本發(fā)明涉及在細(xì)胞微囊泡表面修飾配體的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

細(xì)胞微囊泡是人、動(dòng)物、植物或微生物的細(xì)胞自動(dòng)分泌釋放的或破碎后獲得的，具有脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的，直徑從幾十納米到幾微米不等的囊泡。包括細(xì)胞外囊泡(extracellularvesicle)、微囊泡(microvesicle)、外泌體(exosome)、調(diào)亡小體(apoptoticbody)、脫落囊泡(sheddingvesicle)、微粒(microparticle)。細(xì)胞微囊泡攜帶有生物活性的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、信使rna(mrna)、微小rna(mirna)、非編碼rna(ncrna)以及dna片段。并且能夠?qū)⑦@些活性分子傳遞給受體細(xì)胞，調(diào)節(jié)靶細(xì)胞、組織和器官的生物功能。某些類(lèi)型的細(xì)胞，如間充質(zhì)干細(xì)胞，產(chǎn)生的細(xì)胞微囊泡含有多種能夠保護(hù)受損組織，促進(jìn)生長(zhǎng)和修復(fù)，以及調(diào)節(jié)免疫功能的活性生物分子。注射入體內(nèi)之后可以減少損傷、抑制炎癥、促進(jìn)組織再生和功能恢復(fù)。同時(shí)，利用電穿孔、化學(xué)穿孔、超聲等方法還能夠?qū)⑷斯ず铣傻男「蓴_rna(sirna)、mirna、化療藥物裝載入細(xì)胞微囊泡，使其成為一種藥物載體。因此細(xì)胞微囊泡是一種新型的生物治療方法和遞送載體?，F(xiàn)已在動(dòng)物模型上驗(yàn)證細(xì)胞微囊泡能夠促進(jìn)血管生成、降低炎癥反應(yīng)、促進(jìn)神經(jīng)再生、減少心肌和大腦缺血損傷、保護(hù)急性腎損傷和肺損傷、治療糖尿病和神經(jīng)退行性疾病。然而，靜脈注射的細(xì)胞微囊泡很快被肝、脾等網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(res)所吞噬和清除，較少到達(dá)靶器官。因此，通過(guò)表面修飾配體的方法增強(qiáng)其靶向性、體內(nèi)穩(wěn)定性和組織穿透性，以及降低血漿清除率具有重要意義。

目前的方法包括工程化供體細(xì)胞和膜插入兩大類(lèi)方法，都具有較多步驟，操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)。其中，工程化供體細(xì)胞的方法需要專(zhuān)門(mén)的生物學(xué)技術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，無(wú)法修飾任意類(lèi)型的配體，也不能對(duì)體液來(lái)源的細(xì)胞微囊泡進(jìn)行修飾。膜插入的方法可能對(duì)細(xì)胞微囊泡原本的膜結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)產(chǎn)生較大影響，插入效率較難控制，游離的配體較難去除。因此，相關(guān)方面的研究和應(yīng)用進(jìn)展受到很大限制。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種在細(xì)胞微囊泡表面修飾配體的快速、高效的方法。本發(fā)明在細(xì)胞微囊泡表面修飾各種配體，有利于對(duì)其治療作用進(jìn)行進(jìn)一步研究，有利于加速臨床應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種在細(xì)胞微囊泡表面修飾配體的方法，包括如下步驟：

(a)在細(xì)胞微囊泡表面連接二苯基環(huán)辛炔(dibenzocyclooctyl，dbco)；

(b)去除游離的二苯基環(huán)辛炔；

(c)在細(xì)胞微囊泡表面的二苯基環(huán)辛炔上連接疊氮基修飾的配體；

(d)對(duì)修飾好的細(xì)胞微囊泡進(jìn)行提純。

其中，所述細(xì)胞微囊泡為人、動(dòng)物、植物或微生物的細(xì)胞所分泌或破碎后獲得的，具有脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的，直徑從幾十納米到幾微米不等的囊泡。

其中，所述細(xì)胞微囊泡為細(xì)胞外囊泡(extracellularvesicle)、微囊泡(microvesicle)、外泌體(exosome)、調(diào)亡小體(apoptoticbody)、脫落囊泡(sheddingvesicle)或微粒(microparticle)。

步驟(a)中，利用雙功能化分子將二苯基環(huán)辛炔共價(jià)偶聯(lián)到細(xì)胞微囊泡表面天然存在的氨基末端上；其中，所述的雙功能化分子為同時(shí)帶有二苯基環(huán)辛炔和n-羥基琥珀酰亞胺(n-hydroxysuccinimide，nhs)的分子；優(yōu)選為dbco-sulfo-nhs(dibenzocyclooctyne-sulfo-n-hydroxysuccinimidylester，分子式c25h21n2nao8s，分子量532.50)、或dbco-nhs(dibenzocyclooctyne-n-hydroxysuccinimidylester，分子式c23h18n2o5，分子量402.40)、或dbco-peg4-nhs(dibenzocyclooctyne-peg4-n-hydroxysuccinimidylester，分子式c34h39n3o10，分子量649.69)。

步驟(a)中，pbs(ph7.4)緩沖液重懸細(xì)胞微囊泡，與雙功能化分子混合，按照每10¹²細(xì)胞微囊泡數(shù)量加入1nmol～20nmol(優(yōu)選3nmol)雙功能化分子的比例混合，在室溫下反應(yīng)2～12小時(shí)(優(yōu)選4小時(shí))。

步驟(b)中，通過(guò)超濾去除沒(méi)有偶聯(lián)在細(xì)胞微囊泡上的雙功能化分子。優(yōu)選，將步驟(1)得到的產(chǎn)物用100～300kd(最優(yōu)選100kd)超濾管在8000～12000g(最優(yōu)選10000g)離心5～10分鐘(最優(yōu)選10分鐘)，棄濾液，重復(fù)3～6次(最優(yōu)選3次)。

步驟(c)中，所述配體為肽、蛋白質(zhì)(包括抗體)、核酸或高分子化合物。

步驟(c)中，利用疊氮化的配體與細(xì)胞微囊泡表面的二苯基環(huán)辛炔進(jìn)行無(wú)銅點(diǎn)擊化學(xué)(copper-freeclickchemistry)反應(yīng)，從而將配體共價(jià)偶聯(lián)在細(xì)胞微囊泡表面。

步驟(c)中，步驟(b)的產(chǎn)物與疊氮化的配體在pbs(ph7.4)緩沖液中混勻，如果有其他要修飾的配體可在上述摩爾比范圍內(nèi)同時(shí)加入，在4℃下反應(yīng)4～24小時(shí)(優(yōu)選12小時(shí))，其中，每10¹²囊泡微粒數(shù)加入0.1nmol～5nmol(優(yōu)選0.3nmol)疊氮化的配體。

其中，所述的疊氮化的配體優(yōu)選是將azide-nhs(分子式c6h6n4o4，分子量198.14)與配體按照摩爾比10∶1混合，在室溫下反應(yīng)2～12小時(shí)(優(yōu)選4小時(shí))，獲得疊氮化的配體。azide-nhs可以用azide-sulfo-nhs(分子式c8h9n4nao7s，分子量328.23)或azide-peg4-nhs(分子式c15h24n4o8，分子量388.37)替代。

步驟(d)中，使用超速離心的方法對(duì)修飾好的細(xì)胞微囊泡進(jìn)行提純。優(yōu)選將步驟(c)得到的產(chǎn)物用pbs(ph7.4)緩沖液稀釋至25ml，100000～200000g(最優(yōu)選150000g)離心70～120分鐘(最優(yōu)選90分鐘)，棄去全部上清液。用0.5mlpbs(ph7.4)重懸沉淀，得到最終修飾好的細(xì)胞微囊泡，凍存于-80℃。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果體現(xiàn)在：

1.節(jié)省時(shí)間，全部過(guò)程可在24h內(nèi)完成；

2.過(guò)程簡(jiǎn)便，易操作，不需要專(zhuān)門(mén)的生物學(xué)技術(shù)；

3.反應(yīng)效率高，節(jié)約配體用量，從而降低成本；

4.全部過(guò)程在ph7.4pbs溶液的溫和環(huán)境下完成，不需要添加催化劑，有利于最大限度保持細(xì)胞微囊泡的生理活性；

5.對(duì)配體的類(lèi)型較少限制，各種類(lèi)型的肽、蛋白質(zhì)、糖、脂質(zhì)、核酸、高分子化合物都可以共價(jià)偶聯(lián)到細(xì)胞微囊泡的表面。

利用本發(fā)明在細(xì)胞微囊泡表面修飾配體的方法，可以在細(xì)胞微囊泡表面修飾各種靶向性分子。使細(xì)胞微囊泡獲得靶向特定的器官、組織或細(xì)胞的能力，從而增強(qiáng)其治療效果。

利用本發(fā)明在細(xì)胞微囊泡表面修飾配體的方法，可以在細(xì)胞微囊泡表面修飾各種功能性分子。能提高細(xì)胞微囊泡的體內(nèi)穩(wěn)定性，增加組織穿透性，增強(qiáng)跨血腦屏障的能力，減少被吞噬細(xì)胞攝取，以及延長(zhǎng)血漿清除時(shí)間，從而增強(qiáng)其治療效果。

利用本發(fā)明所得修飾配體的細(xì)胞微囊泡可用于靜脈注射或局部給藥，治療腦缺血、腦外傷、心肌缺血、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、惡性腫瘤、關(guān)節(jié)炎、肝肺腎損傷或纖維化，也可用于美容或延緩衰老。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明在細(xì)胞微囊泡表面修飾配體方法的工藝流程圖；

圖2是修飾了配體的細(xì)胞微囊泡的原子力顯微鏡形態(tài)鑒定圖；

圖3是修飾了配體的細(xì)胞微囊泡的直徑分布測(cè)量結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

以下實(shí)施例所用試劑和材料均可以通過(guò)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)渠道獲得。

實(shí)施例1，外泌體表面修飾rgd多肽。

如圖1所示。

步驟(a)，將1×10¹²外泌體重懸于1mlph7.4pbs中，加入1.5ml離心管中。再加入3μmdbco-sulfo-nhs。外泌體與dbco-sulfo-nhs的微粒數(shù)/摩爾數(shù)比為10¹²：3nmol，將離心管固定在旋轉(zhuǎn)混勻儀上，室溫下反應(yīng)4小時(shí)。

步驟(b)，將步驟(a)所得溶液加入兩個(gè)超濾管(孔徑100kd，容量0.5ml)上層，10000g離心10分鐘。棄掉下層濾液，在上層補(bǔ)充ph7.4pbs至體積達(dá)到0.5ml。按照同樣步驟再重復(fù)超濾兩次，得到1ml修飾了dbco的外泌體。

步驟(c)，將步驟(b)所得溶液置于1.5ml離心管中。加入0.3μm疊氮基修飾的rgd多肽(所述的疊氮基修飾的多肽分子是將azide-nhs與rgd多肽分子反應(yīng)獲得)。步驟(b)的產(chǎn)物中囊泡微粒數(shù)與疊氮化rgd的摩爾數(shù)比為10¹²：0.3nmol，同時(shí)加入0.3μmcy5.5-azide用于熒光標(biāo)記外泌體。將離心管固定在旋轉(zhuǎn)混勻儀上，置于4℃冰箱中，反應(yīng)12小時(shí)。

步驟(d)，將步驟(c)所得溶液用ph7.4pbs稀釋至25ml，移入超速離心管中。150000g離心90分鐘，棄去全部上清液。用0.5mlph7.4pbs重懸沉淀，得到最終修飾好的外泌體。取其中小部分用于分析和鑒定，其余凍存于-80℃冰箱。經(jīng)高效液相色譜分析，參與反應(yīng)的配體有85％～90％成功偶聯(lián)在外泌體上。

鑒定方法：使用原子力顯微鏡觀察所得外泌體的形態(tài)(如圖2)；使用納米粒子追蹤分析(nanoparticletrackinganalysis，nta)設(shè)備測(cè)量所得外泌體的直徑分布(如圖3)。

實(shí)施例2，微囊泡表面修飾egfr抗體。

步驟(a)，將1×10¹³微囊泡重懸于10mlph7.4pbs中，加入15ml離心管中。再加入8μmdbco-nhs。微囊泡與dbco-nhs的微粒數(shù)/摩爾數(shù)比為10¹²：8nmol，將離心管固定在旋轉(zhuǎn)混勻儀上，室溫下反應(yīng)6小時(shí)。

步驟(b)，將步驟(a)所得溶液加入兩個(gè)超濾管(孔徑300kd，容量5ml)上層，12000g離心10分鐘。棄掉下層濾液，在上層補(bǔ)充ph7.4pbs至體積達(dá)到5ml。按照同樣步驟再重復(fù)超濾兩次，得到10ml修飾了dbco的微囊泡。

步驟(c)，將步驟(b)所得溶液置于15ml離心管中。加入2μm疊氮基修飾的egfr抗體(所述的疊氮基修飾的抗體分子是將azide-sulfo-nhs與egfr抗體分子反應(yīng)獲得)。步驟(b)的產(chǎn)物中囊泡微粒數(shù)與疊氮化egfr抗體的摩爾數(shù)比為10¹²：2nmol，同時(shí)加入2μmfitc-azide用于熒光標(biāo)記外泌體。將離心管固定在旋轉(zhuǎn)混勻儀上，置于4℃冰箱中，反應(yīng)24小時(shí)。

步驟(d)，將步驟(c)所得溶液用ph7.4pbs稀釋至25ml，移入超速離心管中。200000g離心120分鐘，棄去全部上清液。用10mlph7.4pbs重懸沉淀，得到最終修飾好的外泌體。取其中小部分用于分析和鑒定，其余凍存于-80℃冰箱。經(jīng)高效液相色譜分析，參與反應(yīng)的egfr抗體有80％～85％成功偶聯(lián)在微囊泡上。

鑒定方法：使用原子力顯微鏡觀察所得微囊泡的形態(tài)；使用納米粒子追蹤分析設(shè)備測(cè)量所得微囊泡的直徑分布。

實(shí)施例3，細(xì)胞外囊泡表面修飾sirna。

步驟(a)，將1×10¹⁴細(xì)胞外囊泡重懸于1mlph7.4pbs中，加入1ml離心管中。再加入1mmdbco-peg4-nhs。細(xì)胞外囊泡與dbco-peg4-nhs的微粒數(shù)/摩爾數(shù)比為10¹²：10nmol，將離心管固定在旋轉(zhuǎn)混勻儀上，室溫下反應(yīng)12小時(shí)。

步驟(b)，將步驟(a)所得溶液加入兩個(gè)超濾管(孔徑100kd，容量0.5ml)上層，12000g離心8分鐘。棄掉下層濾液，在上層補(bǔ)充ph7.4pbs至體積達(dá)到0.5ml。按照同樣步驟再重復(fù)超濾三次，得到1ml修飾了dbco的細(xì)胞外囊泡。

步驟(c)，將步驟(b)所得溶液置于1ml離心管中。加入0.5mm疊氮基修飾的sirna(所述的疊氮基修飾的sirna是將azide-peg4-nhs與氨基sirna分子反應(yīng)獲得，氨基sirna購(gòu)自上海吉瑪生物技術(shù)公司)。步驟(b)的產(chǎn)物中囊泡微粒數(shù)與疊氮化sirna的摩爾數(shù)比為10¹²：5nmol，同時(shí)加入0.5mmrhodamine-azide用于熒光標(biāo)記外泌體。將離心管固定在旋轉(zhuǎn)混勻儀上，置于4℃冰箱中，反應(yīng)12小時(shí)。

步驟(d)，將步驟(c)所得溶液用ph7.4pbs稀釋至25ml，移入超速離心管中。100000g離心70分鐘，棄去全部上清液。用1mlph7.4pbs重懸沉淀，得到最終修飾好的外泌體。取其中小部分用于分析和鑒定，其余凍存于-80℃冰箱。經(jīng)高效液相色譜分析，參與反應(yīng)的sirna有80％～85％成功偶聯(lián)在細(xì)胞外囊泡上。

鑒定方法：使用電子顯微鏡觀察所得細(xì)胞外囊泡的形態(tài)；使用納米粒子追蹤分析設(shè)備測(cè)量所得細(xì)胞外囊泡的直徑分布。

實(shí)施例4，微粒表面修飾peg2000。

步驟(a)，將1×10¹³微粒重懸于4mlph7.4pbs中，加入8ml離心管中。再加入5μmdbco-sulfo-nhs。微粒與dbco-sulfo-nhs的微粒數(shù)/摩爾數(shù)比為10¹²：2nmol，將離心管固定在旋轉(zhuǎn)混勻儀上，室溫下反應(yīng)8小時(shí)。

步驟(b)，將步驟(a)所得溶液加入8個(gè)超濾管(孔徑300kd，容量0.5ml)上層，9000g離心8分鐘。棄掉下層濾液，在上層補(bǔ)充ph7.4pbs至體積達(dá)到0.5ml。按照同樣步驟再重復(fù)超濾三次，得到4ml修飾了dbco的微粒。

步驟(c)，將步驟(b)所得溶液置于8ml離心管中。加入1μm疊氮基修飾的peg2000(所述的疊氮基修飾的peg2000是將azide-sulfo-nhs與nh2-peg2000分子反應(yīng)獲得，nh2-peg2000購(gòu)自北京鍵凱科技有限公司)。步驟(b)的產(chǎn)物中囊泡微粒數(shù)與疊氮化peg2000的摩爾數(shù)比為10¹²：0.4nmol，同時(shí)加入1μmcy3-azide用于熒光標(biāo)記外泌體。將離心管固定在旋轉(zhuǎn)混勻儀上，置于4℃冰箱中，反應(yīng)18小時(shí)。

步驟(d)，將步驟(c)所得溶液用ph7.4pbs稀釋至25ml，移入超速離心管中。100000g離心90分鐘，棄去全部上清液。用4mlph7.4pbs重懸沉淀，得到最終修飾好的外泌體。取其中小部分用于分析和鑒定，其余凍存于-80℃冰箱。經(jīng)高效液相色譜分析，參與反應(yīng)的peg2000有80％～85％成功偶聯(lián)在微粒上。

鑒定方法：使用電子顯微鏡觀察所得微粒的形態(tài)；使用納米粒子追蹤分析設(shè)備測(cè)量所得微粒的直徑分布。