一種多肽修飾的金納米簇及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于功能性生物納米材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多肽修飾的金納米簇及其制備方法，在水熱法制備過程中采用KRKC和GSH兩種多肽作為穩(wěn)定劑修飾，通過設(shè)計多肽序列保證金屬團簇的穩(wěn)定性制備對細(xì)胞核仁具有靶向標(biāo)記作用的紅色熒光金納米簇，其粒徑為1.5?2.8nm范圍內(nèi)，平均顆粒直徑為1.9nm，金納米簇在400nm附近有明顯的吸收峰，當(dāng)用400nm的激發(fā)光對金納米簇照射時，在500?750nm區(qū)間有較強的熒光發(fā)射，發(fā)射峰在586nm附近，金納米簇的熒光量子產(chǎn)率為7％。該方法簡單，操作性強，成本低，材料表面用多肽穩(wěn)定，生物親和性好，采用多肽多為穩(wěn)定劑毒性低，穩(wěn)定性好，發(fā)射波長，利于得到更好的核仁成像效果。
【專利說明】
一種多肽修飾的金納米簇及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
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[0001]本發(fā)明屬于功能性生物納米材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多肽修飾的金納米簇及其制備方法，采用KRKC和GSH兩種多肽作為穩(wěn)定劑修飾，通過設(shè)計多肽序列保證金屬團簇的穩(wěn)定性制備對細(xì)胞核仁具有靶向標(biāo)記作用的紅色熒光金納米簇。
【背景技術(shù)】
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[0002]細(xì)胞核仁是細(xì)胞核內(nèi)的重要亞核結(jié)構(gòu)，對于細(xì)胞的生長、增殖都有重要作用。除此之外，核仁還是細(xì)胞核內(nèi)rRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯以及核糖體組裝的場所，因此又被稱為“核糖體工廠”，甚至有文獻報道核仁也是某些病毒的靶向攻擊位置。細(xì)胞核仁并不是一直存在的，它形成于細(xì)胞分裂間期，由熔融態(tài)的核仁物質(zhì)聚集形成，目前對于細(xì)胞核仁的生物學(xué)作用的研究尚不成熟。研究核仁及其相關(guān)過程時，非常重要的步驟是對核仁進行標(biāo)記將核仁可視化。目前，對于核仁的可視化方法，得到普遍認(rèn)同的有①銀染法一通過AgNO3與細(xì)胞核仁處的酸性蛋白反應(yīng)，實現(xiàn)銀的還原，生成黑色銀顆粒，進而對核仁位置進行標(biāo)記，缺點是在光學(xué)顯微鏡下呈黑色且無熒光信號，不利于進一步的研究使用；②商業(yè)化的STYO染料染色法一在480nm激發(fā)下有500nm的熒光發(fā)射，并且染料分子與RNA結(jié)合后熒光強度會存在數(shù)量級的變化，但染料分子的結(jié)構(gòu)沒有公開報道。
[0003]近年來，隨著研究的不斷深入，對核仁特異性染色的其他材料也相應(yīng)進入人們的視線，如以稀土元素銪為配位中心構(gòu)成的稀土配合物；以吡啶，吡咯及苯等芳環(huán)結(jié)構(gòu)構(gòu)成的超低分子量的熒光探針；以及由過渡金屬元素鋨、銥組成的異核雙配位化合物均可對細(xì)胞核仁進行特異性的標(biāo)記。這類材料的共同特征就是表面含有大量的芳環(huán)結(jié)構(gòu)，可能是對核仁進行靶向識別的作用基團。越來越多的熒光納米材料應(yīng)用于熒光標(biāo)記領(lǐng)域，與傳統(tǒng)的化學(xué)染料相比，熒光納米材料的抗光漂白性更好，并且通過對納米材料表面進行修飾，還會使得材料的生物親和性大大提高。通過調(diào)節(jié)納米材料的尺寸可以得到發(fā)射波長較長的材料，這對降低細(xì)胞成像的背景干擾，信噪比及細(xì)胞自熒光都是有利的。
[0004]金屬團簇納米材料具有超小的顆粒尺寸具有優(yōu)良的熒光性，將其負(fù)載在對細(xì)胞核內(nèi)組分具有靶向材料的載體上可以進入細(xì)胞核的雙層膜結(jié)構(gòu)，同時熒光標(biāo)記細(xì)胞核仁結(jié)構(gòu)，多肽序列具有比抗體更優(yōu)良的靶向特異性，設(shè)計合理有效的多肽序列，合成可對細(xì)胞核仁靶向標(biāo)記的納米金簇為研究細(xì)胞核仁及其相關(guān)過程提供更好的幫助。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0005]本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，尋求一種多肽修飾的標(biāo)記細(xì)胞核仁的金納米簇及其制備方法用，降低現(xiàn)有細(xì)胞核仁標(biāo)記材料細(xì)胞成像的背景干擾以及解決現(xiàn)有細(xì)胞核仁標(biāo)記材料制作成本高、毒性大和制作工藝復(fù)雜的問題。
[0006]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明涉及的多肽修飾的金納米簇的制備方法，具體工藝步驟如下:
[0007](I)用超純水分別配置 20mmol/L 的 HAuCl4、20mmol/L 的 KRKC 和 20mmol/L 的 GSH 溶液，將玻璃瓶用王水浸泡處理，清洗干凈后烘干備用；
[0008](2)向處理好的玻璃瓶內(nèi)先加入450yL的KRKC溶液及150yL的GSH溶液混合均勾，再向其中加入HAuCl4溶液300yL，可觀察到反應(yīng)體系顏色由無色變?yōu)榈S色，最后向玻璃瓶中加入超純水使溶液中Au+的終濃度為2mmo 1/L ；
[0009](3)將加入反應(yīng)物的玻璃瓶放置于恒溫水浴鍋內(nèi)，70°080°(:恒溫反應(yīng)1211;
[0010](4)反應(yīng)結(jié)束后，將樣品轉(zhuǎn)移到離心管中離心除去大分子顆粒物質(zhì)，將離心上清液中剩余的未反應(yīng)原料及小分子物質(zhì)除去得到金納米簇；
[0011]步驟(4)中離心上清液采用截留分子量為10000道爾頓的超濾膜過濾，或采用透析或外加甲醇、乙醇和丙酮中的任一種離心沉降處理得到金納米簇;所述KRKC的中文全稱為賴氨酸一精氨酸一賴氨酸一半胱氨酸，所述GSH的中文全稱為谷氨酸一半胱氨酸一甘氨酸。
[0012]上述方法制備的多肽修飾的金納米簇，其粒徑為1.5-2.8nm范圍內(nèi)，平均顆粒直徑為1.9nm，金納米簇在400nm附近有明顯的吸收峰，當(dāng)用400nm的激發(fā)光對金納米簇照射時，在500-750nm區(qū)間有較強的熒光發(fā)射，發(fā)射峰在586nm附近，金納米簇的熒光量子產(chǎn)率為7%。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明涉及的多肽修飾的金納米簇的合成方法簡單，操作性強，成本低，材料表面用多肽穩(wěn)定，生物親和性好，采用多肽多為穩(wěn)定劑毒性低，穩(wěn)定性好，發(fā)射波長，利于得到更好的核仁成像效果，此外，合成的納米材料對細(xì)胞核仁有特異性標(biāo)記，相對于比較常規(guī)的富芳環(huán)的熒光探針，這是一種全新的材料，為核仁的研究提供了新的思路與方法。
【附圖說明】
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[0014]圖1為本發(fā)明涉及的KRKC和GSH多肽的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0015]圖2為本發(fā)明涉及的多肽修飾的金納米簇的透射電子顯微鏡表征圖。
[0016]圖3為本發(fā)明涉及的多肽修飾的金納米簇的紫外可見吸收光譜圖。
[0017]圖4為本發(fā)明涉及的多肽修飾的金納米簇的熒光發(fā)射光譜。
[0018]圖5為本發(fā)明涉及的多肽修飾的金納米簇(A)和商品化細(xì)胞核仁探針SYT0RNA-Select(B)分別與細(xì)胞共育5小時的熒光成像效果圖。
[0019]圖6為本發(fā)明涉及的多肽修飾的金納米簇與商品化SYTORNA-Select分別與細(xì)胞共育之后在激光連續(xù)照射的條件下不同采集時間點成像效果對比圖。
【具體實施方式】
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[0020]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步說明:
[0021]實施例1:
[0022]本實施例涉及的多肽修飾的金納米簇的制備方法，具體工藝步驟如下:
[0023](I)用超純水分別配置 20mmol/L 的 HAuCl4、20mmol/L 的 KRKC 和 20mmol/L 的 GSH 溶液，將玻璃瓶用王水浸泡處理，清洗干凈后烘干備用；
[0024](2)向處理好的玻璃瓶內(nèi)先加入450yL的KRKC溶液及150yL的GSH溶液混合均勻，再向其中加入HAuCl4溶液300yL，可觀察到反應(yīng)體系顏色由無色變?yōu)榈S色，最后向玻璃瓶中加入超純水使溶液中Au+的終濃度為2mmo 1/L ；
[0025](3)將加入反應(yīng)物的玻璃瓶放置于恒溫水浴鍋內(nèi)，70°(:-80°(:恒溫反應(yīng)1211;
[0026](4)反應(yīng)結(jié)束后，將樣品轉(zhuǎn)移到離心管中離心除去大分子顆粒物質(zhì)，將離心上清液采用截留分子量為10000道爾頓的超濾膜過濾去除剩余的未反應(yīng)原料及小分子物質(zhì)得到金納米簇；所述KRKC的中文全稱為賴氨酸(Lysine，K)—精氨酸(Arginine，R)—賴氨酸(Lysine,K)—半胱氨酸(Cysteine，C)，所述GSH的中文全稱為谷氨酸(Glutamic acid，E)—半胱氨酸(Cysteine，C)—甘氨酸(Glycine，G)，購買于上海強耀生物科技有限公司。
[0027]由圖1-4可知，本實施例制備得到的金納米簇顆粒分散均勻，而且粒徑分布范圍相對較窄，其粒徑為1.5-2.8nm范圍內(nèi)，平均顆粒直徑為1.9nm，金納米簇在400nm附近有明顯的吸收峰，當(dāng)用400nm的激發(fā)光對金納米簇照射時，在500_750nm區(qū)間有較強的熒光發(fā)射，發(fā)射峰在586nm附近，金納米簇的熒光量子產(chǎn)率為7%。
[0028]應(yīng)用例1:
[0029]將實施例1制備的金納米簇配置成400yg/ml的溶液與人纖維肉瘤細(xì)胞(HT1080)在37°C，C02含量5%的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)共同孵育5小時得到細(xì)胞爬片;將上述細(xì)胞爬片用4%多聚甲醛固定后，用共聚焦激光掃描系統(tǒng)成像，成像條件100X油鏡在405nm的激光激發(fā)，信號收集通道552-617nm 及662-737nm。
[0030]對比例1:
[0031]將商品化細(xì)胞核仁探針(SYTO RNA-Select，400yg/ml)與人纖維肉瘤細(xì)胞(HT1080)在37 °C，CO2含量5%的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)共同孵育5小時得到細(xì)胞爬片;將上述細(xì)胞爬片用4%多聚甲醛固定后，用共聚焦激光掃描系統(tǒng)成像，成像條件100X油鏡在405nm的激光激發(fā)，信號收集通道552-617nm及662-737nm0
[0032]圖5為多肽修飾的金納米簇(A)與商品化SYTORNA-Select(B)分別與細(xì)胞共育2小時的熒光成像效果對比圖。可以看出多肽修飾的金納米簇與SYTORNA-SeIect的細(xì)胞內(nèi)定位相同，因此，多肽修飾的金納米簇KCK-AuNCs可以對細(xì)胞的核仁部位進行靶向標(biāo)記。圖6為多肽修飾的金納米簇與商品化SYTORNA-Select與細(xì)胞共育之后在激光連續(xù)照射條件下不同時間點成像效果的比較。如圖所示，在6分鐘的連續(xù)照射的成像條件下，熒光金納米簇能夠較好地維持其熒光強度，而SYTO RNA-Select的強度迅速下降，說明熒光金納米簇對比SYTORNA Select具有更好的光穩(wěn)定性。
[0033]實施例2:
[0034]本實施例涉及的多肽修飾的金納米簇的制備方法，具體工藝步驟如下:
[0035](I)用超純水分別配置 20mmol/L 的 HAuCl4、20mmol/L 的 KRKC 和 20mmol/L 的 GSH 溶液，將玻璃瓶用王水浸泡處理，清洗干凈后烘干備用；
[0036](2)向處理好的玻璃瓶內(nèi)先加入450yL的KRKC溶液及150yL的GSH溶液混合均勻，再向其中加入HAuCl4溶液300yL，可觀察到反應(yīng)體系顏色由無色變?yōu)榈S色，最后向玻璃瓶中加入超純水使溶液中Au+的終濃度為2mmo 1/L ；
[0037](3)將加入反應(yīng)物的玻璃瓶放置于恒溫水浴鍋內(nèi)，80°C恒溫反應(yīng)12h;
[0038](4)反應(yīng)結(jié)束后，將樣品轉(zhuǎn)移到離心管中離心除去大分子顆粒物質(zhì)，將離心上清液外加甲醇、乙醇和丙酮中的任一種離心沉降處理去除未反應(yīng)原料及小分子物質(zhì)得到金納米簇;所述KRKC的中文全稱為賴氨酸(Lysine，K)—精氨酸(Arginine，R)—賴氨酸(Lysine，K)—半胱氨酸(Cysteine，C)，所述GSH的中文全稱為谷氨酸(Glutamic acid，E)—半胱氨酸 (Cysteine，C)—甘氨酸(Glycine，G)，購買于上海強耀生物科技有限公司。
【主權(quán)項】
1.一種多肽修飾的金納米簇的制備方法，其特征在于具體工藝步驟如下: (1)用超純水分別配置20mmol/L的HAuCl4、20mmol/L的KRKC和20mmol/L的GSH溶液，將玻璃瓶用王水浸泡處理，清洗干凈后烘干備用； (2)向處理好的玻璃瓶內(nèi)先加入450yL的KRKC溶液及150yL的GSH溶液混合均勻，再向其中加入HAuCl4溶液300yL，可觀察到反應(yīng)體系顏色由無色變?yōu)榈S色，最后向玻璃瓶中加入超純水使溶液中Au+的終濃度為2mmol/L; (3)將加入反應(yīng)物的玻璃瓶放置于恒溫水浴鍋內(nèi)，70°C -80 °C恒溫反應(yīng)12h ； (4)反應(yīng)結(jié)束后，將樣品轉(zhuǎn)移到離心管中離心除去大分子顆粒物質(zhì)，將離心上清液中剩余的未反應(yīng)原料及小分子物質(zhì)除去得到金納米簇； 步驟(4)中離心上清液采用截留分子量為10000道爾頓的超濾膜過濾，或采用透析或外加甲醇、乙醇和丙酮中的任一種離心沉降處理得到金納米簇;所述KRKC的中文全稱為賴氨酸一精氨酸一賴氨酸一半胱氨酸，所述GSH的中文全稱為谷氨酸一半胱氨酸一甘氨酸。2.—種權(quán)利要求1所述的方法制備的金納米簇，其特征在于金納米簇粒徑為1.5-2.8nm范圍內(nèi)，平均顆粒直徑為1.9nm，金納米簇在400nm附近有明顯的吸收峰，當(dāng)用400nm的激發(fā)光對金納米簇照射時，在500-750nm區(qū)間有較強的熒光發(fā)射，發(fā)射峰在586nm附近，金納米簇的熒光量子產(chǎn)率為7 %。
【文檔編號】C09K11/58GK106085420SQ201610389189
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月2日 公開號201610389189.7, CN 106085420 A, CN 106085420A, CN 201610389189, CN-A-106085420, CN106085420 A, CN106085420A, CN201610389189, CN201610389189.7
【發(fā)明人】王曉娟, 曲劍波, 王雅楠, 黃方, 何化, 王生杰
【申請人】中國石油大學(xué)(華東)