈都呈現(xiàn)于每一個(gè)顆粒之上。在將擴(kuò)增子固定于顆粒之后使其變性成為單鏈，以進(jìn)行制備，從而用于分析方法的具體實(shí)施方案中。任選地，在固定之前使雙鏈擴(kuò)增子變性，然后將單鏈的擴(kuò)增子與顆粒相連。

如所述，第一和第二擴(kuò)增反應(yīng)兩者中的每一個(gè)擴(kuò)增子均含有與模板dna序列的一個(gè)隨機(jī)部分相同的一段核酸序列，從而使由第一擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的擴(kuò)增子合在一起基本上代表完整的模板dna序列，由第二擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的擴(kuò)增子合在一起基本上代表完整的模板dna序列。

用于分析基因組dna的第一顆粒系列和第一試劑為連接有擴(kuò)增子的編碼顆粒，所述擴(kuò)增子是第二擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物，其合在一起基本上代表在第一擴(kuò)增反應(yīng)中用作模板的完整基因組dna序列。

在具體的實(shí)施方案中，與顆粒相連的每一個(gè)單獨(dú)的擴(kuò)增子的長(zhǎng)度范圍為約500–1200個(gè)核苷酸(包括端值)。因此，通過(guò)所連接的由所述模板擴(kuò)增得到的相對(duì)較小的擴(kuò)增子，相對(duì)較大的模板核酸基本完整地呈現(xiàn)于一個(gè)系列的編碼顆粒之上。

如上文所述，各顆粒系列均含有連接有擴(kuò)增子的編碼顆粒，所述擴(kuò)增子是第二擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物，其合在一起基本上代表在第一擴(kuò)增反應(yīng)中用作模板的完整基因組dna序列。含有擴(kuò)增子的顆粒數(shù)目取決于諸多因素如模板尺寸、擴(kuò)增子尺寸以及可用于將擴(kuò)增子連接到顆粒之上的結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目，所述含有擴(kuò)增子的顆粒數(shù)目足以使得合在一起基本上代表在第一擴(kuò)增反應(yīng)中用作模板的完整基因組dna序列。通常，足以使得合在一起基本上代表在第一擴(kuò)增反應(yīng)中用作模板的完整基因組dna序列的顆粒數(shù)目的范圍為約1-10,000(包括端值)。

使用第二種基因組dna模板進(jìn)行擴(kuò)增并將作為第二擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物的擴(kuò)增子(如上所述)連接至第二種多個(gè)編碼顆粒，形成了另外的顆粒系列。所述第二種多個(gè)編碼顆粒可檢測(cè)地不同于所述第一種多個(gè)編碼顆粒，從而形成用于分析基因組dna的第二編碼顆粒系列和第二試劑。

類似地，將第三種或后續(xù)的基因組dna模板用于形成擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物，并將該反應(yīng)產(chǎn)物連接至第三種或后續(xù)的多個(gè)編碼顆粒。所述第三種或后續(xù)的多個(gè)編碼顆粒中的每一種均可檢測(cè)地不同于其他的每一種多個(gè)編碼顆粒，從而獲得用于分析基因組dna的第三或后續(xù)的編碼顆粒系列和第三或后續(xù)的試劑。

多重試劑

某些實(shí)施方案提供了一種用于分析基因組dna的多重試劑，所述多重試劑包含兩個(gè)或更多個(gè)顆粒系列的混合物。在具體的實(shí)施方案中，每一編碼顆粒系列的各個(gè)編碼顆粒均可檢測(cè)地區(qū)別于其他每一編碼顆粒系列的各個(gè)編碼顆粒。

在具體的實(shí)施方案中，至少一個(gè)顆粒系列包含復(fù)合探針。任選地，多于一個(gè)顆粒系列包含復(fù)合探針。

在具體的實(shí)施方案中，每一編碼顆粒系列均連接有擴(kuò)增子，所述擴(kuò)增子為如本文所述的第二擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物，并且合在一起基本上代表在第一擴(kuò)增反應(yīng)中用作模板的完整基因組dna序列，其中不同的基因組模板由與其他各編碼顆粒系列相連的擴(kuò)增子所代表。

一個(gè)具體實(shí)施方案的一種多重試劑包括連接有擴(kuò)增子的第一編碼顆粒系列和連接有擴(kuò)增子的第二編碼顆粒系列，所述與第一編碼顆粒系列相連的擴(kuò)增子合在一起基本上代表插入第一細(xì)菌人工染色體中的完整模板dna序列，而所述與第二編碼顆粒系列相連的擴(kuò)增子合在一起基本上代表插入第二細(xì)菌人工染色體中的完整模板dna序列。

例如，與第一編碼顆粒系列相連的擴(kuò)增子含有與人13號(hào)染色體dna的一部分相同的核酸序列，而與第二編碼顆粒系列相連的擴(kuò)增子含有與人18號(hào)染色體dna的一部分相同的核酸序列。與第三或后續(xù)的編碼顆粒系列相連的擴(kuò)增子含有與人的另一染色體或染色體的另一非重疊區(qū)域的dna相同的核酸序列。

本文所描述的多重試劑可以在單個(gè)分析中同時(shí)分析多個(gè)靶標(biāo)，如多個(gè)基因組座位(genomicloci)。

通過(guò)至少混合第一編碼顆粒系列和第二編碼顆粒系列形成了用于分析基因組dna的多重試劑。

圖2示出了一種形成多重試劑的方法的一個(gè)實(shí)施方案。如圖所示，任何數(shù)目“m”的編碼顆粒系列均可以包含在所述多重試劑中。因此，例如，“m”可以為至少2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或200個(gè)不同的編碼顆粒系列。一個(gè)系列的連接有擴(kuò)增子的編碼顆粒與一個(gè)或者多個(gè)其他系列的連接有擴(kuò)增子的編碼顆粒聯(lián)合形成用于分析樣本中基因組獲得和丟失的多重試劑。

在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，包含結(jié)合的復(fù)合探針的一個(gè)編碼顆粒系列與具有結(jié)合的復(fù)合探針或非復(fù)合探針的一個(gè)或多個(gè)其他編碼顆粒系列相聯(lián)合，形成用于分析樣本中基因組獲得和丟失的多重試劑。

分析方法

具體實(shí)施方案提供了一種分析dna樣本的方法，所述方法包括提供一種與基底相連的復(fù)合核酸探針。所述復(fù)合核酸探針含有與參照基因組的基因組區(qū)域中兩個(gè)或者更多個(gè)基因組座位特異性雜交的核酸序列。所述基因組區(qū)域的特征在于具有第一末端和第二末端以及介于所述末端之間的至少400kb的中間區(qū)域。所述復(fù)合核酸探針包含基本上與含有所述基因組區(qū)域第一末端的完整第一基因組座位特異性雜交的核酸序列，以及基本上與含有第二末端的完整第二基因組座位特異性雜交的核酸序列。所述第一基因組座位和第二基因組座位各自通常含有至少大約100kb。任選地，復(fù)合探針的核酸序列與所述基因組區(qū)域中的其他座位特異性雜交。在又一個(gè)可選方案中，參照基因組為一個(gè)或者多個(gè)人類基因組。

與所述基底相連的復(fù)合核酸探針在足以實(shí)現(xiàn)特異性雜交的嚴(yán)格度下與樣本基因組dna雜交。所述與基底相連的復(fù)合核酸探針還在相同或者相似的條件下與參照基因組dna雜交，從而可以進(jìn)行比較。

檢測(cè)指示所述與基底相連的復(fù)合核酸探針與所述樣本基因組dna特異性雜交的第一信號(hào)，以及指示所述與基底相連的復(fù)合核酸探針與所述參照基因組dna特異性雜交的第二信號(hào)。比較所述第一信號(hào)和第二信號(hào)，從而檢測(cè)所述第一和第二信號(hào)之間的差異，該差異指示所述樣本dna和所述參照dna之間的差異。

分析樣本核酸的方法的具體實(shí)施方案包括提供含有兩個(gè)或者更多個(gè)編碼顆粒系列的混合物的多重試劑，所述編碼顆粒系列被編碼，從而使每一編碼顆粒系列的各顆?？蓹z測(cè)地區(qū)別于其他每一編碼顆粒系列的各顆粒。所述編碼顆粒包含所連接的與參照基因組的至少一個(gè)基因組座位特異性雜交的核酸序列，并且至少一個(gè)編碼顆粒系列含有連接的復(fù)合核酸探針。

所述多重試劑同時(shí)地或者平行地與樣本基因組核酸和參照核酸雜交。

檢測(cè)指示所連接的核酸序列與可檢測(cè)地標(biāo)記的樣本核酸特異性雜交的第一信號(hào)，并檢測(cè)指示所連接的核酸序列與可檢測(cè)地標(biāo)記的參照核酸特異性雜交的第二信號(hào)。然后鑒定所述編碼顆粒，從而將顆粒編碼情況與所述第一信號(hào)或者與所述第二信號(hào)聯(lián)系起來(lái)。隨后比較各個(gè)編碼顆粒系列的第一信號(hào)和第二信號(hào)，所述第一和第二信號(hào)的差異指示所述樣本和參照核酸之間的差異。

在具體的實(shí)施方案中，分析基因組dna的方法包括提供連接有擴(kuò)增子的編碼顆粒，所述擴(kuò)增子合在一起基本上代表完整的模板基因組核酸。在具體的實(shí)施方案中，提供了連接有擴(kuò)增子的編碼顆粒，所述擴(kuò)增子合在一起基本上代表不止一個(gè)拷貝的完整的模板基因組核酸。

在具體的實(shí)施方案中，準(zhǔn)備用于分析基因組獲得和/或丟失的基因組dna樣本用可檢測(cè)標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。參照dna也用可檢測(cè)標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記，用于與樣本dna進(jìn)行比較。樣本和參照dna可以用相同的或者不同的可檢測(cè)標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記，這取決于所使用的分析安排。例如，在具體的實(shí)施方案中，用不同的可檢測(cè)標(biāo)記所標(biāo)記的樣本和參照dna可以在同一容器中一起使用，用于同與編碼顆粒相連的擴(kuò)增子雜交。在其他實(shí)施方案中，用相同的可檢測(cè)標(biāo)記所標(biāo)記的樣本和參照dna可以在分開(kāi)的容器中使用，用于同與顆粒相連的擴(kuò)增子雜交。

術(shù)語(yǔ)“可檢測(cè)標(biāo)記”指可提供可檢測(cè)信號(hào)并且可以與核酸連接的任何原子或部分(moiety)。所述可檢測(cè)標(biāo)記的實(shí)例包括熒光部分、化學(xué)發(fā)光部分、生物發(fā)光部分、配體、磁性顆粒、酶、酶底物、放射性同位素和生色團(tuán)。

多種標(biāo)記樣本和參照核酸如dna的方法中的任何一種方法均可以用于本分析中，如核酸的缺口平移或化學(xué)標(biāo)記。例如，通過(guò)使用如下的核苷酸進(jìn)行聚合反應(yīng)可以引入可檢測(cè)標(biāo)記，所述核苷酸包括至少一些經(jīng)修飾的核苷酸，如經(jīng)修飾后含有生物素、地高辛、熒光素或花菁的核苷酸。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)隨機(jī)引物法和聚合反應(yīng)引入可檢測(cè)標(biāo)記。其他實(shí)例包括缺口平移(rocheappliedscience,indianapolisind.；invitrogen,carlsbadcalif.)和化學(xué)標(biāo)記(kreatechuls,amsterdamnl)。對(duì)核酸的可檢測(cè)標(biāo)記為本領(lǐng)域所熟知，并且可以使用適合標(biāo)記核酸(例如基因組dna)的任何標(biāo)記方法。

在又另一個(gè)實(shí)施方案中，避免用可檢測(cè)標(biāo)記對(duì)樣本和參照核酸例如dna單獨(dú)地進(jìn)行共價(jià)標(biāo)記。例如，未標(biāo)記的基因組dna樣本與固定至編碼顆粒的擴(kuò)增子雜交。事先標(biāo)記的報(bào)告序列也在與所述擴(kuò)增子的俘獲探針序列相鄰但不重疊的序列處與該擴(kuò)增子-樣本dna復(fù)合物和擴(kuò)增子-參照dna復(fù)合物雜交。所述經(jīng)標(biāo)記的報(bào)告序列可以在同一或者不同的雜交反應(yīng)中被雜交。通過(guò)這種方式，所述經(jīng)標(biāo)記的報(bào)告序列可以在更大規(guī)模的環(huán)境中被大量生產(chǎn)，與在分析時(shí)單獨(dú)地標(biāo)記每一個(gè)樣本相比，降低了每個(gè)分析的成本。

“樣本”和“參照”核酸例如基因組dna可以獲自任何適合的來(lái)源。本文描述的具體方法包括使用受試個(gè)體的樣本基因組dna。基因組樣本和/或參照dna可以從幾乎任何的組織中提取，所述組織包括但不限于血液、羊水、實(shí)體瘤、活檢器官、頰部拭子、絨毛膜絨毛、胚泡和卵裂球、妊娠物、唾液、尿液等。從經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋(ffpe)的病理學(xué)樣本提取的留存樣本同樣也是利用此方法分析的樣本基因組dna的來(lái)源。樣本和/或參照基因組dna還可以獲自體外來(lái)源如細(xì)胞系。從這些來(lái)源或其他來(lái)源獲得基因組dna的方法為本領(lǐng)域所熟知。

在具體的實(shí)施方案中，就待分析的樣本dna的具體特征來(lái)對(duì)參照dna進(jìn)行表征。例如，如果打算對(duì)樣本dna進(jìn)行分析以檢測(cè)具體基因或染色體座位的復(fù)制情況，則對(duì)參照dna進(jìn)行表征，從而獲知有多少個(gè)拷貝的該基因或者座位包含在參照dna中。通常，使用來(lái)自相同物種的樣本和參照dna。

參照dna可以是來(lái)源于性別相同的多個(gè)正常受試者，特別是人類受試者的基因組dna的匯集混合物。匯集自多個(gè)正常受試者的dna可以商購(gòu)獲得。

在一些實(shí)施方案中，使用了不止一種參照dna，并在使用其他參照dna的方法中獲得其他的信息。

因此，例如，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，將兩種參照基因組dna樣本與測(cè)試基因組dna樣本進(jìn)行比較。將獲自男性受試者的第一種參照基因組dna和獲自女性受試者的第二種參照基因組dna與獲自性別有待確定的受試者如產(chǎn)前胎兒的測(cè)試基因組dna樣本進(jìn)行比較。

本發(fā)明分析包括將至少兩種參照基因組dna樣本與測(cè)試基因組dna樣本相比較，所述分析的一個(gè)具體特征是減少了分析結(jié)果的模糊度，并增加了其可信度。例如，如圖14所示，在使用男性特異參照和女性特異參照進(jìn)行分析時(shí)，僅用男性特異參照獲得的模糊結(jié)果被弄清楚。

可以使用本文所述的分析來(lái)檢測(cè)或者表征與染色體獲得或丟失相關(guān)的障礙。先天的或者天生的障礙包括全部染色體的三體性、較小基因組座位(大約200kb至20mb)的擴(kuò)增或缺失以及亞端粒區(qū)域或著絲粒區(qū)域的擴(kuò)增或缺失。許多癌癥的特征也在于可能與類型、階段、藥物抗性或治療響應(yīng)有聯(lián)系的染色體獲得和丟失。可以使用本方法就染色體穩(wěn)定性對(duì)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞系(包括干細(xì)胞系)進(jìn)行表征。

因此，可以使用兩種或者更多種參照基因組dna樣本，所述樣本代表影響到基因組dna的進(jìn)行性疾病、病癥或障礙的不同階段，并且將所述兩種或者更多種參照與一個(gè)基因組dna測(cè)試樣本進(jìn)行比較，所述測(cè)試樣本來(lái)自欲相對(duì)于所述參照來(lái)確定其病癥的受試個(gè)體。例如，將各種癌癥、其他障礙和/或年齡與基因組dna的進(jìn)行性缺失聯(lián)系起來(lái)，例如線粒體dna缺失與端粒變短。

盡管本文所描述的方法和組合物主要涉及來(lái)源于人的核酸，但是可以理解的是，也可以將本文所述的方法和組合物用于分析來(lái)源自許多生物體中的任一種的分析樣本基因組dna，所述生物體包括但不限于非人類的靈長(zhǎng)類、嚙齒動(dòng)物、兔、狗、貓、馬、牛、豬、山羊和綿羊。還可以分析非哺乳動(dòng)物來(lái)源的樣本dna，舉例來(lái)說(shuō)，包括魚(yú)和其他水生生物、鳥(niǎo)類、禽類、細(xì)菌、病毒、植物、昆蟲(chóng)、爬行類、兩棲類、真菌和分支桿菌。同樣地，參照dna也可以為人類dna或者來(lái)自于各種生物體中的任何一種的dna，所述生物體包括但不限于非人類的靈長(zhǎng)類、嚙齒類、兔、狗、貓、馬、牛、豬、山羊、綿羊以及非哺乳動(dòng)物來(lái)源，舉例而言，所述非哺乳動(dòng)物來(lái)源包括魚(yú)和其他水生生物、鳥(niǎo)類、禽類、細(xì)菌、病毒、植物、昆蟲(chóng)、爬行類、兩棲類、真菌和分歧桿菌。

所述與基底相連的核酸探針與受試個(gè)體的可檢測(cè)地標(biāo)記的樣本基因組dna雜交，從而實(shí)現(xiàn)所述與基底相連的核酸探針與所述樣本和/或參照核酸的特異性雜交。

在本文描述的分析的具體實(shí)施方案中，與編碼顆粒相連的擴(kuò)增子與受試個(gè)體的可檢測(cè)地標(biāo)記的樣本基因組dna雜交，從而實(shí)現(xiàn)所述擴(kuò)增子dna與所述可檢測(cè)地標(biāo)記的樣本基因組dna的特異性雜交。此外，與編碼顆粒相連的dna序列與可檢測(cè)地標(biāo)記的參照基因組dna雜交，由此實(shí)現(xiàn)所述擴(kuò)增子dna和所述可檢測(cè)地標(biāo)記的參照基因組dna的特異性雜交。

術(shù)語(yǔ)“雜交”是指互補(bǔ)核酸的配對(duì)和結(jié)合。出現(xiàn)在兩個(gè)核酸之間的雜交程度因諸如核酸的互補(bǔ)程度、核酸的解鏈溫度tm和雜交條件的嚴(yán)格度等因素而異，正如本領(lǐng)域所熟知的那樣。術(shù)語(yǔ)“雜交條件的嚴(yán)格度”指與具體的常用添加劑如甲酰胺和denhart’s溶液相關(guān)的雜交介質(zhì)的溫度、離子濃度和組成條件。與特定的核酸相關(guān)的具體雜交條件的確定是常規(guī)的，并且為本領(lǐng)域所熟知，例如如j.sambrookandd.w.russell,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress；3rded.,2001；和f.m.ausubel,ed.,shortprotocolsinmolecularbiology,currentprotocols；5thed.,2002中所述。高嚴(yán)格度的雜交條件為僅允許基本互補(bǔ)的核酸進(jìn)行雜交的那些雜交條件。通常，互補(bǔ)度為約85-100％的核酸被認(rèn)為是高度互補(bǔ)的，會(huì)在高嚴(yán)格度條件下雜交。中嚴(yán)格度條件的實(shí)例有互補(bǔ)度居中(互補(bǔ)度為約50-84％)的核酸以及互補(bǔ)度高的核酸進(jìn)行雜交的條件。相反，低嚴(yán)格度的雜交條件為互補(bǔ)度低的核酸進(jìn)行雜交的那些雜交條件。術(shù)語(yǔ)“特異性雜交”和“特異性地雜交”是指一具體的核酸與樣本中的目標(biāo)核酸進(jìn)行雜交，但基本不與目標(biāo)核酸之外的核酸雜交。

所述分析可以在任何合適的容器中進(jìn)行。在具體的實(shí)施方案中，例如，在準(zhǔn)備分析多個(gè)樣本時(shí)，可以使用多室容器。舉例說(shuō)來(lái)，多室容器包括多坑基底，如載玻片、硅片或硅盤(silicontray)。在一些實(shí)施方案中，將每個(gè)樣本放于多孔板不同的孔之中。例如，多孔板可以是96-孔、384-孔、1024-孔或者1536-孔分析板。

還包括對(duì)第一信號(hào)的檢測(cè)和對(duì)第二信號(hào)的檢測(cè)，所述第一信號(hào)指示所連接dna序列與受試個(gè)體的可檢測(cè)地標(biāo)記的基因組dna的特異性雜交，所述第二信號(hào)指示所連接dna序列與可檢測(cè)地標(biāo)記的參照基因組dna的特異性雜交。

使用任何合適的方法來(lái)在本文所述的分析中檢測(cè)信號(hào)，舉例說(shuō)來(lái)，所述方法包括光譜法、光學(xué)法、光化學(xué)法、生物化學(xué)法、酶學(xué)法、電學(xué)法和/或免疫化學(xué)法。

通過(guò)評(píng)估一個(gè)或者多個(gè)可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)，可以檢測(cè)每一顆粒指示雜交程度的信號(hào)。通常對(duì)各顆粒逐一進(jìn)行評(píng)估。例如，可以使顆粒通過(guò)流式細(xì)胞儀。示例性流式細(xì)胞儀包括beckmancoulter公司(fullertoncalif.)的coulterelite-esp流式細(xì)胞儀或facscan.tm.流式細(xì)胞儀，以及cytomation,inc.,fortcollins,colo的moflo.tm.流式細(xì)胞儀。除了流式細(xì)胞術(shù)之外，還可以將離心機(jī)用作顆粒分離和歸類的工具。一個(gè)合適的系統(tǒng)為描述于美國(guó)專利no.5,926,387中的系統(tǒng)。除了流式細(xì)胞術(shù)和離心之外，還可以將自由流動(dòng)電泳裝置用作顆粒分離和歸類的工具。一個(gè)合適的系統(tǒng)為描述于美國(guó)專利no.4,310,408中的系統(tǒng)。還可以將顆粒置于表面上，并進(jìn)行掃描或成像。

在某些實(shí)施方案中，檢測(cè)指示所述與基底相連的核酸序列與可檢測(cè)地標(biāo)記的樣本核酸(如受試個(gè)體的基因組dna)特異性雜交的第一信號(hào)。還檢測(cè)指示所述與基底相連的核酸探針與可檢測(cè)地標(biāo)記的參照基因組dna特異性雜交的第二信號(hào)。

在其他實(shí)施方案中，檢測(cè)指示所述與編碼顆粒相連的dna序列與受試個(gè)體的可檢測(cè)地標(biāo)記的基因組dna特異性雜交的第一信號(hào)。同時(shí)，檢測(cè)指示所述與編碼顆粒相連的dna序列與可檢測(cè)地標(biāo)記的參照基因組dna特異性雜交的第二信號(hào)。

比較所述第一信號(hào)和所述第二信號(hào)，從而獲得有關(guān)所述樣本和參照核酸的信息。在某些實(shí)施方案中，比較所述第一信號(hào)和所述第二信號(hào)，從而獲得有關(guān)受試個(gè)體的基因組dna與參照基因組dna相比較的信息。

在具體的實(shí)施方案中，將與一個(gè)或者多個(gè)顆粒系列的擴(kuò)增子雜交的參照dna和樣本dna的可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)比用來(lái)評(píng)估該樣本和參照dna之間的差異，所述差異指示例如基因組獲得和/或丟失。

在某些實(shí)施方案中，參照dna和樣本dna與一個(gè)或者多個(gè)顆粒系列的探針例如擴(kuò)增子在同一個(gè)容器(如多孔板的一個(gè)孔)中雜交。雜交之后，兩個(gè)標(biāo)記在一起分析，即在雜交物中同時(shí)檢測(cè)到兩個(gè)可檢測(cè)標(biāo)記，或者，將雜交物分成兩個(gè)(或者更多個(gè))部分，分別地對(duì)每一個(gè)部分進(jìn)行評(píng)估，從而對(duì)可檢測(cè)標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)?？梢詫⒃u(píng)估結(jié)果用來(lái)提供所述兩個(gè)可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)比。這種方法使得可以使用競(jìng)爭(zhēng)性雜交來(lái)對(duì)各分析之間的任何變異進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化：在加入有相同顆粒的同一容器中同時(shí)分析參照和實(shí)驗(yàn)樣本。

任選地，可檢測(cè)地標(biāo)記的參照dna和可檢測(cè)地標(biāo)記的樣本dna與一個(gè)或多個(gè)顆粒系列在不同的容器(例如，多孔板的不同孔)中雜交。在另一個(gè)實(shí)例中，可檢測(cè)地標(biāo)記的參照dna和可檢測(cè)地標(biāo)記的樣本dna與連接在平面陣列不同位置處的一個(gè)或者多個(gè)探針雜交?？梢垣@得這兩個(gè)可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)比，以評(píng)估所述樣本dna和參照dna之間的差異。在使用這種方法時(shí)，幾個(gè)或者多個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本可以共用一個(gè)參照樣本。對(duì)于每天涉及多個(gè)樣本的實(shí)驗(yàn)，通過(guò)避免對(duì)多個(gè)雙份正常樣本進(jìn)行標(biāo)記，可以節(jié)約試劑和人工成本。同時(shí)，也沒(méi)有必要對(duì)樣本進(jìn)行處理，從而獲得不同的部分以便分別進(jìn)行分析。每個(gè)樣本都可以僅評(píng)價(jià)一次。

在具體的實(shí)施方案中，通過(guò)其編碼信息來(lái)對(duì)編碼顆粒進(jìn)行鑒定，從而將顆粒編碼情況與第一信號(hào)和第二信號(hào)聯(lián)系起來(lái)。因此，例如，將第一和第二信號(hào)與含有人13號(hào)染色體dna的第一編碼顆粒系列的編碼顆粒關(guān)聯(lián)。對(duì)所述與第一編碼顆粒系列關(guān)聯(lián)的第一信號(hào)和第二信號(hào)進(jìn)行比較，從而獲得受試個(gè)體13號(hào)染色體dna與13號(hào)染色體參照dna相比較的信息。類似地，將第一和第二信號(hào)與含有人18號(hào)染色體dna的第二編碼顆粒系列關(guān)聯(lián)。對(duì)所述與第二編碼顆粒系列關(guān)聯(lián)的第一信號(hào)和第二信號(hào)進(jìn)行比較，從而獲得受試個(gè)體18號(hào)染色體dna與18號(hào)染色體參照dna相比較的信息。

本文的附圖和描述對(duì)最佳方式進(jìn)行了闡釋，但是可以用許多備選材料和方法進(jìn)行替代。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到合適的備選材料和方法，并且無(wú)需進(jìn)行過(guò)多試驗(yàn)即可制備和使用所述的組合物和方法。

多種緩沖液和其他分析組分的組成均可被替代。

用于培養(yǎng)、純化、擴(kuò)增、變性、偶聯(lián)、雜交、報(bào)告物連接、洗滌和小球處理的條件全都可以由使用者來(lái)改變，從而適合具體類型的細(xì)胞、模板基因組dna、樣本、所選報(bào)告物等。

使用少到30ng的樣本dna也可以很好地進(jìn)行本文實(shí)施例部分的分析。在生物學(xué)來(lái)源產(chǎn)生的用于所述分析的dna不足的情況下，可以通過(guò)許多全基因組擴(kuò)增(wga)方法(如doppcr或phi-29pcr)對(duì)樣本進(jìn)行擴(kuò)增。使用wga處理的樣本時(shí)，可以以同樣的方法對(duì)參照dna進(jìn)行處理，從而使任何序列特異性擴(kuò)增的偏差均可以基本由樣本/參照的信號(hào)比來(lái)校正。

提供了用于分析dna的試劑盒。在具體的實(shí)施方案中，提供了一種試劑盒，其含有編碼顆粒系列和/或兩個(gè)或更多個(gè)編碼顆粒系列的混合物。任選地，試劑盒含有使用編碼顆粒系列和/或含有兩個(gè)或者更多個(gè)編碼顆粒系列的多重試劑的說(shuō)明材料。任選地，還含有輔助試劑，如緩沖液、酶、洗滌溶液、雜交溶液、可檢測(cè)標(biāo)記、檢測(cè)試劑等。

下文的實(shí)施例對(duì)用于分析的組合物和方法的實(shí)施方案進(jìn)行了闡釋。提供這些實(shí)施例的目的是進(jìn)行說(shuō)明，不能將其看作是對(duì)組合物和方法的范圍進(jìn)行限制。

實(shí)施例

實(shí)施例1

用于基因組dna分析的小球系列試劑的制備

圖1a示出了由單個(gè)bac克隆制備bac擴(kuò)增子并將該擴(kuò)增子作為探針固定到一個(gè)系列的編碼小球上的流程圖。在此實(shí)施例中，該系列中的小球全都具有相同的id代碼。

原料為活的bac克隆材料(10)，即一段插入到大腸桿菌細(xì)菌細(xì)胞基因組內(nèi)的長(zhǎng)(通常為100-200kb)的人dna序列。取出一小片冷凍的bac甘油儲(chǔ)液材料，并將其用作標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)方法的原料(11)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的bac培養(yǎng)方案，在37℃下于裝有35ml培養(yǎng)基的50ml管中過(guò)夜培養(yǎng)細(xì)胞，并用抗生素進(jìn)行選擇。然后在4℃將培養(yǎng)得到的細(xì)胞離心20分鐘，使其離心到管底，取出并棄去上清液。將細(xì)胞沉淀重懸于含有rnase的緩沖液中，然后使用lyseblue(qiagen，valenciaca)和sds裂解。以大約20,000g將裂解液(12)離心(13)30分鐘，并收集上清(溶液中含有dna)，棄去沉淀。將上清液重復(fù)離心15分鐘。收集含有溶解的bacdna的澄清上清液，同時(shí)棄去離心到管底的細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)。使用qiagen基因組-tip20/g柱純化試劑盒，從上清液中提取和提純bacdna(17)。此試劑盒含有純化柱(15)，以及洗滌和洗脫緩沖液(16)。洗脫之后，通過(guò)異丙醇(19)沉淀法將現(xiàn)已高度純化的bacdna進(jìn)行沉淀并成為沉淀團(tuán)塊。產(chǎn)量通常是20至200ng的純化bacdna(18)?？梢詫⒋薭acdna以干燥沉淀物形式儲(chǔ)存，或者重懸于水中，直接用于隨后的步驟中。

然后，使用兩輪聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)擴(kuò)增，制備基本上代表各bacdna的完整序列物的大量pcr擴(kuò)增子。第一輪pcr(20)是非特異性簡(jiǎn)并寡核苷酸引物(dop)的pcr，其使用dop引物混合物(21)、doppcr聚合酶(22)和doppcr緩沖液(23)，并將上面制備的bacdna(18)用作模板。第二輪pcr擴(kuò)增(25)，利用針對(duì)dop引物的已知序列基序的單個(gè)引物。使用兩輪pcr來(lái)產(chǎn)生產(chǎn)量為大約20μg的擴(kuò)增子終產(chǎn)物(29)，用于隨后將擴(kuò)增子(29)偶聯(lián)(32)至編碼小球(30)。

如下制備擴(kuò)增子。

制備50μl各bacdna的第一doppcr混合物，其含有：

doppcr緩沖液(23)含有20mmtrishcl(ph8.4)、50mmkcl和5mmmgcl。dntp(amershambiosciences,piscatawaynj)的濃度為200μm。platinumtaq聚合酶(appliedbiosystems)的濃度為5單位/μl。dop引物混合物(21)，參見(jiàn)fiegleretal.2003,geneschromosomescancer,36(4):361-74，包括三個(gè)系列具有以下22-mer序列的簡(jiǎn)并寡核苷酸(operonbiotechnologies,huntsvilleal)，其中n代表隨機(jī)的核苷酸:

5'ccgactcgagnnnnnnctagaa3'seqidno.1

5'ccgactcgagnnnnnntaggag3'seqidno.2

5'ccgactcgagnnnnnnttctag3'seqidno.3

其中n表示隨機(jī)的核苷酸。

使用qiagen基因組-tip20/g柱純化試劑盒，將溶于水的bacdna模板(18)通過(guò)柱純化法(17)純化。platinumtaq聚合酶(22)(invitrogen,carlsbadca)的濃度為5單位/μl。

根據(jù)以下溫度/時(shí)間條件，在geneamp9700熱循環(huán)儀(appliedbiosystems,fostercityca)中進(jìn)行第一輪擴(kuò)增(20)：

3.0分鐘94℃

1.5分鐘94℃

2.5分鐘30℃，9個(gè)循環(huán)

0.10c/秒72℃(斜率)

3.0分鐘72℃

1.0分鐘94℃

1.5分鐘62℃，30個(gè)循環(huán)

2.0分鐘72℃

8.0分鐘72℃

4.0℃(穩(wěn)定狀態(tài))

然后，將第一輪doppcr(20)的擴(kuò)增子產(chǎn)物(24)用作第二輪pcr(25)的模板。第二輪中的單一引物(26)具有針對(duì)第一輪(20)中使用的dop引物的共有序列部分的特異性。此引物(26)經(jīng)胺修飾，從而使所得擴(kuò)增子(29)還在一個(gè)末端具有胺基團(tuán)，以有助于在下一步中簡(jiǎn)單地偶聯(lián)至編碼小球(32)。

如下進(jìn)行第二輪pcr。

制備100μl各bac擴(kuò)增子模板的第二pcr混合物，其含有:

pcr2緩沖液(28)含有20mmtrishcl(ph8.4)、50mmkcl和5mmmgcl。dntp(amershambiosciences，piscatawaynj)的濃度為200μm。platinumtaq聚合酶(appliedbiosystems)的濃度為5單位/μl。

與胺相連的引物(operon)具有以下序列。

5'-ggaaacagcccgactcgag-3'seqidno.4

反應(yīng)(25)中的模板為來(lái)自上一輪doppcr(20)的dop擴(kuò)增子。根據(jù)以下溫度/時(shí)間條件，在geneamp9700熱循環(huán)儀(appliedbiosystems)上進(jìn)行第二輪擴(kuò)增(25):

10分鐘95℃

1.0分鐘95℃

1.5分鐘60℃，35個(gè)循環(huán)

7.0分鐘72℃

10分鐘72℃

4.0℃(穩(wěn)定狀態(tài))

然后，使用基于磁性小球的試劑盒(9)(pcrcleanbeads,agencourtbiosciencecorp.,beverleyma)，根據(jù)制造商的方案，純化此第二pcr產(chǎn)物(29)。隨后將經(jīng)純化的擴(kuò)增子(29)，重懸于40μl水中，并于-20℃下儲(chǔ)存，直至用于下文所述的小球偶聯(lián)步驟中。

以50μl的標(biāo)準(zhǔn)小球濃度的規(guī)模，在luminex羧基小球(30)(luminex，austintx)，上進(jìn)行編碼小球偶聯(lián)過(guò)程(32)，以將所述擴(kuò)增子產(chǎn)物(29)作為探針dna固定到編碼小球的表面之上，得到大約650,000個(gè)小球。所述小球由聚苯乙烯制備，直徑大約為5.6μm，并由受控量的兩種或者多種熒光染料編碼，從而有助于在專用流式細(xì)胞儀讀取裝置上檢測(cè)其小球id。將50μl的懸浮小球(30)(全都具有一個(gè)小球id或區(qū)域)，從送遞它們的luminex管中轉(zhuǎn)移到一個(gè)1.5mleppendorf管進(jìn)行偶聯(lián)(32)，并通過(guò)渦旋和超聲處理來(lái)確保懸浮。然后，以12,000rpm將小球離心3分鐘，并在不干擾小球沉淀物的情況下除去小球緩沖上清液。將25μlmes緩沖液加入各小球管，然后進(jìn)行渦旋和超聲處理。另外地，將10μg各bac的pcr2擴(kuò)增子(29)加入第二系列的1.5ml離心管中，隨后將各管中的dna在speedvac(thermofisherscientific，walthamma)中徹底干燥。然后，將一份小球懸液轉(zhuǎn)移到各dna管中，并將各管渦旋和超聲處理5秒鐘進(jìn)行混合，仔細(xì)地跟蹤與各bac有聯(lián)系的小球id(區(qū)域)。

接下來(lái)，將1.5μl剛?cè)芙獾膃dc(31)(1-乙基-3-[二甲基氨丙基]-碳二亞胺鹽酸鹽,pierce,rockfordil)以10mg/ml的濃度加入各管中，立即渦旋，并在室溫下避光(目的是保留luminex小球的熒光編碼)孵育30分鐘。在15分鐘時(shí)再次混合。然后再一次地重復(fù)edc添加、孵育和再次混合。

然后，將500μltnt緩沖液(0.1mtrisph7.5，0.15mnacl，0.02％tween20)加入各管中并進(jìn)行渦旋。然后在微型離心機(jī)上以12,000rpm將所述管離心4分鐘，使小球分布到底部，并小心地除去上清液。接下來(lái)，加入500μl0.1％sds，并且再以12,000rpm將小球離心4分鐘，小心地除去上清液。最后，將50μl1×te緩沖液(10mmtrisph7.5,1mmedta)加至各管，并進(jìn)行渦旋。

該小球系列(33)——固定有擴(kuò)增子探針(29)——可以作為用于基因組dna分析的多重小球系列的一個(gè)組分納入。

實(shí)施例2

dna分析用多重編碼小球系列試劑的制備

圖2是示出將m個(gè)不同的編碼小球系列(各自具有各自的固定的bac-擴(kuò)增子探針dna)混合在一起來(lái)制備多重編碼小球系列的流程圖。

通過(guò)超聲處理、旋轉(zhuǎn)管容器、渦旋或類似方法，將編碼小球系列34、35、36和37制成懸液。然后，使用移液管將各小球系列的整分試樣轉(zhuǎn)移到另一個(gè)容器中，各個(gè)小球系列在該容器中合并和混合，然后變性(38)，從而有助于隨后在分析中與固定在所述小球上的探針dna的雜交。

在一個(gè)詳盡的實(shí)施例中，將各50μl的2個(gè)或多個(gè)小球系列——每一系列在一個(gè)單獨(dú)的管子里，每一編碼小球系列均固定有探針dna(33)——分批地合并到一個(gè)1.5ml離心管內(nèi)。在合并大約10個(gè)小球系列之后，將管離心，并小心除去上清液，目的是減少體積。再次重復(fù)，直至合并所有的小球系列(例如，luminex200系統(tǒng)至多支持100個(gè)編碼小球id或區(qū)域)。

在將所有的小球系列合并成為一個(gè)多重小球系列之后，將固定的探針dna變性。在對(duì)小球進(jìn)行離心并除去上清之后，加入500μl0.1nnaoh，并在室溫下孵育2分鐘。然后對(duì)小球進(jìn)行離心，并小心地除去上清。加入500μl10mmtris、15mmnacl、0.2％tween20，渦旋該管，然后對(duì)小球進(jìn)行離心，并除去上清液。然后重復(fù)進(jìn)行此洗滌步驟。最后，用1×te緩沖液將體積調(diào)整為500μl，并將此多重小球系列(39)在4℃下避光保存，直至用于分析中。

實(shí)施例3

多重基因組獲得和丟失分析

圖3是展示一個(gè)實(shí)施方案的流程圖，所述實(shí)施方案包括使用多重編碼小球系列在n個(gè)樣本上進(jìn)行多重基因組獲得和丟失分析。該流程圖示出了方法的實(shí)施方案，包括提供經(jīng)標(biāo)記的樣本和參照dna(5)，所述樣本和參照dna與兩個(gè)或者更多個(gè)編碼小球系列雜交(6)，檢測(cè)所述標(biāo)記樣本和參照dna與所述編碼小球系列雜交的信號(hào)(7)，和比較所述信號(hào)以確定所述樣本和參照dna之間的差異(8)。

圖3a為展示一個(gè)實(shí)施方案的流程圖，所述實(shí)施方案包括：使用多重編碼小球系列對(duì)n個(gè)樣本進(jìn)行多重基因組獲得和丟失分析。

在此實(shí)施例中，平行分析了兩個(gè)dna樣本和兩個(gè)參照。事實(shí)上，可以同時(shí)地以微量板形式平行分析幾十個(gè)樣本。也可以平行分析比此數(shù)目更多或者更少的樣本和參照。

在此實(shí)施例中，將四個(gè)dna樣本(40和41代表兩個(gè)參照，而42和43代表兩個(gè)分析樣本)用生物素進(jìn)行酶學(xué)標(biāo)記并純化。參照樣本通常為正常男性和女性的合并樣本，如人類女性基因組dna和人類男性基因組dna(promega,madisonwi)。將各dna樣本和參照與生物素標(biāo)記的核苷酸(45)(perkinelmer,bostonma)、非標(biāo)記核苷酸(49)(perkinelmer)、隨機(jī)引物(47)(operon,biotechnologies,huntsvilleal)和klenow片段聚合酶(46)(epicentrebiotechnologies,madisonwi)合并起來(lái)。孵育(44)之后，使用dna柱純化試劑盒(49)(如purelinkdnaminikit(invitrogen))純化(50)反應(yīng)產(chǎn)物。大約5μl的約200ng/μl經(jīng)標(biāo)記的樣本用于此分析隨后的雜交。

然后，使各生物素標(biāo)記的樣本或參照(51-54)與固定在多重編碼小球系列(56)的小球上的探針雜交(55)使用了每個(gè)小球系列(各探針類型)的大約500個(gè)小球；在此55重實(shí)施例中，使用了總共大約55×500＝27,500個(gè)小球/雜交。

因?yàn)榫幋a情況，各編碼小球系列的小球可以區(qū)別于其他編碼小球系列每一系列的小球。此55個(gè)小球系列中的每一系列均含有多個(gè)編碼小球，與所述編碼小球相連的擴(kuò)增子基本上代表完整的模板基因組dna片段。各小球系列的模板dna代表圖9所列的一個(gè)基因組座位。

雜交反應(yīng)中包括含有cot-1dna、甲酰胺、硫酸葡聚糖和1.9×ssc的雜交緩沖液?？傮w積大約為15μl，且反應(yīng)在硬的pcr型硬質(zhì)微量板如bio-radhsp9631(bio-radlaboratories,herculesca)的孔中進(jìn)行。使用鋁箔封口機(jī)(msf1001,bio-rad)嚴(yán)密地封住該板，將蒸發(fā)降至最低。在1150rpm的微量板振蕩培養(yǎng)箱(wallacncsincubator,perkinelmer)中于50℃過(guò)夜進(jìn)行雜交孵育(55)。

在雜交孵育(55)之后，與四個(gè)樣本雜交的四個(gè)多重小球系列(58-61)，就可以進(jìn)行雜交洗滌(63)，然后與熒光報(bào)告物(65)一起孵育，再進(jìn)行報(bào)告物洗滌(67)。首先，將100μl洗滌緩沖液a(2×ssc,50％甲酰胺)加入各孔之中，然后重新封閉該板，并在振蕩培養(yǎng)箱(轉(zhuǎn)動(dòng)速率為1150rpm)于50℃下孵育20分鐘。然后將各孔內(nèi)含物轉(zhuǎn)移到millipore0.46μmht過(guò)濾板(millipore,billericama)。之后，使用milliporemsvmhtsoo多頭抽真空裝置從各孔中真空除去液體。接下來(lái)，將100μl洗滌緩沖液b(2×ssc，0.1％igepal清潔劑)加入各孔，然后在50℃下再進(jìn)行一次為期20分鐘的振蕩孵育，并進(jìn)行真空抽吸。隨后，將100μl洗滌緩沖液c(0.2×ssc)加入各孔，并在50℃下重復(fù)為期20分鐘的振蕩孵育，然后進(jìn)行真空抽吸。

然后，將100μl1×phycolinksa溶液(鏈親和素-藻紅蛋白報(bào)告物)，64，加入各孔。此報(bào)告物溶液是通過(guò)將2μl500×phycolinksapj13s(prozyme,sanleandroca)混合到1ml報(bào)告物稀釋液中形成，其中所述稀釋液為1×pbs、0.1％bsa和0.05％tween20。將此報(bào)告物溶液與多重小球系列在1050rpm的振蕩培養(yǎng)箱中于25℃下孵育30分鐘。孵育之后，使用如前面的洗滌步驟中的多頭抽真空裝置從過(guò)濾板的孔中吸出溶液。

然后用洗滌緩沖液d(66)將小球洗滌兩次(67)，所述洗滌緩沖液d為含0.01％tween20的1×pbs。將100μl加入過(guò)濾板的各孔中，然后通過(guò)板孔底部的過(guò)濾器真空抽吸掉液體。再一次加入100μl，并在1050rpm的振蕩培養(yǎng)箱中于25℃下孵育2分鐘。所述第二次洗滌并不進(jìn)行抽吸，而是用來(lái)懸浮小球以進(jìn)行讀數(shù)。

之后，本實(shí)施例中的四個(gè)小球系列(68-71)即可在luminex200系統(tǒng)(luminexcorporation,austintx)上讀數(shù)(72)。依次讀取各孔中的小球的信號(hào)和小球id，并記錄下各孔或樣本的各小球id(小球區(qū)域)的前50個(gè)小球的熒光強(qiáng)度中值，并輸出到在一個(gè)數(shù)據(jù)文件(73)中。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)小球交聯(lián)；設(shè)定luminex讀數(shù)儀，使其分析各區(qū)域的50個(gè)小球，并且并未記錄到失敗。

圖4是96孔sbs標(biāo)準(zhǔn)微量板(80)的示意圖，其示出用于平行地對(duì)46個(gè)樣本進(jìn)行分析的兩份參照和兩份樣本的示例性位置。各標(biāo)記樣本的兩份重復(fù)雜交可用于確?？酌芊馐∏闆r下的數(shù)據(jù)形成，所述孔密封失敗會(huì)導(dǎo)致試劑從單個(gè)孔蒸發(fā)。在雙份重復(fù)沒(méi)有受到影響時(shí)，該樣本仍然形成數(shù)據(jù)。使用此微量板和編碼小球方法，實(shí)驗(yàn)員單人即可同時(shí)分析例如46個(gè)樣本和2個(gè)參照，并且全都雙份重復(fù)進(jìn)行，在第一天進(jìn)行標(biāo)記，雜交過(guò)夜，并在第二天進(jìn)行洗滌和讀數(shù)?；蛘撸治隹梢圆恢貜?fù)進(jìn)行或者不止兩個(gè)重復(fù)地進(jìn)行。所示出的是雙份的兩個(gè)參照(81和82)以及雙份的樣本，樣本的一個(gè)實(shí)例在83處標(biāo)示出。

圖5是使用男性的13號(hào)染色體上具有三體性的corielldna樣本形成數(shù)據(jù)的一個(gè)實(shí)例；

此數(shù)據(jù)由通過(guò)luminex讀數(shù)儀獲得的各小球區(qū)域的中間熒光值計(jì)算得到。從所有其他信號(hào)中減去陰性對(duì)照小球29、54和56的平均值(參見(jiàn)圖9)。然后，求出來(lái)自九個(gè)常染色體克隆的信號(hào)與來(lái)自男性和女性參照dna的相應(yīng)克隆信號(hào)的比值。計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化因子，從而在將該因子應(yīng)用到所有的常染色體克隆信號(hào)之時(shí)，其會(huì)使得平均的常染色體比值為數(shù)值1。然后，將此標(biāo)準(zhǔn)化因子應(yīng)用到所有的樣本信號(hào)。

將所得比值作圖，并示于圖5。請(qǐng)注意，13號(hào)染色體的克隆的比值全都在范圍1.3至1.6之間，而18和21號(hào)染色體的克隆以及其他常染色體克隆除了有一個(gè)之外全都低于1.2。13號(hào)染色體中的三體性很容易顯現(xiàn)。同樣地，樣本與男性參照相比的比值圖(方塊數(shù)據(jù)點(diǎn))對(duì)于x和y性染色體實(shí)際上都是平坦的。此乃男性樣本所應(yīng)有的反應(yīng)。樣本與女性參照相比較的圖(菱形數(shù)據(jù)點(diǎn))，對(duì)于x而言下移，而對(duì)于y而言上升，這同樣也是男性樣本應(yīng)有的反應(yīng)。

圖6是使用男性的18號(hào)染色體上具有三體性的corielldna樣本所形成的數(shù)據(jù)的一個(gè)實(shí)例。如針對(duì)圖5所述的那樣，形成數(shù)據(jù)并作圖。

圖7是使用女性的21號(hào)染色體上具有三體性的corielldna樣本所形成的數(shù)據(jù)的一個(gè)實(shí)例。如針對(duì)圖5所述的那樣，形成數(shù)據(jù)并作圖。

圖8是使用x染色體5-拷貝擴(kuò)增的corielldna樣本所形成的數(shù)據(jù)的一個(gè)實(shí)例。如針對(duì)圖5所述的那樣，形成數(shù)據(jù)并作圖。

圖9為一張圖表，其示出具有用于在示例性分析中形成擴(kuò)增子的人基因組dna插入物的bac克隆、其染色體和cyto條帶位置、陰性對(duì)照寡核苷酸的序列以及各擴(kuò)增子探針?biāo)潭ǖ男∏蛳盗械男∏騣d(luminex小球區(qū)域)。將圖5-8中x軸上順序編號(hào)的作圖點(diǎn)與圖9中自上而下列出的bac關(guān)聯(lián)。bacrp11-186j16被固定到兩個(gè)不同的小球區(qū)域(42和86)。

與人基因組沒(méi)有序列同源性的一個(gè)寡核苷酸被選擇作為陰性對(duì)照。所使用的具體陰性對(duì)照寡核苷酸為

5'gtcacatgcgatggatcgagctc3'seqidno.5；

5'ctttatcatcgttcccaccttaat3'seqidno.6；

5'gcacggacgaggccggtatgtt3'seqidno.7。

將與陰性對(duì)照寡核苷酸相連的三個(gè)小球區(qū)域29、54和56所形成的信號(hào)取平均值，并從所有其他小球信號(hào)中減去，然后再計(jì)算比值。

實(shí)施例4

圖10a是示出根據(jù)本文所述一個(gè)方面的一種制備復(fù)合探針的方法的簡(jiǎn)化流程圖。來(lái)自于一個(gè)來(lái)源的探針dna(92)和來(lái)自于另一個(gè)來(lái)源的探針dna(93)任選地通過(guò)pcr分別被擴(kuò)增(94和95)，從而得到擴(kuò)增子探針，隨后混合所述擴(kuò)增子探針形成復(fù)合探針(96)。將所述復(fù)合探針連接至基底(97)形成與基底相連的復(fù)合探針(98)。

圖10b是示出根據(jù)本文所述一個(gè)方面的一種制備復(fù)合探針的方法的簡(jiǎn)化流程圖，其中可以將探針dna(92和93)匯集形成復(fù)合混合物99，然后進(jìn)行任選的pcr擴(kuò)增(100)，從而制備復(fù)合探針材料(96)，所述復(fù)合探針材料連接至基底(97)形成與基底相連的復(fù)合探針(98)。

圖11是示出根據(jù)本文所述方法一個(gè)方面的一種制備復(fù)合探針的方法的簡(jiǎn)化流程圖。示出了一幅染色體模式圖(101)，該模式圖示出所關(guān)注的染色體(在本實(shí)施方案中，是22號(hào)染色體)的cytoband(102)。示出用于分析的具有目的區(qū)域中基因組座位的一個(gè)五種bac的系列(103)，且各bac基因組座位大致被擱置于所述染色體模式圖上。在本實(shí)施方案中，來(lái)自五種bac且被定位到與digeorge微缺失綜合征相對(duì)應(yīng)的cytoband22p11.2的dna被用于制備所述復(fù)合探針。該圖中的所述染色體模式圖示意性地示出選自一個(gè)cytoband的五種示例性bac的基因組鄰近關(guān)系；在此方法中，所述bacdna并非從人染色體提取。

利用常規(guī)方案從所述五種培養(yǎng)的bac中的每一種中提取和純化dna。將所培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞裂解，并通過(guò)離心和柱純化(qiagen,valenciaca)來(lái)沉淀并隨后純化dna(104)。隨后，將從各bac中純化的dna(105)用作簡(jiǎn)并寡核苷酸引物(dop)pcr擴(kuò)增(106)的模板。接下來(lái)，將dop引物序列用作特異性pcr引物，對(duì)所述dop產(chǎn)物進(jìn)行特異性pcr擴(kuò)增。這一方法得到了五種單獨(dú)的擴(kuò)增子探針(107)。接下來(lái)，將這些單獨(dú)的探針(107)匯集起來(lái)(108)，形成復(fù)合探針(109)。然后，將所述復(fù)合探針固定到一個(gè)系列的luminex編碼多重微球(全都具有一個(gè)小球“區(qū)域”，即具有相同的小球編碼身份)(110)，用于在多重基因組獲得-丟失分析中用作22p11.2cytoband探針。所述單獨(dú)的探針(107)的每一種也被單獨(dú)地固定，每一種被固定到具有一個(gè)獨(dú)特身份的小球系列上，從而使得其反應(yīng)可以與所述復(fù)合探針的反應(yīng)相比較。

圖12是測(cè)試分析的數(shù)據(jù)曲線圖，示出了復(fù)合探針與digeorge綜合征參照dna樣本(coriellinstituteformedicalresearch,camdennj)的使用。使用固定在luminex編碼微球上的pcr產(chǎn)物探針在luminexxmap平臺(tái)上進(jìn)行分析。使用doppcr由bacdna制備所述pcr產(chǎn)物探針。固定所述探針，微球系列上的每一種探針都可以被luminex系統(tǒng)分別鑒定，并如本文所述進(jìn)行測(cè)試分析。所述多重探針組包括八種來(lái)自基因組座位的常染色體探針，所述常染色體探針預(yù)計(jì)在dna樣本與男性和女性dna參照之間沒(méi)有表現(xiàn)出獲得或者丟失。所述多重探針組還包括六種x染色體探針和五種y染色體探針作為陽(yáng)性對(duì)照，從而在將測(cè)試樣本與相反性別的參照進(jìn)行比較時(shí)，可以觀察到性染色體中已知的獲得或者丟失的比值反應(yīng)。所述多重探針組還包括位于digeorge綜合征缺失的座位處的五種22q11.2探針(123)，參見(jiàn)下表i。所述五種bac的中心座位跨越大約0.45mb(445kb)，并且對(duì)于其175kb的典型長(zhǎng)度，總跨度略高于600kb。

表i.bac及其中心的chr22線性定位位置(mb)

參照?qǐng)D12，此為digeorge綜合征樣本與男性和女性正常參照dna兩者相比較的兩個(gè)數(shù)據(jù)系列的比值圖。數(shù)據(jù)系列120是digeorge樣本與男性參照dna相比較的比值反應(yīng)；其表明所有x染色體探針中均有相對(duì)的獲得(125)，而在所有y染色體探針中均有丟失(126)。該反應(yīng)表明，所述樣本來(lái)自于女性。數(shù)據(jù)系列121是同一樣本與女性參照dna的比較，其表明，對(duì)于x和y性染色體探針，比值反應(yīng)均接近1.0，這確認(rèn)了該樣本來(lái)自于女性。圖中1.0的比值線(122)指示在樣本與正常參照相比沒(méi)有基因組獲得或者丟失時(shí)，對(duì)于任何給定探針而言，樣本/參照比值的預(yù)期結(jié)果。將常染色體探針(127)加入到此組，作為預(yù)期會(huì)產(chǎn)生大約1.0比值的對(duì)照，它們的確如此。

來(lái)自于22q.11.2座位的五種探針(123)均包含在此組中。這五種探針與男性和女性參照dna相比，全都表現(xiàn)出比值小于1，這與所述樣本中在該座位處的已知基因組缺失相一致。最后，將一個(gè)類型的多重小球偶聯(lián)到含有所述五種22q11.2探針的混合物或匯集物的復(fù)合探針(123)。所述復(fù)合探針的比值反應(yīng)(124)也指示缺失，其與所匯集的所述五種組成型探針的平均反應(yīng)相當(dāng)一致。

實(shí)施例5

圖13是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面由luminex小球陣列獲得-丟失分析得到的比值數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)來(lái)自于從產(chǎn)前羊水樣本提取的胎兒dna，所述胎兒的性別并不明確知曉。進(jìn)行分析，并且男性和女性參照在同一96-孔微量板的不同孔中同時(shí)進(jìn)行分析。圖例(136)標(biāo)識(shí)出兩個(gè)數(shù)據(jù)標(biāo)記，表示參比女性的(菱形作圖點(diǎn))和參比男性的(方形作圖點(diǎn))。比值＝1.0的水平線(132)位于該圖的中心。所述比值標(biāo)尺(133)為該圖的縱軸。示出了具有針對(duì)女性參照形成的樣本/參照比值的第一數(shù)據(jù)圖(130)。對(duì)于該圖，針對(duì)x染色體探針的數(shù)據(jù)(134)表現(xiàn)出比值小于1，針對(duì)y染色體探針的數(shù)據(jù)(135)與女性相比表現(xiàn)出獲得。這與男性樣本是一致的。第二數(shù)據(jù)圖(131)利用接近比值等于1.0的線的男性參照群，也與男性樣本一致。兩個(gè)數(shù)據(jù)系列都顯示出陣列中的其他探針并沒(méi)有明顯地偏向x探針的左側(cè)，表明是一個(gè)正常樣本。

表ii示出與圖13和14中x軸上順序編號(hào)的作圖點(diǎn)有關(guān)的bac身份。

表ii.

auto表示常染色體。

圖14為使用具有先前表征的基因組異常(三倍體18和xxx)的樣本(coriellinstituteofmedicalresearch,trentonnj)，來(lái)自同一luminex小球陣列分析獲得的比值數(shù)據(jù)。同樣地，該樣本參比女性(145)和參比男性(146)的兩個(gè)數(shù)據(jù)圖被同時(shí)展示。三倍體18的探針，全都產(chǎn)生與兩個(gè)參照相比表現(xiàn)出獲得(142)的比值數(shù)據(jù)。在參比女性的圖(145)上，x探針的數(shù)據(jù)顯示出獲得(144)。此獲得的幅度與三倍體獲得(142)的幅度相同，這與xxx(樣本)/xx(女性參照)比值的結(jié)果一致。參比男性的圖(146)在x探針上顯示出大得多的獲得(143)，正如以xxx(樣本)/x(男性參照)比值所預(yù)期的那樣。針對(duì)y染色體的探針有噪音，這在acgh中很常見(jiàn)，但是其他的探針全都緊緊地簇?fù)碛诒戎档扔?.0的線(141)周圍。比值標(biāo)尺(141)是該圖的縱軸。

這些實(shí)施例表明，根據(jù)針對(duì)男性和女性參照形成的比值數(shù)據(jù)，具有正常的x和y染色體組分的樣本的性別是顯而易見(jiàn)的。對(duì)于多x異常樣本同樣顯而易見(jiàn)的是，對(duì)多拷貝的x的定量在使用兩個(gè)參照時(shí)更為直接。

本說(shuō)明書中提及的任何專利或出版物均通過(guò)援引納入本文，其程度就如同每一份出版物都逐一特別地被指出通過(guò)援引納入。以下申請(qǐng)均通過(guò)援引全文納入本申請(qǐng)：2006年12月22日提交的流水號(hào)為11/615,739的美國(guó)專利申請(qǐng)；2008年3月26日提交的流水號(hào)為12/055,919的美國(guó)專利申請(qǐng)；以及2005年12月23日提交的流水號(hào)為60/753,584的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)、2005年12月23日提交的流水號(hào)為60/753,822的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)、2006年2月3日提交的流水號(hào)為60/765,311的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)、2006年2月3日提交的流水號(hào)為60/765,355的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)和2007年12月5日提交的流水號(hào)為60/992,489的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)。

本文描述的組合物和方法以示例的方式代表本發(fā)明的某些實(shí)施方案，而并無(wú)意于限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以想到其改變以及其他用途。在不背離本發(fā)明權(quán)利要求所列出的范圍的情況下，可以作出所述變化和其他用途。

序列表

<110>珀金埃爾默.拉斯公司

<120>與多重基因組獲得和丟失分析相關(guān)的方法和組合物

<130>nen-23603/16

<150>11/615,739

<151>2006-12-22

<150>60/992,489

<151>2007-12-05

<150>12/055,919

<151>2008-03-26

<150>60/765,355

<151>2006-02-03

<150>60/765,311

<151>2006-02-03

<150>60/753,822

<151>2005-12-23

<150>60/753,584

<151>2005-12-23

<160>7

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>簡(jiǎn)并寡核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(11)..(16)

<223>n為a、c、g或t

<400>1

ccgactcgagnnnnnnctagaa22

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>簡(jiǎn)并寡核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(11)..(16)

<223>n為a、c、g或t

<400>2

ccgactcgagnnnnnntaggag22

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>簡(jiǎn)并寡核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(11)..(16)

<223>n為a、c、g或t

<400>3

ccgactcgagnnnnnnttctag22

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

ggaaacagcccgactcgag19

<210>5

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>對(duì)照寡核苷酸

<400>5

gtcacatgcgatggatcgagctc23

<210>6

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>對(duì)照寡核苷酸

<400>6

ctttatcatcgttcccaccttaat24

<210>7

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>對(duì)照寡核苷酸

<400>7

gcacggacgaggccggtatgtt22