本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種在血漿和血清中檢測mirna的方法。

背景技術(shù)：

2008年mitchellps等發(fā)現(xiàn)血漿中mirna能以穩(wěn)定的形式存在，避免內(nèi)源性rna酶的降解。同年shlomitg等證實(shí)mirna可以在血漿和其他體液中穩(wěn)定存在，并且表達(dá)譜隨不同病理生理狀態(tài)而改變。由于外周靜脈血獲取簡單且病人容易接受，克服了樣本量不足等困難，使得循環(huán)mirna在疾病診斷中的應(yīng)用研究成為研究的熱點(diǎn)。

最常用且有效的mirna表達(dá)檢測技術(shù)是熒光定量pcr法。目前通用步驟為：抽提樣本rna，逆轉(zhuǎn)為mirnacdna，熒光定量檢測mirna表達(dá)水平。第一步抽提樣本rna較困難。由于血漿mirna含量較低，若樣本量較少時(shí)提取的rna量不足后續(xù)試驗(yàn)。最常用的血漿循環(huán)rna抽提法沿用傳統(tǒng)trizol抽提法：trizol裂解，氯仿萃取，異丙醇沉淀，75％乙醇洗滌，depc水溶解。此方法提取效率低，對樣本量要求大，而且有機(jī)試劑的殘留會抑制后續(xù)pcr反應(yīng)，造成mirna檢測效率下降。市場上的試劑盒抽提法為：裂解，萃取，磁珠或吸附柱吸附，洗滌，溶解。該方法通常會使用磁珠或吸附柱，會造成rna的損失、破壞rna的完整性，對樣本需求量大而且費(fèi)用較高。

并且，傳統(tǒng)的血漿mirna檢測方法復(fù)雜，耗時(shí)間，成本高，重復(fù)性低，不利于臨床推廣和應(yīng)用。

因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種簡化檢測方法、降低成本、提高重復(fù)性的在血漿和血清中檢測mirna的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供了一種簡化檢測方法、降低成本、提高重復(fù)性的在血漿和血清中檢測mirna的方法。

本發(fā)明第一方面提供了一種非診斷性的免抽提的對測試樣品進(jìn)行mirna檢測的方法，所述方法包括步驟：

(i)提供一測試樣品，所述測試樣品為血漿和血清樣品，將所述測試樣品和預(yù)處理緩沖液混合，形成第一混合物，其中所述預(yù)處理緩沖液包括非離子型表面活性劑；

(ii)將所述第一混合物進(jìn)行加熱處理，得到經(jīng)處理的第二混合物；和

(iii)將所述第二混合物直接用作模板，檢測所述測試樣品中的mirna的種類和/或含量。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(i)中，所述預(yù)處理緩沖液包括一種或多種選自下組的非離子型表面活性劑：吐溫20(tween-20)、吐溫21(tween-21)、吐溫40(tween-40)、吐溫60(tween-60)、吐溫61(tween-61)、吐溫80(tween-80)、吐溫81(tween-81)、吐溫85(tween-85)、tritonx-100、np-40、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述非離子型表面活性劑包括吐溫20(tween-20)。

在另一優(yōu)選例中，所述非離子型表面活性劑的濃度(v/v)為0.5-10％，較佳地，1-5％，更佳地，2-4％。

在另一優(yōu)選例中，所用溶劑為水。

在另一優(yōu)選例中，所述非離子型表面活性劑的濃度為0.5-10wt％，較佳地，1-5wt％，更佳地，2-4wt％。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(i)中，所述預(yù)處理緩沖液的ph為6-9，較佳地，7-9，更佳地，7-8。

在另一優(yōu)選例中，所述預(yù)處理緩沖液還包括tris-hcl緩沖液。

在另一優(yōu)選例中，所述tris-hcl緩沖液的濃度為25-150mm，較佳地，30-100mm，更佳地，30-80mm。

在另一優(yōu)選例中，所述預(yù)處理緩沖液還包括金屬螯合劑。

在另一優(yōu)選例中，所述金屬螯合劑選自下組：edta、egta、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述金屬螯合劑包括edta。

在另一優(yōu)選例中，所述金屬螯合劑的濃度為0.5-2.0mm，較佳地，0.5-1.5mm，更佳地，0.8-1.2mm。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(ii)中，所述加熱溫度為60-80℃，較佳地，70-75 ℃。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(iii)中，用熒光定量pcr的方法檢測測試樣品中的mirna的含量。

在另一優(yōu)選例中，所述mirna來自于哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人。

在另一優(yōu)選例中，所述方法不包括抽提rna的步驟。

在另一優(yōu)選例中，所述方法為非治療非診斷性的。

在另一優(yōu)選例中，所述方法檢測所述測試樣品中選自下組(a)的一個(gè)或多個(gè)mirna的種類和/或數(shù)量：mir-20b、mir-106a、mir-16。

在另一優(yōu)選例中，所述方法檢測所述測試樣品中選自下組(b)的一個(gè)或多個(gè)mirna的種類和/或數(shù)量：mir-671、mir-151、mir-433、mir-409。

本發(fā)明第二方面提供了一種mirna組合物，所述組合物包括如下mirna或由如下mirna構(gòu)成：mir-20b、mir-106a、mir-16、mir-671、mir-151、mir-433、和mir-409。

在另一優(yōu)選例中，所述組合物包括選自下組(a)的至少一種或全部的mirna：mir-20b、mir-106a、mir-16。

在另一優(yōu)選例中，所述組合物包括選自下組(b)的至少一種或全部的mirna：mir-671、mir-151、mir-433、mir-409。

本發(fā)明第三方面提供了一種本發(fā)明第二方面所述組合物的用途，用于制備檢測乳腺癌轉(zhuǎn)移的診斷試劑或試劑盒。

在另一優(yōu)選例中，所述組合物還被用作血漿中檢測乳腺癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物。

在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒包括：(i)本發(fā)明第二方面所述的mirna組合物作為對照品；和(ii)標(biāo)簽或說明書，其中，所述標(biāo)簽或說明書注明所述試劑盒用于檢測或診斷乳腺癌轉(zhuǎn)移。

在另一優(yōu)選例中，所述診斷試劑是單克隆抗體。

在另一優(yōu)選例中，所述的檢測乳腺癌轉(zhuǎn)移是血漿檢測。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1顯示了本發(fā)明的方法與傳統(tǒng)方法的比較。

圖2顯示了最佳方法的優(yōu)選。其中，2a：三種不同處理樣本方法的比較；2b：三種方法分別檢測mir-16，顯示m3(化學(xué)變性和加熱變性相結(jié)合)的檢測效率最高。

圖3顯示了該檢測方法的準(zhǔn)確性。取不同體積的血漿樣本，定量檢測mir-16，其含量與樣本體積呈正比例關(guān)系，其中，3a：利用m3(化學(xué)變性和加熱變性相結(jié)合)，定量檢測血漿mir-16；3b：mir-16擴(kuò)增循環(huán)數(shù)；3c：將上述擴(kuò)增循環(huán)數(shù)換算為mirna相對表達(dá)量，和樣本體積成線性正比關(guān)系。

圖4顯示了該檢測方法的特異性。同一血漿樣本中加入不同體積的外源性小rnaunisp6，利用該方法成功檢測到unisp6，并且其檢測到的含量與加入的量相符。mir-16作為內(nèi)對照，其含量不隨外源性unisp6的加入而改變。其中，4a：定量檢測血漿中unisp6的豐度；4b：檢測和unisp6無關(guān)的mir-16。

圖5通過檢測mir-92a和let-7b，比較了傳統(tǒng)的檢測方法及本方案申請的檢測方法。其中，5a顯示血漿直接測定法(p)檢測效率優(yōu)于傳統(tǒng)的rna提取檢測方法(r)；5b顯示兩種方法分別檢測let-7b在不同樣本中的差異，結(jié)果是一致的；5c顯示兩種方法分別檢測mir-92a在不同樣本中的差異，結(jié)果是一致的。

圖6顯示了血漿中mir-106a和mir-671可以作為乳腺癌轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物。其中，6a顯示4例正常人和6例乳腺癌患者(包括3例癌細(xì)胞非轉(zhuǎn)移患者和3例癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移患者)血漿mirna篩查，發(fā)現(xiàn)7個(gè)異常表達(dá)的mirna；6b通過更多樣本的驗(yàn)證，證實(shí)mir-106a在轉(zhuǎn)移性乳腺癌血漿中顯著性上調(diào)；6c通過更多樣本的驗(yàn)證，證實(shí)mir-671在轉(zhuǎn)移性乳腺癌血漿中顯著性下調(diào)。

圖7顯示加熱處理的樣本，利用血漿直接測定法，能夠檢測到mir-16，而sds處理的樣本，利用血漿直接測定法未能檢測到mir-16。

圖8顯示加熱處理的樣本，利用血漿直接測定法，能夠檢測到mir-21，而sds處理的樣本，利用血漿直接測定法未能檢測到mir-21。

圖9顯示加熱處理的樣本，利用血漿直接測定法，能夠檢測到5srrna，而sds處理的樣本，利用血漿直接測定法未能檢測到5srrna。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次開發(fā)了一種新型的檢測mirna的方法，該方法將血漿和血清樣品進(jìn)行加熱和非離子表面活性劑處理，所得到的混 合物不經(jīng)rna提取直接用作模板，用于檢測血漿和血清中mirna的含量。該檢測方法的檢測結(jié)果具有高準(zhǔn)確性、高靈敏度、高特異性、高檢測效率的特點(diǎn)。此外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)一系列mirna分子，可作為診斷乳腺癌轉(zhuǎn)移的標(biāo)記物。在此基礎(chǔ)上，發(fā)明人完成了本發(fā)明。

如本文所用，術(shù)語“預(yù)處理緩沖液”、“變性緩沖液”可互換使用，均指一種含有吐溫20(0.5-10％v/v)、edta(0.8-1.2mm)和tris-hcl(30-80mm)的溶液。

檢測方法

本發(fā)明提供了一種可用于檢測微小rna(mirna)的新方法。

本發(fā)明檢測方法采用了對血漿和血清進(jìn)行加熱和變性緩沖液(包括非離子型表面活性劑)共處理，所得到的混合物不經(jīng)rna提取步驟，直接用于mirna的檢測。

本發(fā)明的方法與傳統(tǒng)方法的比較如圖1所示。在本發(fā)明中，一個(gè)典型的mirna檢測方法包括如下基本步驟：

(i)提供一測試樣品，所述測試樣品為血漿和血清樣品，將所述測試樣品和預(yù)處理緩沖液混合，形成第一混合物，其中所述預(yù)處理緩沖液包括非離子型表面活性劑；

(ii)將所述第一混合物進(jìn)行加熱處理，得到經(jīng)處理的第二混合物；和

(iii)將所述第二混合物直接用作模板，檢測所述測試樣品中的mirna的種類和/或含量。

在本發(fā)明中，一種優(yōu)選的檢測方法的步驟包括：

(1)準(zhǔn)備變性緩沖液：2.5％(v/v)tween20,50mmol/ltris-hcl,1mmol/ledta

(2)5ul血漿加5ul等體積變性緩沖液，反應(yīng)10分鐘，75℃水浴5min，入冰冷卻，離心。

(3)利用常規(guī)市售mirna逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，將mirna反轉(zhuǎn)錄為cdna，稀釋10-100倍備用。

(4)熒光定量pcr反應(yīng)，擴(kuò)增mirna，檢測mirna在血漿樣本的表達(dá)豐度。

16ul反應(yīng)體系：1ulcdna，1ul待測mirna前引物(2.5pmol/ul)，1ul通用 后引物(2.5pmol/ul)，8ulsybr熒光試劑，5ulh2o。

反應(yīng)條件：50℃、2min；95℃、10min；40個(gè)循環(huán)：95℃、15s，60℃、1min。

本發(fā)明的檢測方法不僅省略了rna的提取步驟，還具有檢測結(jié)果高準(zhǔn)確性、高特異性、高靈敏度、高檢測效率的特點(diǎn)。

檢測乳腺癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物

本發(fā)明還提供了mirna組合物，可被用作檢測血漿中乳腺癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物。

在本發(fā)明中，本發(fā)明的mirna組合物選自下組：mir-20b、mir-106a、mir-16、mir-671、mir-151、mir-433、mir-409、或其組合。

其中，mir-20b、mir-106a和mir-16在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的血漿中能夠特異性高表達(dá)；mir-671、mir-151、mir-433和mir-409在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的血漿中能夠特異性低表達(dá)。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)主要包括：

(1)該檢測方法省略了rna的提取步驟，方法簡單，成本更低。

(2)該檢測方法的檢測結(jié)果具有高準(zhǔn)確性、高特異性、高檢測效率的特點(diǎn)。

(3)該檢測方法靈敏度更高，避免了血漿rna制備過程中的mirna損失。

(4)該檢測方法快捷便利，和傳統(tǒng)方法相比，檢測時(shí)間縮短了一半。

(5)該檢測方法避免使用trizol等有機(jī)溶劑，排除了傳統(tǒng)方法殘存有機(jī)溶劑對后續(xù)檢測的影響。

(6)基于上述優(yōu)點(diǎn)，該檢測方法更適于臨床檢驗(yàn)和檢測。

(7)首次發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的mirna組合物可以被用作檢測血漿中乳腺癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠 商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量或體積百分比和重量份數(shù)。

1.方法

(1)準(zhǔn)備變性緩沖液：2.5％(v/v)tween20,50mmol/ltris-hcl,1mmol/ledta

(2)5ul血漿加5ul等體積變性緩沖液，反應(yīng)10分鐘，75℃水浴5min，入冰冷卻，離心。

(3)利用常規(guī)市售mirna逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，將mirna反轉(zhuǎn)錄為cdna，稀釋10-100倍備用。

(4)熒光定量pcr反應(yīng)，擴(kuò)增mirna，檢測mirna在血漿樣本的表達(dá)豐度。

16ul反應(yīng)體系：1ulcdna，1ul待測mirna前引物(2.5pmol/ul)，1ul通用后引物(2.5pmol/ul)，8ulsybr熒光試劑，5ulh2o。

反應(yīng)條件：50℃、2min；95℃、10min；40個(gè)循環(huán)：95℃、15second，60℃、1min。

2.優(yōu)化的方法

首先比較了三種不同的蛋白變性方法，m1是加熱變性，m2是變性緩沖液化學(xué)變性，m3是把化學(xué)變性和加熱變性結(jié)合一起，比較不同方法對mirna在血漿中的釋放和定量檢測的影響。

利用上述三種不同的方法，定量檢測了同一個(gè)血漿樣本中mir-16的表達(dá)豐度，結(jié)果如圖2a和2b所示。結(jié)果顯示，m3檢測效率最高(循環(huán)數(shù)最小)，m1次之，m2效率最低(循環(huán)數(shù)最大)。

結(jié)果表明，利用血漿蛋白變性直接檢測mirna方法可行，并且m3方法(化學(xué)變性和加熱變性結(jié)合)對于血漿mirna檢測效率最高。

3.方法準(zhǔn)確性的驗(yàn)證

分別取1、4、8ul血漿，利用m3所述方法，定量檢測血漿mir-16，以驗(yàn)證 不同體積血漿中mir-16量的不同。

結(jié)果如圖3a、3b、3c所示。結(jié)果顯示，1、4、8ul血漿分別對應(yīng)的mir-16擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為31.8、29.6、28.5。血漿體積越大，循環(huán)數(shù)越小，符合預(yù)期。將上述擴(kuò)增循環(huán)數(shù)換算為mirna相對表達(dá)量，和樣本體積成線性正比關(guān)系，r²達(dá)到0.999，結(jié)果表明，本發(fā)明的檢測方法對血漿mirna的檢測具有高準(zhǔn)確性。

4.方法特異性的驗(yàn)證

在一個(gè)血漿樣本中，加入一種外源性的rna(unisp6)。此rna在血漿中本身不存在。設(shè)定三組實(shí)驗(yàn)，等量血漿中分別給予0、1、4ul的unisp6，再利用m3所述方法，定量檢測血漿中unisp6的豐度，以驗(yàn)證該方法對某個(gè)特定mirna檢測的特異性。結(jié)果如圖4a所示。結(jié)果顯示，unisp6在0ul的實(shí)驗(yàn)組中檢測不到；而在1ul和4ul的實(shí)驗(yàn)組中能夠檢測到，并且其豐度相對比值≈4，和unisp6加入量匹配，結(jié)果證明了該方法對rna定量分析具有高特異性。

在上述體系中，檢測和unisp6無關(guān)的mir-16，結(jié)果如圖4b所示。結(jié)果表明，三組體系中mir-16的表達(dá)豐度一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法對rna定量分析具有高特異性。

5.檢測效率的驗(yàn)證

設(shè)計(jì)一組實(shí)驗(yàn)，比較傳統(tǒng)提取rna的方法和本發(fā)明的方法，用于同一個(gè)血漿樣本mirna檢測，通過cdna不同稀釋倍數(shù)，取相當(dāng)于源自0.02ul血漿的兩種方法的cdna，分別檢測mirnalet-7b和mir-92a。結(jié)果如圖5a所示。結(jié)果顯示，與傳統(tǒng)的分析方法相比，本發(fā)明的方法具有更高的檢測效率，δct值相差0.7～1.1，相當(dāng)于檢測效率高一倍左右。

設(shè)計(jì)另外一組實(shí)驗(yàn)，比較傳統(tǒng)提取rna的方法和本發(fā)明的方法，用于檢測兩種不同血漿中某mirna的表達(dá)差異性。發(fā)明人用兩種方法，分別檢測了樣本s4和s5中l(wèi)et-7b和mir-92a的表達(dá)。結(jié)果如圖5b和5c所示。結(jié)果顯示，兩種方法均檢測到樣本s4和s5的let-7b，δct≈3，相當(dāng)于s4的let-7b比s5高8倍，并且兩種方法均檢測到樣本s4和s5的mir-92a，δct≈2，相當(dāng)于s4的let-7b比s5高4倍。該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了本發(fā)明的方法的檢測效率非常高。

6.血清中檢測mirna

收集外周血到未加抗凝劑的采血管中，室溫靜置30分鐘,1500rpm離心5分鐘，收集上清，得到待測血清樣本。

用上述方法(1和2)分別對血清樣本中的mirna(如mir-16)進(jìn)行檢測。

結(jié)果顯示，m3方法(化學(xué)變性和加熱變性結(jié)合)能夠成功檢測到血清mirna,但對于同一血液樣本，血漿mirna含量高于血清mirna含量(c1：c2＞130％)，可能歸因于血清制備過程中部分mirna隨結(jié)合蛋白一起沉淀損失。

結(jié)果表明，可直接檢測血清的mirna，并且m3方法(化學(xué)變性和加熱變性結(jié)合)對于血漿mirna檢測效率最高。

7.臨床應(yīng)用

之前通過mirna基因芯片技術(shù)，分析了六例乳腺癌患者血漿樣本及四例年齡匹配的健康女性血漿樣本，其中患者三例為非轉(zhuǎn)移乳腺癌、另三例為發(fā)生轉(zhuǎn)移的乳腺癌，找到了三個(gè)在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者血漿特異高表達(dá)的mirna(mir-20b,mir-106a,mir-16)，及四個(gè)在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者血漿特異低表達(dá)的mirna(mir-671，mir-151，mir-433，mir-409)。如圖6a、6b和6c所示。

利用本發(fā)明的血漿直接測定法m3(化學(xué)變性和加熱變性相結(jié)合)，重新收集了三例非轉(zhuǎn)移乳腺癌患者血漿、三例發(fā)生轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者血漿、三例健康女性的血漿，對上述mirna分別進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)mir-106a在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者血漿特異高表達(dá)，mir-671在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者血漿特異低表達(dá)。這兩個(gè)結(jié)果與之前的基因芯片檢測結(jié)果一致，說明通過不同樣本，不同方法的分析，確認(rèn)了這兩個(gè)mirna可以作為轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者血漿生物標(biāo)志物，具有臨床應(yīng)用價(jià)值和潛力，可用于乳腺癌轉(zhuǎn)移的早期診斷。

對比例1

方法同1，區(qū)別在于，用sds替代變性緩沖液，取5ul血漿，分別用加熱處理或者等體積10％sds處理，然后利用本發(fā)明的mirna直接檢測法，對三個(gè)微小rna(如mir-16、mir-21、5srrna)進(jìn)行檢測,結(jié)果如圖7－9所示。

結(jié)果如圖7-9所示。結(jié)果顯示，加熱變性處理的樣本，擴(kuò)增良好，利用血漿直接測定法，能夠檢測到mir-16、mir-21和5srrna，而sds變性處理的樣本，沒有擴(kuò)增曲線，利用血漿直接測定法均未能檢測到上述mirna。

結(jié)果表明，用sds處理，無法對三個(gè)微小rna(如mir-16、mir-21、5srrna)進(jìn)行檢測。

對比例2

方法同1，區(qū)別在于，用sds替代變性緩沖液，對血漿進(jìn)行加熱和等體積10％sds處理，然后利用本發(fā)明的mirna直接檢測法，對三個(gè)微小rna(如mir-16、mir-21、5srrna)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，用加熱和sds同時(shí)處理，沒有擴(kuò)增曲線。

結(jié)果表明，對血漿同時(shí)進(jìn)行加熱和sds處理，無法對三個(gè)微小rna(如mir-16、mir-21、5srrna)進(jìn)行檢測。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。