本發(fā)明涉及數(shù)字pcr生物檢測領域，特別是涉及一種數(shù)字pcr芯片信號讀取方法。

背景技術：

在進行核酸定量分析檢測時，核酸樣品常應用聚合酶鏈反應(ploymerasechainreaction，pcr)擴增以方便檢測。1992年由higuchi等提出的實時熒光定量pcr(real-timepcr，qpcr)技術[polymerasechainreaction(pcr)amplificationandhumanleukocyteantigen(hla)-dqalphaoligonucleotidetypingonbiologicalevidencesamples：caseworkexperience，journalofforensicsciences37(3)：700-26·june1992]，已發(fā)展成為一種最普遍應用的定量分析技術，廣泛應用于臨床疾病診斷、檢驗檢疫、食品安全等領域。qpcr的分析結果高度依賴循環(huán)閾值(cyclethreshold，ct值)，而ct值又由pcr效率決定。當樣本中檢測靶標純度、濃度很低時，會顯著降低qpcr的反應效率和成功率。qpcr是一種相對定量的檢測技術，當前主要應用在待測樣本需要相對定量的場合，在檢測低頻稀有突變、微小表達差異(小于1.5倍)、微量核酸樣本時，qpcr通常無法成功。qpcr通常是利用移液槍將反應體系分布在96或384孔板中，經(jīng)過后續(xù)擴增與熒光信號檢測完成實驗。單個孔的反應體積一般在微升級別，受到移液槍和其他相關系統(tǒng)精度的限制，在少量樣本的分析中面臨挑戰(zhàn)。fludigm的微流控芯片可將每個反應液滴體積降至納升級別，顯著降低了檢測限度。然而該芯片制備過程復雜，成本高昂，且對于常見分析，微升級別的反應體系已經(jīng)能滿足其分析精度要求。

vogelstein等人于1999年提出的數(shù)字pcr(digitalpcr，dpcr)技術[b.vogelsteinandkennethw.kinzler,digitalpcr,proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica,1999,96(16):9236-9241]近年來迅猛發(fā)展。dpcr將一份樣品分配到幾萬甚至百萬個獨立反應單元中，每個反應單元包含至多1個目標分子，分配效率達到了分子水平。然后在每個反應單元中分別進行pcr擴增反應，擴增結束后根據(jù)監(jiān)測到的熒光信號進行統(tǒng)計學分析，得到原樣品的濃度。dpcr不依賴于ct值，不受擴增效率的影響，因此具有很好的準確度和重現(xiàn)性，可以實現(xiàn)絕對定量分析。因其檢測結果準確可靠，且檢測限度極低，故廣泛應用在基因不穩(wěn)定性分析、腫瘤早期診斷、產(chǎn)前診斷等領域。

dpcr的核心是液滴分割技術，當前主要通過微流控形成微液滴和微孔芯片實現(xiàn)。首先將樣本分割成大量微小液滴，分割結束后進行pcr反應，然后利用儀器讀取所有液滴中的熒光信號，通過熒光信號的強度判斷陽性反應和陰性反應，最后根據(jù)陽性反應液滴數(shù)在總反應液滴數(shù)中的比例計算出原始樣本中標記dna分子的濃度。而dpcr的分液數(shù)目直接決定了dpcr的檢測精度。微流控dpcr借助復雜的液體流道實現(xiàn)液滴的定量分割，擴增后逐個分析液滴的熒光信號，液滴數(shù)量可以達到百萬個，其缺點在于微孔道易堵塞，微液滴不穩(wěn)定，在pcr熱循環(huán)反應過程中液滴易發(fā)生融合、破損，此外，微液滴dpcr的信號采用串行的讀取方式，檢測耗時長，芯片成本高。芯片法的優(yōu)勢是可實現(xiàn)大量液滴的一步獲取和分析，但受限于檢測光學系統(tǒng)的有效視場，單次分析的微孔數(shù)目一般不超過20000個[中國發(fā)明專利，申請?zhí)枺?01380022560.0]。

綜上所述，受限于目前的數(shù)字pcr液滴分割技術，采用微孔芯片法進行液滴分割的數(shù)字pcr方式，單次檢測數(shù)目有限，精度較低。開發(fā)高通量數(shù)字pcr芯片熒光信號讀取和分析方法具有重要意義。

技術實現(xiàn)要素：

鑒于以上所述現(xiàn)有技術的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種數(shù)字pcr芯片信號讀取方法，用于解決現(xiàn)有技術中數(shù)字pcr檢測中分液量限制引起檢測精度低的問題。

為實現(xiàn)上述目的及其他相關目的，本發(fā)明提供一種數(shù)字pcr芯片信號讀取方法，所述數(shù)字pcr芯片信號讀取方法至少包括：

步驟s1：將反應溶液加入若干個反應芯片中，所述反應芯片的數(shù)量不少于2個；

步驟s2：將各反應芯片加入pcr擴增儀中進行擴增；

步驟s3：將各反應芯片放置于熒光成像系統(tǒng)中，獲取各反應芯片的熒光試劑圖像；

步驟s4：對各反應芯片的熒光試劑圖像進行歸一化處理；

步驟s5：根據(jù)各反應芯片的熒光試劑圖像讀取各反應芯片中的有效孔數(shù)目，并將有效孔數(shù)目進行累加以獲得總有效孔數(shù)目；

步驟s6：根據(jù)各反應芯片的熒光試劑圖像讀取各反應芯片中位孔內部的熒光強度，并建立熒光直方圖；

步驟s7：根據(jù)所述熒光直方圖設置各反應芯片的陽性判定閾值，獲取各反應芯片中陽性位點的數(shù)目，對陽性位點的數(shù)目進行累加以得到總陽性位點數(shù)目；

步驟s8：根據(jù)總陽性位點數(shù)目和總有效孔數(shù)目的比值，利用泊松方程計算所述反應溶液中的待測樣本溶液的濃度。

優(yōu)選地，所述反應溶液平行地加入各反應芯片中。

更優(yōu)選地，所述反應溶液加入到各反應芯片中的方法包括刷入、打印或者微流控方式。

優(yōu)選地，各反應芯片的擴增周期為20～40個周期。

優(yōu)選地，所述熒光試劑圖像包括：rox熒光試劑圖像，fam熒光試劑圖像或vic熒光試劑圖像。

更優(yōu)選地，所述歸一化處理進一步包括以下步驟：

步驟s41：讀取實際拍攝的熒光試劑圖像l；

步驟s42：拍攝相同積分時間條件下所述熒光試劑圖像的暗場圖像d；

步驟s43：拍攝相同積分時間條件下所述熒光試劑圖像的平場圖像f；

步驟s44：拍攝0積分時間下所述熒光試劑圖像的偏置圖像b；

步驟s45：校準所述熒光試劑圖像，得到校準后的熒光試劑圖像j，滿足如下關系式：

j(x,y)＝[l(x,y)-d(x,y)]/[f(x,y)-b(x,y)]，

其中，j(x,y)為校準后的熒光試劑圖像在坐標(x,y)處的灰度值，l(x,y)為實際拍攝的熒光試劑圖像在坐標(x,y)處的灰度值，d(x,y)為相同積分時間條件下的熒光試劑圖像的暗場圖像在坐標(x,y)處的灰度值，f(x,y)為相同積分時間條件下的熒光試劑圖像的平場圖像在坐標(x,y)處的灰度值，b(x,y)為0積分時間條件下的熒光試劑圖像的偏置圖像在坐標(x,y)處的灰度值；

步驟s46：對校準后的熒光試劑圖像j進行灰度分析，進而獲取歸一化處理后的熒光試劑圖像j'，滿足如下關系式：

其中，r＝2n，n為拍攝熒光試劑圖像的探測器的模數(shù)轉換單元輸出的有效位數(shù)，j(x,y)為歸一化處理后的熒光試劑圖像在坐標(x,y)處的灰度值。

更優(yōu)選地，步驟s5進一步包括：

步驟s51：讀取rox熒光試劑圖像；

步驟s52：對所述rox熒光試劑圖像進行不少于三次的膨脹處理；

步驟s53：獲取膨脹圖像之后，檢測所述膨脹圖像內最大連通區(qū)域；

步驟s54：讀取所述rox熒光試劑圖像中與所述膨脹圖像內最大連通區(qū)域所對應的連通區(qū)域；

步驟s55：對所述rox熒光試劑圖像中對應區(qū)域內的灰度值進行邊緣檢測算法，并對圖像中的反應孔進行擬合，獲取rox陽性孔位置中心坐標和陽性孔數(shù)目；

步驟s56：將各反應芯片中rox陽性孔數(shù)目進行累加，總有效孔數(shù)目滿足如下關系式：

dtotal＝d1+d2+d3+......+dn，

其中，dtotal為總有效孔數(shù)目，d1～dn分別為各個反應芯片的陽性孔數(shù)目，n為所述反應芯片的數(shù)量。

更優(yōu)選地，步驟s6進一步包括：

步驟s61：讀取歸一化處理后的fam熒光試劑圖像或歸一化處理后的vic熒光試劑圖像；

步驟s62：根據(jù)步驟s5中獲取的對應反應芯片的rox陽性孔位置中心坐標，讀取歸一化處理后的fam熒光試劑圖像或歸一化處理后的vic熒光試劑圖像在該對應坐標下的灰度值；

步驟s63：將所有反應芯片中的fam熒光強度值或vic熒光強度值分別繪制成fam熒光直方圖或vic熒光直方圖。

更優(yōu)選地，步驟s6進一步包括：

步驟s61：讀取歸一化處理后的fam熒光試劑圖像或歸一化處理后的vic熒光試劑圖像；

步驟s62：根據(jù)步驟s5中獲取的對應反應芯片的rox陽性孔位置中心坐標，讀取歸一化處理后的fam熒光試劑圖像或歸一化處理后的vic熒光試劑圖像在該對應坐標下的灰度值及其周圍坐標下的灰度值，分別滿足如下關系：

其中，s(x,y)為rox陽性孔位置中心坐標對應的歸一化處理后的fam熒光試劑圖像或歸一化處理后的vic熒光試劑圖像中的灰度值，s(x-1,y)、s(x-1,y-1)、s(x-1,y+1)、s(x,y-1)、s(x,y+1)、s(x+1,y-1)、s(x+1,y)、s(x+1,y+1)為周圍坐標對應的歸一化處理后的fam熒光試劑圖像或歸一化處理后的vic熒光試劑圖像中的灰度值；

步驟s63：將所有反應芯片中的fam熒光強度值或vic熒光強度值分別繪制成fam熒光直方圖或vic熒光直方圖。

更優(yōu)選地，步驟s7進一步包括：選定所述fam熒光直方圖或所述vic熒光直方圖的尖峰對應的灰度值的平均值為所述陽性判定閾值，若熒光強度高于所述陽性判定閾值，則認為是陽性反應；若熒光強度低于所述陽性判定閾值，則認為是陰性反應；以此獲取總陽性位點數(shù)目。

更優(yōu)選地，反應溶液中的待測樣本溶液的濃度滿足如下關系式：

其中，dtotal為總有效孔數(shù)目，pos為總陽性位點數(shù)目。

如上所述，本發(fā)明的數(shù)字pcr芯片信號讀取方法，具有以下有益效果：

本發(fā)明的數(shù)字pcr芯片信號讀取方法的擴增系統(tǒng)與檢測系統(tǒng)能夠和現(xiàn)有微孔芯片式數(shù)字pcr技術完全兼容，通過多次成像的方式獲取多張擴增后的芯片熒光圖像，對擴增芯片圖像進行直方圖、散點圖分析獲得高通量的數(shù)字pcr檢測結果，提高檢測精度。

附圖說明

圖1顯示為本發(fā)明的數(shù)字pcr芯片信號讀取方法的流程示意圖。

圖2顯示為本發(fā)明的rox熒光試劑圖像。

圖3顯示為本發(fā)明的fam熒光試劑圖像。

圖4顯示為本發(fā)明的vic熒光試劑圖像。

圖5顯示為本發(fā)明的rox通道擬合的反應孔示意圖。

圖6顯示為本發(fā)明的歸一化處理后的fam熒光試劑圖像。

圖7顯示為本發(fā)明的fam熒光直方圖。

圖8顯示為本發(fā)明的vic熒光直方圖。

元件標號說明

s1～s7步驟

s41～s46步驟

s51～s56步驟

s61～s63步驟

具體實施方式

以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書所揭露的內容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應用，本說明書中的各項細節(jié)也可以基于不同觀點與應用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。

請參閱圖1～圖8。需要說明的是，本實施例中所提供的圖示僅以示意方式說明本發(fā)明的基本構想，遂圖式中僅顯示與本發(fā)明中有關的組件而非按照實際實施時的組件數(shù)目、形狀及尺寸繪制，其實際實施時各組件的型態(tài)、數(shù)量及比例可為一種隨意的改變，且其組件布局型態(tài)也可能更為復雜。

實施例一

如圖1所示，本實施例提供一種數(shù)字pcr芯片信號讀取方法，所述數(shù)字pcr芯片信號讀取方法具體包括以下步驟：

步驟s1：將反應溶液加入若干個反應芯片中，并利用礦物油將涂布好的各反應芯片進行油封，然后為各反應芯片加上透明蓋子進行封裝。所述反應芯片的數(shù)量不少于2個。

具體地，在本實施例中，選取16個數(shù)字pcr反應芯片。所述數(shù)字pcr芯片是指可將pcr反應體系分隔固定的平面微孔結構，所述微孔結構為任意幾何形狀的閉孔或通孔，所述數(shù)字pcr芯片的材質包括但不限于硅基，玻璃，塑料和金屬，再此不一一列舉。

具體地，在本實施例中，所述反應溶液平行地加入各反應芯片中。更具體地，配置反應溶液，所述反應溶液的量為所有反應芯片的總進液量，假設單個反應芯片的進液量為15ul，則16個反應芯片的總進液量為240ul，因此直接配置240ul的反應溶液，所述反應溶液包括但不限于待測樣本溶液、溴酚藍(mastermix)、探針或引物，將所述反應溶液分別加入到各反應芯片中，以此實現(xiàn)平行地加入。所述反應溶液加入到各反應芯片中的方法包括刷入、打印或者微流控方式，在本實施例中，采用微流控方式。

步驟s2：將各反應芯片加入pcr擴增儀中進行擴增。

具體地，將封裝好的各反應芯片放置進入pcr擴增儀中，所述pcr擴增儀可以是現(xiàn)有技術中任意一種，再此不做具體限定。按照設定的pcr擴增條件進行反應，pcr擴增周期一般為20～40個周期。

步驟s3：將各反應芯片放置于熒光成像系統(tǒng)中，獲取各反應芯片的熒光試劑圖像。

具體地，采用不同的熒光試劑獲取每張反應芯片的多張圖像，所述熒光試劑包括但不限于rox(羅紅霉素)、sybr(不對稱花青染料)、tamra(6-羧基四甲基若丹明)、tesasred(德州紅)、cy5(菁染料)、fam(6－羧基熒光素)、tet(四氯熒光素)、vic(綠色熒光蛋白)、joe(2，7－二甲基－4，5－二氯－6－羧基熒光素)、hex(六氯－6－甲基熒光素)。所述熒光試劑圖像的數(shù)量不少于2張。在本實施例中，每個反應芯片包括兩種熒光試劑圖像，分別對應于rox熒光試劑圖像和fam熒光試劑圖像。如圖2所示為rox熒光試劑圖像，在本實施例中，采用555nm～585nm波長的光照射所述反應芯片，利用圖像傳感器采集610nm～650nm波長的光獲取所述rox熒光試劑圖像。如圖3所示為fam熒光試劑圖像，在本實施例中，采用500nm～535nm波長的光照射所述反應芯片，利用圖像傳感器采集560nm～580nm波長的光獲取所述fam熒光試劑圖像。

步驟s4：對各反應芯片的熒光試劑圖像進行歸一化處理。

具體地，需要進行歸一化處理的熒光試劑圖像包括所述fam熒光試劑圖像。所述rox熒光試劑圖像可以進行歸一化處理，以獲得更好的識別效果；也可以不進行歸一化處理，對最終的結果影響不大。在本實施例中，所述rox熒光試劑圖像及所述fam熒光試劑圖像均執(zhí)行圖像歸一化處理。所述圖像的歸一化處理包括以下步驟：

步驟s41：讀取實際拍攝的熒光試劑圖像l；

步驟s42：拍攝相同積分時間條件下所述熒光試劑圖像的暗場圖像d(darkframe)；

步驟s43：拍攝相同積分時間條件下所述熒光試劑圖像的平場圖像f(flatframe)；

步驟s44：拍攝0積分時間下所述熒光試劑圖像的偏置圖像b(biasframe)；

步驟s45：校準所述熒光試劑圖像，得到校準后的熒光試劑圖像j，滿足如下關系式：

j(x,y)＝[l(x,y)-d(x,y)]/[f(x,y)-b(x,y)]，

其中，j(x,y)為校準后的熒光試劑圖像在坐標(x,y)處的灰度值，l(x,y)為實際拍攝的熒光試劑圖像在坐標(x,y)處的灰度值，d(x,y)為相同積分時間條件下的熒光試劑圖像的暗場圖像在坐標(x,y)處的灰度值，f(x,y)為相同積分時間條件下的熒光試劑圖像的平場圖像在坐標(x,y)處的灰度值，b(x,y)為0積分時間條件下的熒光試劑圖像的偏置圖像在坐標(x,y)處的灰度值；

步驟s46：對校準后的熒光試劑圖像j進行灰度分析，進而獲取歸一化處理后的熒光試劑圖像j'，滿足如下關系式：

其中，r＝2n，n為拍攝熒光試劑圖像的探測器的模數(shù)轉換單元(adc)輸出的有效位數(shù)，j'(x,y)為歸一化處理后的熒光試劑圖像在坐標(x,y)處的灰度值。

步驟s5：根據(jù)反應芯片的熒光試劑圖像讀取各反應芯片中的有效孔數(shù)目，并將有效孔數(shù)目進行累加得到總有效孔數(shù)目dtotal。

具體地，包括以下步驟：

步驟s51：在本實施例中，讀取rox熒光成像通道下的16張經(jīng)過歸一化處理后的rox熒光試劑圖像j'rox。在實際應用中，也可直接讀取實際拍攝的所述rox熒光試劑圖像lrox，在此不一一贅述。

步驟s52：對歸一化處理后的rox熒光試劑圖像j'rox進行三次或者三次以上(即不少于三次)的膨脹處理。在本實施例中，一種可實施的膨脹算法具體實現(xiàn)matlab代碼如下：

步驟s53：獲取膨脹圖像之后，檢測所述膨脹圖像內最大連通區(qū)域；

步驟s54：讀取歸一化處理后的rox熒光試劑圖像j'rox中與所述膨脹圖像內最大連通區(qū)域所對應的連通區(qū)域；

步驟s55：對歸一化處理后的rox熒光試劑圖像j'rox中對應區(qū)域內的灰度值進行邊緣檢測算法，并采用包括但不限于圓形、菱形、正六邊形等形狀對圖像中的反應孔進行擬合，獲取rox陽性孔位置中心坐標和陽性孔數(shù)目dn；如圖5所示，在本實施例中，采用圓形對歸一化處理后的rox熒光試劑圖像j'rox中的反應孔進行擬合，圓圈中心坐標即為中心坐標。

步驟s56：將多個反應芯片中rox陽性孔數(shù)目進行累加，總有效孔數(shù)目滿足如下關系式：

dtotal＝d1+d2+d3+......+dn

在本實施例中，所述反應芯片的數(shù)量為16個，n取值16。

步驟s6：根據(jù)反應芯片的熒光試劑圖像讀取所有反應芯片中的位孔內部熒光強度，并形成熒光直方圖。

具體地，包括以下步驟：

步驟s61：對于特定一張反應芯片，讀取其對應的歸一化處理后的fam熒光試劑圖像j'fam，如圖6所示為歸一化處理后的fam熒光試劑圖像j'fam；

步驟s62：根據(jù)步驟s5中獲取的對應反應芯片的rox陽性孔位置中心坐標，讀取歸一化處理后的fam熒光試劑圖像j'fam在該對應坐標下的灰度值；

步驟s63：將所有16個反應芯片中的fam熒光強度值繪制成fam熒光直方圖，如圖7所示，其中，x軸為灰度值，y軸為對應x軸灰度值的像素數(shù)量。

步驟s7：根據(jù)所述fam熒光直方圖設置各反應芯片的陽性判定閾值，獲取陽性位點數(shù)目，并將陽性位點數(shù)目進行累加。

具體地，一般而言，對于一個有效的fam熒光直方圖，會出現(xiàn)兩個尖峰；選定兩個尖峰的x軸坐標的平均值為陽性判定閾值(設兩個尖峰的x軸坐標為x1和x2，則所述反應閾值為如果熒光強度高于所述陽性判定閾值，則認為是陽性反應，如果熒光強度低于所述陽性判定閾值，則認為是陰性反應，可獲得各芯片對應的fam通道陽性反應數(shù)目posfam、及fam通道陰性反應數(shù)目negfam。陽性反應數(shù)目即為陽性位點數(shù)目，將陽性位點數(shù)目進行累加以獲得總fam通道陽性位點數(shù)目posfamtotal。

步驟s8：根據(jù)總fam通道陽性位點數(shù)目posfamtotal和總有效孔數(shù)目dtotal的比值，利用泊松方程計算所述反應溶液中的待測樣本溶液的濃度，滿足如下關系式：

實施例二

本實施例提供一種數(shù)字pcr芯片信號讀取方法，所述數(shù)字pcr芯片信號讀取方法與實施例一基本相同，不同之處在于，用vic熒光試劑圖像替換所述fam熒光試劑圖像，以針對不同的檢測對象。

具體地，在步驟s3中，獲取的熒光試劑圖像包括rox熒光試劑圖像和vic熒光試劑圖像。如圖4所示為vic熒光試劑圖像，在本實施例中，采用450nm～490nm波長的光照射所述反應芯片，利用圖像傳感器采集515nm～530nm波長的光獲取所述vic熒光試劑圖像。

具體地，在步驟s4中，對所述rox熒光試劑圖像和vic熒光試劑圖像均進行歸一化處理，歸一化處理的具體步驟與實施例一一致，在此不一一贅述。

具體地，在步驟s6中，讀取特定反應芯片對應的歸一化處理后的vic熒光試劑圖像j'vic；根據(jù)步驟s5中獲取的對應反應芯片的rox陽性孔位置中心坐標，讀取歸一化處理后的vic熒光試劑圖像j′vic在該對應坐標下的灰度值；將所有16個反應芯片中的vic熒光強度值繪制成vic熒光直方圖，如圖8所示，其中，x軸為灰度值，y軸為對應x軸灰度值的像素數(shù)量。

具體地，在步驟s7中，選定vic熒光直方圖中兩個尖峰的x軸坐標的平均值為陽性判定閾值(在本實施例中，設兩個尖峰的x軸坐標為x3和x4，則所述反應閾值為如果熒光強度高于所述陽性判定閾值，則認為是陽性反應，如果熒光強度低于所述陽性判定閾值，則認為是陰性反應，可獲得各芯片對應的vic通道陽性反應數(shù)目posvic及vic通道陰性反應數(shù)目negvic。將陽性位點數(shù)目進行累加以獲得總vic通道陽性位點數(shù)目posvictotal。

具體地，在步驟s8中，根據(jù)總vic通道陽性位點數(shù)目posvictotal和總有效孔數(shù)目dtotal的比值，利用泊松方程計算所述反應溶液中的待測樣本溶液的濃度，滿足如下關系式：

實施例三

本實施例提供一種數(shù)字pcr芯片信號讀取方法，所述數(shù)字pcr芯片信號讀取方法與實施例一、二基本相同，不同之處在于，步驟s62中，讀取的灰度值為對應坐標像素及對應坐標周圍像素的熒光試劑圖像灰度平均值。

具體地，步驟s62：根據(jù)步驟s5中獲取的對應反應芯片的rox陽性孔位置中心坐標，讀取歸一化處理后的fam熒光試劑圖像j′fam或歸一化處理后的vic熒光試劑圖像j'vic在該對應坐標下的灰度值及對應坐標周圍坐標的灰度值，并計算灰度平均值。在本實施例中，獲取對應坐標周圍9個像素，分別對應上、下、左、右、左上、左下、右上、右下8個方向，假設反應芯片的rox陽性孔位置中心坐標為(x，y)，則讀取歸一化處理后的fam熒光試劑圖像j′fam或歸一化處理后的vic熒光試劑圖像j'vic中對應的灰度值為s(x,y)，灰度平均值為：

其他步驟的方法一致，在此不一一贅述。

本發(fā)明的數(shù)字pcr芯片熒光信號讀取方法通過多張芯片圖像融合的算法可以在不改變現(xiàn)有芯片微孔數(shù)量的基礎上提高dpcr分液數(shù)目，從而最終提升dpcr的檢測精度。

綜上所述，本發(fā)明提供一種數(shù)字pcr芯片信號讀取方法，包括：將反應溶液加入若干個反應芯片中；將各反應芯片加入pcr擴增儀中進行擴增；將各反應芯片放置于熒光成像系統(tǒng)中，獲取各反應芯片的熒光試劑圖像；對各反應芯片的熒光試劑圖像進行歸一化處理；根據(jù)各反應芯片的熒光試劑圖像讀取各反應芯片中的有效孔數(shù)目，并將有效孔數(shù)目進行累加以獲得總有效孔數(shù)目；根據(jù)各反應芯片的熒光試劑圖像讀取各反應芯片中位孔內部的熒光強度，并建立熒光直方圖；根據(jù)所述熒光直方圖設置各反應芯片的陽性判定閾值，獲取各反應芯片中陽性位點的數(shù)目，對陽性位點的數(shù)目進行累加以得到總陽性位點數(shù)目；根據(jù)總陽性位點數(shù)目和總有效孔數(shù)目的比值，利用泊松方程計算所述反應溶液中的待測樣本溶液的濃度。本發(fā)明的數(shù)字pcr芯片信號讀取方法的擴增系統(tǒng)與檢測系統(tǒng)能夠和現(xiàn)有微孔芯片式數(shù)字pcr技術完全兼容，通過多次成像的方式獲取多張擴增后的芯片熒光圖像，對擴增芯片圖像進行直方圖、散點圖分析獲得高通量的數(shù)字pcr檢測結果，提高檢測精度。所以，本發(fā)明有效克服了現(xiàn)有技術中的種種缺點而具高度產(chǎn)業(yè)利用價值。

上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術領域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應由本發(fā)明的權利要求所涵蓋。