本發(fā)明涉及分子生物學和疾病基因研究和診斷領(lǐng)域。具體的，本發(fā)明涉及在多囊卵巢綜合征(pcos)的基因表達分析的研究中采用的內(nèi)參基因組合和檢測多囊卵巢綜合征的內(nèi)參基因組合。

背景技術(shù)：

多囊卵巢綜合征(pcos)，癥狀包括排卵功能障礙、多囊卵巢、雄激素過多，是常見的婦科內(nèi)分泌疾病，并且是女性生殖失敗的主要原因(kovacsandwood，2001；wild，etal.，2000)。根據(jù)不同的診斷標準，其患病率的估計是6％～18％(azziz，etal.，2004；christian，etal.，2003；march，etal.，2010)。多囊卵巢綜合征患者易發(fā)生多種代謝紊亂包括胰島素抵抗、2型糖尿病(t2dm)、肥胖、血脂異常、慢性低水平炎癥和心血管疾病(cvd)以及心理障礙(azziz，etal.，2004；ehrmann，2005；jayasenaandfranks，2014；kovacsandwood，2001；orio，etal.，2004；ozcandag，etal.，2015；spritzer，etal.，2015；stepto，etal.，2013；wild，etal.，2000)。

盡管pcos的確切發(fā)病機制仍不清楚，但經(jīng)推斷其機制可能涉及到卵泡發(fā)育過程中卵巢顆粒細胞(gcs)介導的異常的激素反應。已有的研究表明，pcos的發(fā)生與pcos患者的顆粒細胞中促黃體生成激素(lh)相對于lh的升高以及高表達和過度激活的促黃體激素/絨毛膜促性腺激素受體相關(guān)，阻礙了卵泡的成熟和排卵過程(ehrmann，etal.，1995；jakimiuk，etal.，2001；kanamarlapudi，etal.，2016；willis，etal.，1998；yong，etal.，1992)。此外，顆粒細胞功能受損還會導致卵巢內(nèi)雄激素和體

正常和疾病樣本中基因表達譜的比較為pcos發(fā)病機制的研究提供了寶貴的資料。實時定量pcr(qrt-pcr)現(xiàn)已被大量、廣泛的用于檢測器官和組織甚至單細胞中的基因表達差異，常被用來去尋找pcos的調(diào)控基因、相關(guān)的信號通路以及非侵入性的生物標志物(adams，etal.，2016；chazenbalk，etal.，2012；deresende，etal.，2012；lemieux，etal.，1999；long，etal.，2014；salilew-wondim，etal.，2015；schmidt，etal.，2014；wissing，etal.，2014)。

在基因表達研究中的各種方法，包括測序法、qrt-pcr和microarray(基因芯片)中，均需要使用內(nèi)參基因。內(nèi)參基因通常在所有樣本和實驗條件下都能穩(wěn)定地表達，而且具有與研究對象相似的屬性，例如rna穩(wěn)定性和大小等，由此表達量可以與研究對象進行比較。內(nèi)參基因在很大程度上能夠影響測序法、qrt-pcr和microarray(基因芯片)的準確性?，F(xiàn)在的多數(shù)研究只是選擇一個內(nèi)參基因，如β-肌動蛋白(actb)、18s核糖體rna、肽基脯氨酸異構(gòu)酶b(peptidylprolylisomeraseb，ppib)或甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)等。越來越多的證據(jù)發(fā)現(xiàn)這些原來被認為是能夠穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因?qū)嶋H上在不同生理或病理條件下的表達是有變化的(meller，etal.，2005；patel，etal.，2002)。采用不恰當?shù)目醇一?housekeepinggene)可能會導致數(shù)據(jù)曲解引起基因表達的低估或高估(dheda，etal.，2005；murphyandbustin，2009；nestorov，etal.，2013)。

因此本領(lǐng)域還需要在患者或正常人的樣品中對多囊卵巢綜合征(pcos)通過基因表達分析進行研究和檢測，特別是尋找在顆粒細胞樣品中進行基因表達分析時，對基因表達進行標準化(normalization)的更可靠的內(nèi)參基因或基因組合。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了對健康人群和多囊卵巢綜合征(pcos)患者的樣本進行有關(guān)的研究，特別是在顆粒細胞樣本進行基因表達分析時作為內(nèi)參基因的基因組合。本發(fā)明也提供了對多囊卵巢綜合征(pcos)患者的樣本進行研究或檢測，特別是在顆粒細胞樣本中通過分析基因表達來進行研究或檢測多囊卵巢綜合征時作為內(nèi)參基因的基因組合。

具體的，本發(fā)明提供了次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶1(hprt1)、核糖體磷酸化蛋白大亞基p0(ribosomalproteinlateralstalksubunitp0，rplp0)和羥甲基膽素合成酶(hydroxymethylbilanesynthase，hmbs)的基因的組合在研究多囊卵巢綜合征中作為內(nèi)參基因的用途，特別是在人的顆粒細胞樣品中研究多囊卵巢綜合征時作為內(nèi)參基因。該研究通常是通過細胞中的基因表達譜分析來進行。

顆粒細胞是卵泡(follicle)中卵母細胞四周一層扁平或立方形細胞。在卵泡開始發(fā)育、卵細胞成長的同時，這些顆粒細胞由扁平變?yōu)榱⒎叫?，并由單層增生成復層?/p>

內(nèi)參基因是用于檢測基因表達水平變化時用于參照物的基因。內(nèi)參基因需要選擇在研究對象(組織和細胞等)中表達相對恒定的基因。內(nèi)參基因可以在例如實時熒光定量pcr、northernblot等方法中用作校正例如上樣量誤差或上樣過程中的操作誤差等差異，保證實驗結(jié)果的準確性。通常采用看家基因(house-keepinggenes)作為內(nèi)參基因。在測試中，可以采用一個或多個基因作為內(nèi)參基因。

次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶1(hypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferase)，即hprt1，是一種人類蛋白，其作用是將5-磷酸核糖-1-焦磷酸鹽中的5-磷酸核苷基團轉(zhuǎn)移至嘌呤上，可催化次黃嘌呤轉(zhuǎn)化為肌苷酸也可催化鳥嘌呤轉(zhuǎn)化為環(huán)磷酸鳥苷。hprt1在核苷酸再利用合成途徑中扮演重要角色。編碼hprt的基因為hprt1(ensemb1：ensg00000165704)。

核糖體磷酸化蛋白大亞基p0(ribosomalproteinlateralstalksubunitp0)，即rplp0，是一種人類蛋白，是組成核糖體60s亞基的一個核糖體蛋白，屬于l10p核糖體蛋白家族。它是一種帶有一個羧基末端的中性磷蛋白，與同樣帶有羧基末端的酸性核糖體磷酸蛋白p1和p2非常相似。p0蛋白可以與2個p1及p2形成的二聚體共同組成一個五聚體。p0蛋白位于細胞質(zhì)內(nèi)。作為一個典型的基因編碼的核糖體蛋白，它有許多個已加工假基因分散在基因組中。編碼rplp0的基因為rplp0(ensemb1：ensg00000089157)。

羥甲基膽素合成酶(hydroxymethylbilanesynthase)，即hmbs，是一種人類蛋白，是羥甲基膽素合成酶超家族中的一員。這個蛋白是膽素從頭到尾合成途徑的第三個酶，可催化四個膽色素原分子合成線性的羥甲基膽素。編碼hmbs的基因為hmbs(ensemb1：ensg00000256269)。

本發(fā)明提供了采用hprt1，rplp0和hmbs這三個基因的組合在用于制備研究或檢測多囊卵巢綜合征的試劑盒或裝置中作為內(nèi)參基因的用途。優(yōu)選的，所述試劑盒或裝置用于在受試者的顆粒細胞樣品中進行研究或檢測多囊卵巢綜合征。對多囊卵巢綜合征的檢測也包括對多囊卵巢綜合征的診斷。在本發(fā)明的其中一個方面，所述試劑盒為用于通過實時熒光定量pcr方法研究或檢測多囊卵巢綜合征的試劑盒。在本發(fā)明的其中又一個方面，所述裝置為用于研究或檢測多囊卵巢綜合征的基因芯片。

本發(fā)明還提供了用于研究或檢測多囊卵巢綜合征的試劑盒或裝置，其中采用hprt1，rplp0和hmbs的組合作為內(nèi)參基因。優(yōu)選的，所述試劑盒或裝置用于在顆粒細胞樣品中研究或檢測多囊卵巢綜合征。在本發(fā)明的其中一個方面，所述試劑盒為用于通過實時熒光定量pcr方法研究或檢測多囊卵巢綜合征的試劑盒。在本發(fā)明的其中又一個方面，所述有時裝置為用于研究或檢測多囊卵巢綜合征的基因芯片。

在本文中，蛋白符號不用斜體，并全部大寫；基因符號使用斜體。例如蛋白核糖體磷酸化蛋白大亞基p0寫為rplp0，編碼該蛋白的基因?qū)憺閞plp0。但有時在本文中基因符號也不使用斜體。例如有時本文中“rplp0”或“rplp0基因”表示編碼蛋白rplp0的基因rplp0。

附圖說明

圖1為測試人員的顆粒細胞樣品的qrt-pcr的循環(huán)閾值(ct)。

圖2為測試人員的顆粒細胞樣品的基因表達穩(wěn)定性的genorm算法測試結(jié)果。

圖3為測試人員的顆粒細胞樣品的內(nèi)參基因組合中基因個數(shù)的genorm算法。

圖4為測試人員的顆粒細胞樣品的基因表達穩(wěn)定性的normfinder算法測試結(jié)果。

圖5為測試人員的顆粒細胞樣品的基因表達穩(wěn)定性的bestkeeper算法測試結(jié)果。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容和有益效果，該實施例僅用于說明本發(fā)明而非對本發(fā)明的限制。

實施例1

研究人員征集

本研究從2015年1月到2016年6月，涉及89個中國籍漢族婦女，年齡為29.12±3.01歲，來自山東大學附屬醫(yī)院。其中包括44個多囊卵巢綜合征(pcos)女性患者和正在接受輸卵管和/或男性不育治療的45個具有正常排卵功能的婦女?；颊呋蚣覍偃刻峁┝藭嫱馔ㄖ獣?。本研究得到了道德委員會的同意。

實施例2

臨床和生化檢測

多囊卵巢綜合征(pcos)根據(jù)2003鹿特丹標準診斷(chang，etal.，2004；fauser，etal.，2004)，包括以下三個臨床特征中的任何兩個：1.少/無排卵；2.臨床和/或生化高雄激素血癥；3.超聲檢查多囊卵巢，以及排除其它高雄性激素血癥相關(guān)的病理生理狀態(tài)，包括先天性腎上腺增生，cushing’s綜合征，和分泌雄激素的腫瘤。

所有相關(guān)被研究者到門診初診時測量人體參數(shù)，如腰圍、臀圍、身高和體重等。身體質(zhì)量指數(shù)(bmi)的計算為重量(公斤)除以高度的平方(m²)，或bmi＝kg/m²。靜脈血標本在經(jīng)過12小時的禁食后于上午8點到10點之間采集。多囊卵巢綜合征婦女的所有血液樣本在卵泡期早期即月經(jīng)周期第3天-5獲得。血清卵泡刺激素(fsh)、黃體生成素(lh)、睪酮(t)、雌激素(e2)、孕酮(p)和催乳素(prl)使用自動生化分析儀(奧林巴斯600生化分析儀，olympusdiagnosticagmbh，co.，愛爾蘭)測量。

下面的表1給出44個pcos患者及45例正常婦女的臨床和生化指標。

表1多囊卵巢綜合征與正常女性測試者人體臨床數(shù)據(jù)

bmi：身體質(zhì)量指數(shù)；e2：雌激素；p：孕酮；prl：催乳素；t：睪酮；fsh：促卵泡激素；lh：促黃體生成素。

p值＜0.05為有統(tǒng)計學意義

本研究中的多囊卵巢綜合征患者及對照組婦女的臨床研究血清中雌激素(e2)、孕酮(p)、催乳素(prl)、卵泡刺激素(fsh)都沒有顯著性差異。正如預期的那樣，pcos組bmi顯著高于對照組7.8％(多囊卵巢綜合征24.20±4.73公斤/平方米，對照22.45±2.99公斤/平方米，95％ci：-1.771to9.411，t＝1.358，df＝87，p＜0.05)。除此之外，與對照組相比，pcos組表現(xiàn)出高水平的睪酮(t)33.9％(多囊卵巢綜合征：36.12±17.6ng/dl，對照：23.87±7.77，95％ci：6.540to17.96，t＝4.264df＝87，p＜0.0001)。盡管fsh水平在兩組沒有區(qū)別，但pcos患者的促黃體生成激素(lh)和lh/fsh明顯升高，分別為36.4％和39.8％(pcoslh：8.10±3.87iu/l，lh：對照5.1±1.84iu/l，95％ci：1.688to4.232，t＝4.624df＝87，p＜0.0001；pcoslh/fsh：1.33±0.74，對照0.80±lh/fsh比值：0.29，95％ci：0.2942to0.7658，t＝4.467df＝87，p＜0.0001)。

實施例3

顆粒細胞分離

從44個多囊卵巢綜合征(pcos)女性患者和對照組的正在接受輸卵管和/或男性不育治療的45個具有正常排卵功能的婦女分離得到顆粒細胞。排除有其它婦科或內(nèi)科疾病史的志愿者。所有的婦女在黃體中期開始注射促性腺激素釋放激素(gnrh)激動劑，通過超聲波掃描和血清雌二醇測定監(jiān)測卵泡大小。當檢測到三個或更多的卵泡平均直徑達到r1.8cm時，超聲引導下取卵手術(shù)36小時前，iu給藥8000-10000人絨毛膜促性腺激素(profasi，serono)。麻醉后，通過17號雙腔穿刺針(k-ops-wood-1235，cook澳大利亞)取卵。在卵母細胞周圍收集顆粒細胞(gcs)，用pasteurpipette抽吸去除卵母細胞后，用dulbecco′smodifiedeaglemedium(dmem)培養(yǎng)基洗滌兩次，以作后續(xù)分析。用裂解液去除紅細胞。

實施例4

rna提取和cdna合成

采用trizolplusrnapurificationkit(lifetechnologies)從分離得到的顆粒細胞中提取總rna。采用nanodrop2000(thermoscientific)檢測rna純度，以a260：a280比值為1.9-2.1為合格標準。總rna用reverse-transcribekit(takara)試劑盒轉(zhuǎn)錄為cdna，然后用無核酸酶水稀釋到20μl。得到的cdna經(jīng)1∶20稀釋后作為qrt-pcr的模板。

實施例5

實時熒光定量pcr(qrt-pcr)

本發(fā)明采用次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶1(hprt1)、核糖體磷酸化蛋白大亞基p0(ribosomalproteinlateralstalksubunitp0，rplp0)和羥甲基膽素合成酶(hydroxymethylbilanesynthase，hmbs)的基因的組合作為在待測者的顆粒細胞中進行多囊卵巢綜合征(pcos)檢測時作為qpcr分析的內(nèi)參基因。為此，對實施例1-4所述的健康對照組和多囊卵巢綜合征(pcos)患者的顆粒細胞中的hprt1，rplp0和hmbs的表達進行測量。

另外，作為比較，對其它以下12個基因在上述測試樣品中的表達也進行了測試：

18s核糖體rna(18srrna)，β-肌動蛋白(actb)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapdh)、泛素c(ubc)，β-2-微球蛋白(b2m)，rna聚合酶ii亞基(polr2a)、酪氨酸3-單加氧酶/色氨酸5-加單氧酶激活蛋白z(ζ-tyrosine3-monooxygenase/tryptophan5-monooxygenaseactivationprotein，ywhaz)，β-葡萄糖醛酸酶(gusb)，輸入蛋白8(importin8，ipo8)、磷酸甘油酸激酶1(phosphoglyceratekinase1，pgk1)，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(tfrc)和核糖體蛋白l13a(rpl13a)。

qrt-pcr采用自動工作站epmotion5075lh(eppendorf，germany)來對pcr試劑進行精確加樣。擴增反應采用quantstudio^tm7flexreal-timepcrsystems(appliedbiosystem，usa)進行，以及使用powerup^tmgreenmastermix(thermofisher)。擴增條件如下：udg活化，50℃，2分鐘；dna聚合酶激活，95℃，2分鐘；40個循環(huán)包括變性，95℃，15秒和退火/延長，55℃，30秒。采用熔解曲線確定擴增反應的特異性。

qpcr中針對本發(fā)明的hprt1、rplp0和hmbs基因使用的引物序列為：

hprt1-fwd：tgacactggcaaaacaatgca(5′→3′)(seqidno.1)

hprt1-rev：ggtccttttcaccagcaagct(5′→3′)(seqidno.2)

rplp0-fwd：agcccagaacactggtctc(5′→3′)(seqidno.3)

rplp0-rev：actcaggatttcaatggtgcc(5′→3′)(seqidno.4)

hmbs-fwd：ggcaatgcggctgcaa(5′→3′)(seqidno.5)

hmbs-rev：gggtacccacgcgaatcac(5′→3′)(seqidno.6)

qpcr中檢測前述待測看家基因使用的引物序列如表2所示：

表2引物序列

采用qrt-pcr對44例pcos患者和45例對照婦女的上述15個候選內(nèi)參基因的表達水平測定其循環(huán)閾值(ct)，結(jié)果如圖1所示，其ct值表現(xiàn)出動態(tài)的表達，范圍從最低的18srna的13.81±0.54到最高的hmbs的28.25±1.13，平均ct值為21.35±1.12。18srna和β肌動蛋白是最豐富的基因，其次是gapdh，而表達最少的基因是hmbs。對這些候選內(nèi)參基因的表達的測量發(fā)現(xiàn)它們的表達具有明顯的個體間差異，標準偏差范圍從18srna的0.54到ubc的1.26?？梢?，還需要選擇更可靠的內(nèi)參基因或內(nèi)參基因組合才能夠在對多囊卵巢綜合征(pcos)，特別是在顆粒細胞樣品中進行比較性基因表達研究作為基因表達標準化的內(nèi)部控制的內(nèi)參基因。

實施例6內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性分析

(1)內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性評估方法

本領(lǐng)域采用的評估待測基因組合作為內(nèi)參基因的使用的穩(wěn)定性的評估方法(chen，etal.，2011；zhang，etal.，2012)采取以下公式進行綜合分析：

n＝幾何平均數(shù)(n1，n2，n3)(1)

即n＝(n1xn2xn3)^1/3

其中n為進行分析的基因組群中各基因的表達的穩(wěn)定性數(shù)值，數(shù)值越小，表示穩(wěn)定性越好；n1為根據(jù)genorm算法得到的排名；n2為根據(jù)normfinder算法得到的排名；n3為根據(jù)bestkeeper算法得到的排名。即先采用genorm算法、normfinder算法和bestkeeper算法等三種算法測試得到各基因表達的穩(wěn)定性，然后計算這三種算法的排名的幾何平均數(shù)。通過公式(1)對genorm算法、normfinder算法和bestkeeper算法的排名進行綜合排名，可以消除只用單一方法可能造成的誤差。

genorm算法(vandesompele，etal.，2002)可選擇一個理想的內(nèi)參基因組合，其中的內(nèi)參基因的表達比率受不同的實驗條件和樣品等外部因素影響最小。穩(wěn)定性m值是基于一個待測內(nèi)參基因和所有其他待測內(nèi)參基因的成對變異分析(pair-wisevariationanalysis)，其值表示該內(nèi)參基因表達的穩(wěn)定性。在算法中，最高m值的基因被逐一淘汰，重復這個選擇和排除過程，最后選擇兩個最穩(wěn)定表達的基因。最低m值的基因被認為是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

normfinder算法(andersen，etal.，2004)的原理和genorm算法類似，產(chǎn)生基因表達穩(wěn)定值，然后根據(jù)穩(wěn)定值排序，以表達穩(wěn)定值最小的基因作為最穩(wěn)定的基因。

bestkeeper算法(pfaffl，etal.，2004)是根據(jù)與bestkeeper指數(shù)相關(guān)的系數(shù)，即被測基因組合的ct值的幾何平均數(shù)，來測定基因表達的穩(wěn)定性。其中測算出變異系數(shù)(cv)和標準偏差(sd)。具有最低cv和sd值的內(nèi)參基因則為表達最穩(wěn)定的基因。具有sd＞1的基因被排除。此算法考慮了bestkeeper指數(shù)和內(nèi)參基因間的pearson相關(guān)系數(shù)、關(guān)聯(lián)系數(shù)(coefficientofdetermination，r²)和p值。

被測多囊卵巢綜合征患者和對照組的臨床特點的數(shù)值變量被表示為平均值±sd。使用spssv.19.0(spss公司，芝加哥，il，美國)進行獨立樣本t檢驗。p值小于0.05被認為有統(tǒng)計學意義。

(2)genorm算法測試結(jié)果

如圖2所示，本發(fā)明測試的3個基因(hprt1、rplp0和hmbs)以及其它12個內(nèi)參基因(18srrna、actb、gapdh、ubc、b2m、polr2a、ywhaz、gusb、ipo8、pgk1、tfrc和rpl13a)，在顆粒細胞中，其表達值m的平均數(shù)都低于genorm算法設定的閾值1.5。rpl13a和rlpp0具有最低的m值0.27，屬于此算法算出的表達最穩(wěn)定的基因，接著是β-actin(0.41)，hprt1(0.45)，ywhaz(0.46)，gapdh(0.49)，pgk1(0.52)，hmbs(0.53)，ubc(0.55)，ipo8(0.56)，b2m(0.58)，polr2a(0.60)，gusb(0.62)，trfc(0.64)，而18srna是表達最不穩(wěn)定的，m值為0.67。

(3)normfinder算法測試結(jié)果

如圖4所示，根據(jù)normfinder算法，在顆粒細胞樣品中，hprt1具有最低的m值0.07，屬于此算法算出的表達最穩(wěn)定的基因，接著是ywhaz(0.09)，actb(0.42)，hmbs(0.11)，pgk1(0.11)，ubc(0.12)，gapdh(0.19)，gusb(0.2)，ipo8(0.21)，polr2a(0.22)，rplp0(0.24)，18srna(0.24)，tfrc(0.25)，rpl13a(0.25)，而b2m是表達最不穩(wěn)定的，m值為0.28。

(4)bestkeeper算法測試結(jié)果

如圖5所示，根據(jù)bestkeeper算法，在顆粒細胞樣品中，gusb的sd(±ct)和cv(％ct)的值分別為0.70和2.67，屬于此算法算出的表達最穩(wěn)定的基因，接著是18srna(sd：0.40，cv：2.87)，hmbs(sd：0.90，cv：3.19)，ipo8(sd：0.88，cv：3.38)，tfrc(sd：0.85，cv：3.45)，polr2a(sd：0.88，cv：3.58)，hprt1(sd：0.88，cv：3.59)，rplp0(sd：0.75，cv：3.77)，rpl13a(sd：0.75，cv：3.97)，ywhaz(sd：0.88，cv：4.12)，pgk1(sd：0.95，cv：4.30)，actb(sd：0.76，cv：4.36)，ubc(sd：1.00，cv：4.72)，b2m(sd：0.93，cv：4.73)，而gapdh(sd：0.94，cv：5.02)是表達最不穩(wěn)定的。

(5)內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性評估

根據(jù)(2)-(4)中根據(jù)genorm算法、normfinder算法和bestkeeper算法得到的待測基因的表達穩(wěn)定性的排名，根據(jù)(1)中的公式，可得到表3：

表3內(nèi)參基因穩(wěn)定性排名

可見，本發(fā)明采用的內(nèi)參基因組合中的三個基因的穩(wěn)定性在所測的15個基因中是最穩(wěn)定的。

實施例7內(nèi)參基因組合中采用基因個數(shù)的優(yōu)劣比較

genorm算法可通過對標準化因子進行成對差異分析(pair-wisevariationanalysis)來評估用于基因表達標準化的內(nèi)參基因的合適的個數(shù)(vandesompele，eta1.，2002)。在成對差異分析中，對于任何具有(vn/n+1)的值低于閾值0.15的n個內(nèi)參基因的組合，多一個(即n+1個)的內(nèi)參基因不會顯著提高歸一化的效果，從而是不需要再多一個內(nèi)參基因的。

根據(jù)實施例5的44例pcos患者和45例對照婦女的上述15個候選內(nèi)參基因的表達水平的循環(huán)閾值(ct)的檢測結(jié)果，通過genorm算法進行分析。

結(jié)果如圖3所示，發(fā)現(xiàn)v2/3值(r²of0.978)超過了閾值0.15，而v3/4值(r²of0.986)正好低于閾值0.15，這表明在顆粒細胞樣本中進行多囊卵巢綜合征(pcos)的基因表達譜研究時用3個看家基因作為內(nèi)參基因是最合適的。

越來越多的證據(jù)證明，原來被認為是在不同樣品中穩(wěn)定表達，差異最小的看家基因，在不同的生理或病理情況下在不同樣本(組織或細胞)中的表達也存在很大差異(meller，etal.，2005；patel，etal.，2002)。本發(fā)明在多囊卵巢綜合征(pcos)女性患者和具有正常排卵功能的婦女中，在通過顆粒細胞中的基因表達譜分析來研究多囊卵巢綜合征時，出乎意料地發(fā)現(xiàn)次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶1(hprt1)、核糖體磷酸化蛋白大亞基p0(ribosomalproteinlateralstalksubunitp0，rplp0)和羥甲基膽素合成酶(hydroxymethylbilanesynthase，hmbs)的基因在綜合評估(chen，etal.，2011；zhang，etal.，2012)中是表達最穩(wěn)定的看家基因。并且，在基因表達譜分析中，采用這三個基因的組合比其它采用一個、兩個或四個看家基因作為內(nèi)參基因更加適合。

由此，本發(fā)明提供了在通過細胞中的基因表達譜分析來研究多囊卵巢綜合征中，特別是在人的顆粒細胞樣品中，采用次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶1(hprt1)、核糖體磷酸化蛋白大亞基p0(ribosomalproteinlateralstalksubunitp0，rplp0)和羥甲基膽素合成酶(hydroxymethylbilanesynthase，hmbs)的基因的組合作為內(nèi)參基因的方法。這幾個內(nèi)參基因的組合能夠在基因表達譜分析，例如在實時熒光定量pcr、northernblot和基因芯片等應用中，用作校正上樣量誤差或上樣過程中的操作誤差等差異，進一步保證實驗結(jié)果的準確性，幫助本領(lǐng)域的技術(shù)人員對多囊卵巢綜合征進行研究或檢測(診斷)。

以下論文的全文引入到本申請，作為本發(fā)明的說明的一部分。

1.auerspergn，wongas，choikc，kangsk，leungpc：ovariansurfaceepithelium：biology，endocrinology，andpathology.endocrrev2001，22(2)：255-288.

2.redjimin，gaudinf，touboulc，emilied，pallardym，biola-vidammenta，fernandezh，prevots，balabaniank，machelonv：identificationofglucocorticoid-inducedleucinezipperasakeyregulatoroftumorcellproliferationinepithelialovariancancer.molcancer2009，8：83.

3.hennessybt，colemanrl，markmanm：ovariancancer.lancet2009，374(9698)：1371-1382.

4.partridgeee，bamesmn：epithelialovariancancer：prevention，diagnosis，andtreatment.cacancerjclin1999，49(5)：297-320.

5.rosenthalan，fraserl，manchandar，badmanp，philpotts，mozerskyj，hadwinr，caffertyfh，benjamine，singhnetal：resultsofannualscreeninginphaseioftheunitedkingdomfamilialovariancancerscreeningstudyhighlighttheneedforstrictadherencetoscreeningschedule.jclinoncol2013，31(1)：49-57.

6.zhaoh，shenj，wangd，guoy，gregorys，medicol，huq，yanl，odunsik，lelesetal：associationsbetweengeneexpressionvariationsandovariancancerriskallelesidentifiedfromgenomewideassociationstudies.plosone2012，7(11)：e47962.

7.shenj，wangd，gregorysr，medicol，huq，yanl，odunsik，lelesb，ambrosonecb，liusetal：evaluationofmicrornaexpressionprofilesandtheirassociationswithriskallelesinlymphoblastoidcelllinesoffamilialovariancancer.carcinogenesis2012，33(3)：604-612.

8.centherv，massartdl，denoordoe，dejongs，vandeginstebm，stemac：eliminationofuninformativevariablesformultivariatecalibration.analyticalchemistry1996，68(21)：3851-3858.

9.richardr.picardrdc：cross-validationofregressionmodels.journaloftheamericanstatisticalassociation1984，79：575-583.

10.caiw，liy，shaox：avariableselectionmethodbasedonuninformativevariableeliminationformultivariatecalibrationofnear-infraredspectra.chemometricsandintelligentlaboratorysystems2008，90(2)：188-194.

11.chakrabortys，dattas，dattas：surrogatevariableanalysisusingpartialleastsquares(sva-pls)ingeneexpressionstudies.bioinformatics2012，28(6)：799-806.

12.xuq-s，liangy-z，duy-p：montecarlocross-validationforselectingamodelandestimatingthepredictionerrorinmultivariatecalibration.journalofchemometrics2004，18(2)：112-120.

13.gourvénecs，femándezpiernaja，massartdl，rutledgedn：anevaluationofthepolishsmoothedregressionandthemontecarlocross-validationforthedeterminationofthecomplexityofaplsmodel.chemometricsandintelligentlaboratorysystems2003，68(1-2)：41-51.

14.irizartyra，hobbsb，collinf，beazer-barclayyd，antonelliskj，scherfu，speedtp：exploration，normalization，andsummariesofhighdensityoligonucleotidearrayprobeleveldata.biostatistics2003，4(2)：249-264.

15.ish：onthestructureofpartialleast-squaresregression.communstat-simulationcomput1988.17：581-607.

16.ish：partialleast-squaresregressionandstatisticalmodel.scandjstat1990，17：97-144.

17.barkerm.rayensw：partialleastsquaresfordiscrimination.journalofchemometrics2010，17(3)：166-173.

18.martinsjpa，teófilorf，ferreirammc：computationalperformanceandcross-validationerrorprecisionoffiveplsalgorithmsusingdesignedandrealdatasets.journalofchemometrics2010，24(6)：320-332.

19.dings：partialleastsquaresbasedgeneexpressionanalysisinrenalfailure.diagnosticpathology2014，9(1)：137-137.

20.gosselinr，rodrigued，duchesnec：abootstrap-vipapproachforselectingwavelengthintervalsinspectralimagingapplications.chemometricsandintelligentlaboratorysystems2010，100(1)：12-21.

21.wangx，e1naqaim：predictionofbothconservedandnanconservedmicrornatargetsinanimals.bioinformatics2008，24(3)：325-332.

22.shannonp，markiela，oziero，baligans，wangjt，ramaged，aminn，schwikowskib，idekert：cytoseape：asoftwareenvironmentforintegratedmodelsofbiomolecularinteractionnetworks.genomeresearch2003，13(11)：2498-2504.

23.hanq-j，wuh-l，caic-b，xul，yur-q：anensembleofmontecarlouninformativevariableeliminationforwavelengthselection.analyticachimicaacta2008，612(2)：121-125.

24.agostinim，knightra：mir-34：frombenchtobedside.oncotarget2014，5(4)：872-881.

25.kumamotok，spillareea，fujitak，horikawai，yamashitat，appellae，nagashimam，takenoshitas，yokotaj，harriscc：nutlin-3aactivatesp53tobothdown-regulateinhibitorofgrowth2andup-regulatemir-34a，mir-34b，andmir-34cexpression，andinducesenescence.cancerresearch2008，68(9)：3193-3203.

26.asmarf，hotherc，kulosmang，treppendahlmb，nielsenhm，ralfkiaeru，pedersena，mollermb，ralfkiaere，denullybrownpetal：diffuselargeb-celllymphomawithcombinedtp53mutationandmir34amethylation：another″doublehit″lymphomawithverypooroutcame？oncotarget2014，5(7)：1912-1925.

27.niskakoskia，kaurs，staffs，renkonen-sinisalol，lassush，jarvinenhj，mecklinjp，butzowr，peltomakip：epigeneticanalysisofsporadicandlynch-associatedovariancancersrevealshistology-specificpatternsofdnamethylation.epigenetics：officialjournalofthednamethylationsociety2014，9(12)：1577-1587.

28.shrestharl，tamuran，friesa，levinn，clarkj，draviamvm：tao1kinasemaintainschromosomalstabilitybyfacilitatingpropercongressionofchromosomes.openbiol2014，4(6)：130108.

29.ramahm，earnests，zhangk，zhaoy，cobbmh：taokinasesmediateactivationofp38inresponsetodnadamage.theembojournal2007，26(8)：2005-2014.

30.draviamvm，stegmeierf，nalepag，sowame，chenj，lianga，hannongj，sorgerpk，harperjw，elledgesj：afunctionalgenomicscreenidentifiesarolefortao1kinaseinspindle-checkpointsignalling.naturecellbiology2007，9(5)：556-564.

31.hubnernc，wanglh，kaulichm，descombesp，poseri，niggea：re-examinationofsirnaspecificityquestionsroleofpichandtao1inthespindlecheckpointandidentifiesmad2asasensitivetargetforsmallrnas.chromosoma2010，119(2)：149-165.

32.westhorpefg，diezma，gurdenmd，tighea，taylorss：re-evaluatingtheroleoftao1inthespindlecheckpoint.chromosoma2010，119(4)：371-379.

33.guowj，zhangym，zhangl，huangb，taoff，chenw，guozj，xuq，suny：novelmonofunctionalplatinum(ii)complexmono-ptinducesapoptosis-independentautophagiccelldeathinhumanovariancarcinomacells，distinctfromcisplatin.autophagy2013，9(7)：996-1008.

34.smithdm，patels，raffoulf，hallere，millsgb，nanjundanm：arsenictrioxideinducesabeclin-1-independentautophagicpathwayviamodulationofsnon/skilexpressioninovariancarcinomacells.celldeathanddifierentiation2010，17(12)：1867-1881.

35.caoj，caij，huangd，hanq，yangq，lit，dingh，wangz：mir-335representsaninvasionsuppressorgeneinovariancancerbytargetingbcl-w.oncologyreports2013，30(2)：701-706.

36.caoj，caij，huangd，hanq，cheny，yangq，yangc，kuangy，lid，wangz：mir-335representsanindependentprognosticmarkerinepithelialovariancancer.americanjournalofclinicalpathology2014，141(3)：437-442.

37.taylorsa，marrinanch，liug，nalel，bishopwr，kirschmeierp，lium，longbj：combiningthefarnesyltransferaseinhibitorlonafarnibwithpaclitaxelresultsinenhancedgrowthinhibitoryeffectsonhumanovariancancermodelsinvitroandinvivo.gynecologiconcology2008，109(1)：97-106.

38.yangy，liul，caij，wuj，guanh，zhux，yuanj，chens，lim：targetingsmad2andsmad3bymir-136suppressesmetastasis-associatedtraitsoflungadenocarcinomacells.oncologyresearch2013，21(6)：345-352.

39.shens，yueh，liy，qinj，lik，liuy，wangj：upregulationofmir-136inhumannon-smallcelllungcancercellspromoteserk1/2activationbytargetingppp2r2a.tumourbiology：thejournaloftheinternationalsocietyforoncodevelopmentalbiologyandmedicine2014，35(1)：631-640.

40.leedy，jeyapalanz，fangl，yangj，zhangy，yeeay，lim，duww，shatsevat，yangbb：expressionofversican3′-untranslatedregionmodulatesendogenousmicrornafunctions.plosone2010，5(10)：e13599.

41.qiuj，yel，dingj，fengw，zhangy，lvt，wangj，huak：effectsofoestrogenonlongnoncodingrnaexpressioninoestrogenreceptoralpha-positiveovariancancercells.thejournalofsteroidbiochemistryandmolecularbiology2014，141：60-70.

42.januchowskir，zawieruchap，rucinskim，nowickim，zabelm：extracellularmatrixproteinsexpressionprofilinginchemoresistantvariantsofthea2780ovariancancercellline.biomedresearchinternational2014.2014：365867.

43.yewkh，crowj，hirstj，pessettoz，godwinak：epimorphin-inducedmetsensitizesovariancancercellstoplatinum.plosone2013，8(9)：e72637.

上面是對本發(fā)明進行的說明，不能將其看成是對本發(fā)明進行的限制。除非另外指出，本發(fā)明的實踐將使用有機化學、聚合物化學、生物技術(shù)等的常規(guī)技術(shù)，顯然除在上述說明和實施例中所特別描述之外，還可以別的方式實現(xiàn)本發(fā)明。其它在本發(fā)明范圍內(nèi)的方面與改進將對本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見。根據(jù)本發(fā)明的教導，許多改變和變化是可行的，因此其在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

如無特別表示，本文中出現(xiàn)的溫度的單位“度”是指攝氏度，即℃。