本發(fā)明涉及一種ampc基因的實(shí)時(shí)pcr快速檢測(cè)系統(tǒng)，屬于實(shí)時(shí)pcr應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

耐藥菌的危害已遍及全球，耐藥性問(wèn)題成為世界性的新的研究熱點(diǎn)。自從第一個(gè)抗生素——青霉素發(fā)現(xiàn)以來(lái)，人類(lèi)研制、開(kāi)發(fā)了多種抗菌藥物，成功地控制和治療了由細(xì)菌引起的感染性疾病。然而，隨著抗生素的不斷應(yīng)用，細(xì)菌的耐藥性問(wèn)題越來(lái)越突出，越來(lái)越嚴(yán)重。2000年6月12日路透社報(bào)道世界衛(wèi)生組織的觀點(diǎn)：假若人們繼續(xù)濫用抗生素，對(duì)一切藥物產(chǎn)生抵抗的“超級(jí)細(xì)菌”將把人類(lèi)帶回到舊時(shí)代，一些小小的感染也會(huì)使人喪命。耐藥菌產(chǎn)生之快、傳播之迅速、耐藥率之高引起世界性廣泛關(guān)注。耐藥菌的危害十分嚴(yán)重，它不僅使藥物療效減弱，藥物劑量極大，療程延長(zhǎng)，復(fù)發(fā)率升高，治療費(fèi)用增加，有時(shí)還引起并發(fā)癥，某些情況下甚至?xí)箍股厥ク熜?dǎo)致病人死亡率升高。細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)和耐藥細(xì)菌的感染常使經(jīng)驗(yàn)型治療難以奏效，給臨床抗感染治療帶來(lái)極大的挑戰(zhàn)。因此，及時(shí)準(zhǔn)確地檢測(cè)細(xì)菌的耐藥性，對(duì)細(xì)菌耐藥性的變遷和某些重點(diǎn)的耐藥細(xì)菌進(jìn)行長(zhǎng)期的監(jiān)測(cè)和分析，可為臨床抗感染治療方案的擬定提供有益幫助。

在臨床病原菌的各種耐藥問(wèn)題中，以青霉素和頭孢菌素為代表的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的耐藥問(wèn)題尤其突出，給臨床治療感染性疾病帶來(lái)極大困難。β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素是現(xiàn)有的抗生素中使用最廣泛的一類(lèi)，它系指化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有β-內(nèi)酰胺環(huán)的一大類(lèi)抗生素，主要包括青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)、頭霉素類(lèi)、碳青霉烯類(lèi)、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類(lèi)。β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素通過(guò)抑制細(xì)菌胞壁的粘肽合成酶，阻礙細(xì)胞壁的合成而起到殺菌作用。針對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，細(xì)菌在進(jìn)化與繁殖過(guò)程中也產(chǎn)生了一套防衛(wèi)機(jī)制，其中最重要的方式是產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶。β-內(nèi)酰胺酶可以水解β-內(nèi)酰胺環(huán)中的酰胺鍵，使之轉(zhuǎn)化成為無(wú)活性的衍生物而失去殺菌作用，這是革蘭陰性桿菌耐β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的主要機(jī)制。

β-內(nèi)酰胺酶種類(lèi)繁多、特性各異，目前已發(fā)現(xiàn)的β-內(nèi)酰胺酶超過(guò)300種，其中頭孢菌素酶(ampc酶)是臨床較為常見(jiàn)的β-內(nèi)酰胺酶，具有重要的檢測(cè)意義。質(zhì)粒ampc酶高水平持續(xù)表達(dá)，且可通過(guò)轉(zhuǎn)化、接合等方式轉(zhuǎn)移給其它菌種，造成耐藥性的廣泛傳播。目前，在大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、奇異變形桿菌、沙門(mén)氏菌屬中都已發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒介導(dǎo)的ampc酶。質(zhì)粒ampc酶危害嚴(yán)重，這是因?yàn)橐环N質(zhì)粒可同時(shí)攜帶多個(gè)耐藥基因，使得產(chǎn)ampc酶的菌株表現(xiàn)出多重耐藥性，而且耐藥譜呈現(xiàn)擴(kuò)大趨勢(shì)。另一方面，質(zhì)粒的可傳遞性，使耐藥問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)峻，容易引起醫(yī)院感染的暴發(fā)流行。

要減緩和控制耐藥菌株的產(chǎn)生，建立一種可靠的檢測(cè)方法是關(guān)鍵，而如何快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)質(zhì)粒介導(dǎo)的ampc酶是目前臨床實(shí)驗(yàn)室面臨的一個(gè)普遍難題。目前用于實(shí)驗(yàn)研究和臨床檢測(cè)的常見(jiàn)方法主要有以下幾種：頭孢西丁紙片法、頭孢西丁三維試驗(yàn)、等點(diǎn)聚焦電泳/抑制試驗(yàn)和基因檢測(cè)方法。前三種方法是利用耐藥表型篩選法或抑制劑篩選法對(duì)ampc酶進(jìn)行檢測(cè)，其缺點(diǎn)是耗時(shí)、特異性差、操作繁瑣、檢測(cè)結(jié)果易受環(huán)境因素影響，所以假陽(yáng)性率高?；驒z測(cè)方法可以有效彌補(bǔ)表型檢測(cè)的缺點(diǎn)，目前使用比較多的是傳統(tǒng)pcr方法和dna芯片方法。傳統(tǒng)pcr方法根據(jù)質(zhì)粒ampc基因的同源性設(shè)計(jì)群特異性引物，通過(guò)pcr對(duì)質(zhì)粒ampc基因進(jìn)行擴(kuò)增。但該方法需要對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，開(kāi)管操作易產(chǎn)生氣溶膠污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)。dna芯片方法通過(guò)pcr過(guò)程對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記，若標(biāo)記的產(chǎn)物與dna芯片上的探針發(fā)生雜交，即可證明有耐藥基因的存在。dna芯片技術(shù)雖然在檢測(cè)通量上有很大優(yōu)勢(shì)，但卻需要pcr擴(kuò)增、雜交、洗脫、檢測(cè)熒光等一系列操作步驟，而且成本高，難以在臨床實(shí)驗(yàn)室推廣。由于上述種種原因，很多臨床實(shí)驗(yàn)室很難準(zhǔn)確及時(shí)的檢出質(zhì)粒介導(dǎo)的ampc酶。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種ampc基因的實(shí)時(shí)熒光定量pcr快速檢測(cè)系統(tǒng)，具體涉及質(zhì)粒ampc基因的檢測(cè)。本發(fā)明可以有效彌補(bǔ)現(xiàn)有檢測(cè)方法的不足。本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的檢測(cè)質(zhì)粒ampc基因的快速檢測(cè)系統(tǒng)。本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種ampc基因的實(shí)時(shí)熒光定量pcr快速檢測(cè)系統(tǒng)，其中，分子信標(biāo)探針是一種含有“莖-環(huán)”結(jié)構(gòu)，分子信標(biāo)探針的核苷酸序列如seqno.1所示；

本發(fā)明的特異性引物為：

上游引物f：5’-atagtattggaatacgttatta-3’；

下游引物f：5’-tatgcactagaatatgagtc-3’。

本發(fā)明分子信標(biāo)探針的莖部分是由于核酸分子的5′和3′末端的堿基配對(duì)而形成的，位于莖部分的5′端和3′端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。環(huán)部分與構(gòu)成莖的兩條鏈相連，并與待檢靶序列互補(bǔ)。未與靶序列雜交時(shí)，分子信標(biāo)呈莖-環(huán)構(gòu)象，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)彼此鄰近，二者之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，使熒光基團(tuán)發(fā)射出來(lái)的熒光被淬滅基團(tuán)所吸收，所以觀察不到熒光；當(dāng)分子信標(biāo)探針與靶序列雜交時(shí)，莖-環(huán)結(jié)構(gòu)打開(kāi)，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分開(kāi)，淬滅基團(tuán)不再能有效地吸收由熒光基團(tuán)發(fā)出的光。因此，分子信標(biāo)探針與其靶核酸序列的結(jié)合即伴隨著熒光發(fā)射的增加，并據(jù)此構(gòu)成檢測(cè)的基礎(chǔ)。分子信標(biāo)實(shí)時(shí)熒光pcr技術(shù)提高了探針與待檢靶序列的雜交效率，具有特異性強(qiáng)、敏感性高、便捷等特點(diǎn)。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：

利用實(shí)時(shí)pcr技術(shù)的多種優(yōu)勢(shì)，并將特異的分子信標(biāo)探針引入到其中，探索建立一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的檢測(cè)質(zhì)粒ampc基因的快速檢測(cè)系統(tǒng)。與現(xiàn)有的基因檢測(cè)方法相比，本方法可以對(duì)pcr反應(yīng)的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，整個(gè)過(guò)程為全封閉反應(yīng)和檢測(cè)，在2h內(nèi)可由儀器自動(dòng)完成，大大減少了模板污染和假陽(yáng)性的可能；結(jié)果直觀客觀，避免人為判斷，簡(jiǎn)便快速；通過(guò)使用96孔或384孔實(shí)時(shí)pcr儀可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)。如果應(yīng)用于臨床可以大大減少誤用的抗生素處方率，幫助醫(yī)生選用針對(duì)性更強(qiáng)的抗生素，縮短療程，減輕細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生和擴(kuò)散的選擇壓力，延緩耐藥菌株的出現(xiàn)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

ampc基因如seqno.2所示。

實(shí)施例1本發(fā)明ampc基因的實(shí)時(shí)熒光定量pcr快速檢測(cè)系統(tǒng)

本發(fā)明實(shí)時(shí)熒光定量pcr快速檢測(cè)系統(tǒng)中的分子信標(biāo)探針是一種含有“莖-環(huán)”結(jié)構(gòu)，分子信標(biāo)探針的核苷酸序列如seqno.1所示；

本發(fā)明的特異性引物為：

上游引物f：5’-atagtattggaatacgttatta-3’；

下游引物f：5’-tatgcactagaatatgagtc-3’。

試驗(yàn)例1

以大腸埃希菌(市售)為試驗(yàn)菌株，利用普通pcr和本發(fā)明檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，普通pcr中的陽(yáng)性率為3.5％，而本發(fā)明的陽(yáng)性率為0。