本發(fā)明涉及一種測定甘蔗梢腐病病菌致病力的方法。

背景技術(shù)：

甘蔗梢腐病是甘蔗生產(chǎn)上的一種重要真菌性病害，主要侵染甘蔗嫩梢，導(dǎo)致甘蔗葉片腐爛，甚至植株死亡，對甘蔗品種造成產(chǎn)量和含糖量的顯著下降。甘蔗梢腐病在我國普遍發(fā)生，幾乎所有的甘蔗品種均可感染梢腐病，感病品種梢腐病發(fā)病率可達(dá)到38％以上，導(dǎo)致甘蔗減產(chǎn)5％-20％，甘蔗糖分降低達(dá)3％。甘蔗梢腐病(pokkahboeng)是由多種鐮刀菌引起的一種甘蔗葉部病害，病原菌為藤倉赤霉病菌復(fù)合種(gibberellafujikuroicomplex)，無性態(tài)至少包括fuariumsacchri、f.proliferatum、f.verticillioides、f.subglutinan和f.andiyazi等5種鐮刀菌。應(yīng)用抗病優(yōu)良品種是有效控制甘蔗梢腐病的科學(xué)途徑。甘蔗梢腐病的抗病育種首先需要大量篩選病原菌株，并獲得強(qiáng)致病力的病原菌株，從而利用強(qiáng)致病力菌株對甘蔗品種及種質(zhì)資源進(jìn)行篩選和評價(jià)。

公開于該背景技術(shù)部分的信息僅僅旨在增加對本發(fā)明的總體背景的理解，而不應(yīng)當(dāng)被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種簡易、精準(zhǔn)、有效、重復(fù)性好的離體測定甘蔗梢腐病病菌致病力的方法。使得甘蔗葉片樣本的采集和測定不受栽培季節(jié)以及苗齡的影響。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種測定甘蔗梢腐病病菌致病力的方法，包括以下步驟：

(1)將甘蔗梢腐病菌接種在pda培養(yǎng)基平板上，25-28℃培養(yǎng)3-5天；

(2)選擇甘蔗梢腐病感病品種，采集新鮮甘蔗葉片，清洗葉片，將葉片剪成片段，在葉片中間葉脈兩側(cè)刺傷，取甘蔗梢腐病菌的菌塊接種在刺傷部位，以長有菌絲的一面貼在傷口處；

(3)將接菌的甘蔗葉片置于培養(yǎng)皿中，噴灑無菌水，于室溫條件下放置3-5天；

(4)觀察和測量病斑的長度，沿著葉脈方向測量黃色暈圈的長度，以病斑的長度區(qū)分病原菌致病力的強(qiáng)弱。

優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，所述步驟(2)中采集新鮮甘蔗葉片為，從心葉往下數(shù)第2至第4張完全展開葉片。

優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，所述步驟(2)中葉片剪成的片段長度為10-14cm。

優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，所述步驟(2)中取菌塊為，用滅菌的移液器槍頭挖取菌塊，菌塊直徑為5-6mm。

優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，所述步驟(3)中噴灑無菌水的量為3-5ml。

優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，所述步驟(3)中培養(yǎng)皿選用直徑為15cm。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明測定甘蔗梢腐病病菌致病力的方法，采用離體接種測定甘蔗梢腐病菌的致病力，甘蔗葉片樣本的采集不受甘蔗苗齡、種植時(shí)期的影響，測定條件易控制。甘蔗離體葉片在保溫保濕條件下可在一定時(shí)間內(nèi)不干枯，保證了病原菌的侵染。本發(fā)明方法能夠簡易、精準(zhǔn)、有效且重復(fù)性好的測定甘蔗梢腐病病菌致病力。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受具體實(shí)施方式的限制。

實(shí)施例

一種測定甘蔗梢腐病病菌致病力的方法，包括以下步驟：

1、接種體的制備

分別培養(yǎng)甘蔗梢腐病病原鐮刀菌。具體為：分別將甘蔗梢腐病病原菌接種在pda培養(yǎng)基平板上活化3天，挑取邊緣菌絲接種新的pda培養(yǎng)基平板上，25-28℃培養(yǎng)3-5天，用滅菌的1ml移液器槍頭(寬口的一端)挖取菌絲塊(直徑約5-6mm)，待用。

2、接種材料的處理

選擇生產(chǎn)上表現(xiàn)為甘蔗梢腐病感病品種gt37，抗病品種roc22和中感材料gt08-120，采集新鮮甘蔗葉片(從心葉往下數(shù)第2至第4張完全展開葉片)，用清水沖洗干凈表面的塵土，晾干，剪成約12cm的片段。

3、接種

用大頭針在葉片中間葉脈兩側(cè)刺傷，按照約3×3mm的方式共刺4針。取甘蔗梢腐病菌菌塊，接種在刺傷部位，以長有菌絲的一面貼在傷口處，菌碟完全蓋住刺傷口。每個(gè)菌株分別在10張葉片葉脈的一側(cè)接種，另一側(cè)以接純pda培養(yǎng)基為對照。將接菌的甘蔗葉片至于直徑15cm的玻璃培養(yǎng)皿中，噴灑適量的無菌水(約3-5ml)。于室溫條件(25-28℃)下放置3-5天。

4、病情調(diào)查

觀察和測量病斑的長度。沿著葉脈方向測量黃色暈圈的長度，去除一個(gè)最高值和一個(gè)最低值，以剩余數(shù)值的平均值代表該病原菌致病力的強(qiáng)弱。

對針刺接種法，所述的發(fā)病等級劃分標(biāo)準(zhǔn)如下：

0級：無發(fā)病癥狀；

1級：針刺傷口處黑褐色，黃色暈圈沿葉脈方向長度≤1.0cm；

2級：針刺傷口處黑褐色，黃色暈圈沿葉脈方向長度1.1-2.0cm；

3級：針刺傷口處黑褐色，黃色暈圈沿葉脈方向長度2.1-3.0cm；

4級：針刺傷口處黑褐色，黃色暈圈沿葉脈方向長度3.1-4.0cm；

5級：針刺傷口處黑褐色，黃色暈圈沿葉脈方向長度>4.0cm。

根據(jù)病斑長度對甘蔗梢腐病病原菌的致病力進(jìn)行評價(jià)，致病力強(qiáng)度等級劃分標(biāo)準(zhǔn)如下：

無致病力：發(fā)病等級為0；

弱致病力：發(fā)病等級為1和2；

中致病力：發(fā)病等級為3和4；

強(qiáng)致病力：發(fā)病等級為5。

5、致病力鑒定

不同甘蔗梢腐病菌針刺接種離體甘蔗葉片的致病力鑒定結(jié)果見表1。不同菌種對不同甘蔗品種的侵染情況不一樣，菌株的致病力跟甘蔗品種的基因型存在一定的對應(yīng)關(guān)系。例如，菌株mf1和sf5在甘蔗roc22上表現(xiàn)為無致病力，但是在另外兩個(gè)品種上又表現(xiàn)為弱或中等致病力。通過表1可知，大部分病原菌株在抗性甘蔗品種上表現(xiàn)為較弱的致病力，但在感病品種上卻能快速且較好地區(qū)分不同菌株的致病力。因此，在使用不同甘蔗梢腐病菌針刺接種離體甘蔗葉片方法進(jìn)行病原菌株的致病力測定的時(shí)候，建議采用感病品種作為測試材料。

表1不同甘蔗梢腐病菌株接種甘蔗葉片的致病力測定結(jié)果

前述對本發(fā)明的具體示例性實(shí)施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述并非想將本發(fā)明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)，可以進(jìn)行很多改變和變化。對示例性實(shí)施例進(jìn)行選擇和描述的目的在于解釋本發(fā)明的特定原理及其實(shí)際應(yīng)用，從而使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)并利用本發(fā)明的各種不同的示例性實(shí)施方案以及各種不同的選擇和改變。本發(fā)明的范圍意在由權(quán)利要求書及其等同形式所限定。