本發(fā)明是申請(qǐng)?zhí)枮?013800373462，發(fā)明名稱：“作為基因表達(dá)誘導(dǎo)劑的糖酯”的分案申請(qǐng)，母案的申請(qǐng)日是2013年07月18日。

本發(fā)明的母案要求了2012年7月20日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)案序列號(hào)61/673,997和2012年12月27日申請(qǐng)的61/746,120的權(quán)益，所述臨時(shí)申請(qǐng)案的內(nèi)容全文并入。

本發(fā)明涉及在細(xì)胞培養(yǎng)中用作基因表達(dá)誘導(dǎo)劑的化合物及其制備方法。更確切地說(shuō)，本發(fā)明涉及對(duì)于酶制造商來(lái)說(shuō)能顯著降低制造成本的低成本而且高效的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)劑的開(kāi)發(fā)。

背景技術(shù)：

便宜而且容易獲得的工業(yè)酶是工業(yè)生物技術(shù)革命背后的關(guān)鍵推動(dòng)因素，其中越來(lái)越多地使用可再生資源以生物學(xué)方式產(chǎn)生化學(xué)物質(zhì)和能量燃料。與用于治療和診斷目的的高利潤(rùn)酶或其它蛋白質(zhì)相反，工業(yè)酶典型地具有較低利潤(rùn)，并且在發(fā)酵后利用有限的下游加工大量制造。對(duì)于工業(yè)酶市場(chǎng)來(lái)說(shuō)，生產(chǎn)成本對(duì)商業(yè)上的成功是至關(guān)重要的。為了滿足可再生化學(xué)物質(zhì)和能源工業(yè)對(duì)較便宜而且容易獲得的酶的日益增加的需求，急需更有效而且成本有效的生產(chǎn)工藝。

主要工業(yè)酶制造商都把大量產(chǎn)能投入到真菌發(fā)酵，特別是使用絲狀真菌，例如曲霉屬(aspergillusspp)、青霉屬(penicilliumspp)、木霉屬(trichodermaspp.)、拉克淖金孢菌(chrysosporiumlucknowense)(c1)和嗜熱毀絲霉(myceliophthorathermophila)(重新分類)，以制造紡織品、洗滌劑、食品和飼料以及新興生物燃料工業(yè)中所使用的眾多酶產(chǎn)品(沙瑪(sharma)等人,世界微生物學(xué)與生物技術(shù)雜志(worldj.ofmicrobiol.andbiotech.),25(12):2083-2094(2009)；維瑟(visser)等人,工業(yè)生物技術(shù)(industrialbiotech.),7(3):214-223(2011))。

在曲霉屬和木霉屬中大批生產(chǎn)相關(guān)蛋白質(zhì)通常需要能在強(qiáng)天然啟動(dòng)子下活化轉(zhuǎn)錄開(kāi)關(guān)從而驅(qū)動(dòng)相關(guān)基因表達(dá)靶酶或蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)劑化合物。例如淀粉和纖維素等不溶性底物通常用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模下以便分別誘導(dǎo)曲霉屬和木霉屬中的蛋白質(zhì)表達(dá)。然而，其在工業(yè)規(guī)模下的實(shí)施因不良底物連貫性和材料和在大規(guī)模下所遭遇的例如滅菌、饋料、混合和粘度問(wèn)題等處理問(wèn)題而受阻。因此，在大批生產(chǎn)酶和其它蛋白質(zhì)時(shí)，高效可溶性誘導(dǎo)劑是更優(yōu)選的。

麥芽糖、異麥芽糖和麥芽糊精通常用作可溶性誘導(dǎo)劑以用于在曲霉屬中誘導(dǎo)α-淀粉酶和葡糖淀粉酶(巴頓(barton)等人,細(xì)菌學(xué)雜志(j.bacteriol.,b(3):771-777(1972))，而槐糖、纖維二糖和乳糖是廣泛用于木霉屬中的酶生產(chǎn)工業(yè)的三種有效的可溶性誘導(dǎo)劑(庫(kù)比切克(kubicek)等人,生物燃料生物技術(shù)(biotech.biofuels),2:19(2009))?；碧牵匆环Nβ1,2-二糖，被視為里氏木霉(trichodermareesei)中的纖維素酶基因啟動(dòng)子的最強(qiáng)誘導(dǎo)劑，活性是纖維二糖的2500倍(曼德?tīng)査?mandels)等人,細(xì)菌學(xué)雜志(j.bacteriol.),83(2):400-408(1962))。這些相應(yīng)的可溶性誘導(dǎo)劑都在誘導(dǎo)之前、期間或之后由曲霉屬或木霉屬代謝。因此，它們被視為無(wú)償誘導(dǎo)劑，因而需要在發(fā)酵期間不斷供應(yīng)它們以便實(shí)現(xiàn)最佳誘導(dǎo)。

在通過(guò)深層發(fā)酵進(jìn)行的工業(yè)酶生產(chǎn)中，可溶性誘導(dǎo)劑通常呈單獨(dú)或補(bǔ)充有例如葡萄糖等替代性碳源的饋入批料形式以碳受限方式供應(yīng)至發(fā)酵器。由于誘導(dǎo)劑是有償?shù)模收T導(dǎo)過(guò)程如果未經(jīng)充分優(yōu)化則通常將導(dǎo)致會(huì)顯著降低生產(chǎn)率的分解代謝物阻遏以及會(huì)顯著降低產(chǎn)率的非必需生長(zhǎng)。因而，所屬領(lǐng)域中需要更強(qiáng)的無(wú)償或接近無(wú)償?shù)恼T導(dǎo)劑，其能消除誘導(dǎo)受非意料抑制、生長(zhǎng)或其它生理功能影響，從而允許進(jìn)行更嚴(yán)格的過(guò)程優(yōu)化，以便與當(dāng)前可能達(dá)到的相比顯著提高生產(chǎn)率和產(chǎn)率。更強(qiáng)的誘導(dǎo)劑還能容易地用于滿足對(duì)更便宜而且非誘導(dǎo)性原料的誘導(dǎo)需要以及增強(qiáng)例如乳糖、纖維素、麥芽糊精等常規(guī)誘導(dǎo)劑或例如淀粉和纖維素水解物等更便宜替代物以及例如固相發(fā)酵等替代生產(chǎn)過(guò)程中的誘導(dǎo)。

因?yàn)榛谔堑恼T導(dǎo)劑對(duì)于蛋白質(zhì)表達(dá)來(lái)說(shuō)既是誘導(dǎo)劑又是阻遏劑，所以通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)劑進(jìn)行改性以減緩其吸收或新陳代謝來(lái)增強(qiáng)誘導(dǎo)力的方法是已知的。盡管未加以表征，但已知八乙酸纖維二糖酯水解產(chǎn)物的誘導(dǎo)力優(yōu)于纖維二糖(曼德?tīng)査购屠锼?reese),細(xì)菌學(xué)雜志(j.bacteriol.),79(6):816-826(1960))。在產(chǎn)糖芽霉菌(pullulariapullulans)中，單棕櫚酸蔗糖酯所誘導(dǎo)的蔗糖酶產(chǎn)率是蔗糖的80倍(里斯等人,細(xì)菌學(xué)雜志,100(3):1151-1154(1969))。類似地，乙酰基纖維二糖在產(chǎn)紫青霉菌(penicilliumpurpurogenum)中誘導(dǎo)纖維素酶時(shí)比葡萄糖或纖維二糖更有效，其中單-o-乙?；w維二糖是所測(cè)試的最具活性的誘導(dǎo)劑(蘇喬(suto)等人,發(fā)酵與生物工程雜志(j.ferment.bioengin.),72(5):352-357(1991))。本發(fā)明人的最近申請(qǐng)(國(guó)際申請(qǐng)第wo2013/003291號(hào))公開(kāi)了由對(duì)天然槐糖脂進(jìn)行稀酸處理而得到的一類新穎槐糖酯，天然槐糖脂的誘導(dǎo)力為槐糖本身的至少30倍。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于產(chǎn)生相關(guān)蛋白質(zhì)的方法，其包含提供發(fā)酵宿主和將所述發(fā)酵宿主與碳源和一或多種選自由以下各項(xiàng)組成的群組的化合物一起培養(yǎng)：

1)式i

2)式ii

3)式iii

4)式iv

5)式v

6)式vi

7)式vii

其中ra是h或c(o)r；

rb是h或c(o)r；

rc是h或c(o)r；

rd是h或c(o)ch3；

re是h或c(o)ch3；

rf是h或c(o)ch3；

rg是h或c(o)ch3；且

r是脂肪族部分，其限制條件是在式(ii)中，當(dāng)ra是h或c(o)ch3且rb是h或c(o)ch3時(shí)，rc是h，

其中所述發(fā)酵宿主是在足以產(chǎn)生相關(guān)蛋白質(zhì)的條件下加以培養(yǎng)。在一個(gè)實(shí)施例中，所述相關(guān)蛋白質(zhì)是纖維素酶或淀粉酶。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述相關(guān)蛋白質(zhì)是同源或異源蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述同源或異源蛋白質(zhì)是酶、激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子或抗體。在一個(gè)實(shí)施例中，所述發(fā)酵宿主能夠產(chǎn)生纖維素酶或淀粉酶。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述發(fā)酵宿主是絲狀真菌或細(xì)菌或選自由以下各項(xiàng)組成的菌屬群組的其它宿主：木霉屬(trichoderma)、腐殖菌屬(humicola)、側(cè)耳菌屬(pleurotus)、鐮刀菌屬(fusarium)、曲霉屬(aspergillus)、鏈霉屬(streptomyces)、嗜熱單孢霉屬(thermomonospora)、牙胞桿菌屬(bacillus)、纖維桿菌屬(cellulomonas)、青霉屬(penicillium)、擔(dān)子菌屬(basidiomycete)、金孢屬(chrysoporium)、擬盤多毛孢屬(pestalotiopsis)、脈孢菌屬(neurospora)、頭孢霉屬(cephalosporium)、綿霉屬(achlya)、柄孢殼菌屬(podospora)、內(nèi)座殼屬(endothia)、毛霉屬(mucor)、旋孢腔菌屬(cochliobolus)、毀絲霉屬(myceliophthora)、籃狀菌屬(talaromyces)和梨孢菌屬(pyricularia)。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述發(fā)酵宿主是絲狀真菌里氏木霉或黑曲霉(aspergillusniger)。在一個(gè)實(shí)施例中，使所述發(fā)酵宿主在液體培養(yǎng)基中或在無(wú)自由流動(dòng)液體的固體底物上生長(zhǎng)。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述發(fā)酵宿主具有與編碼相關(guān)蛋白質(zhì)的基因可操作地連接的啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述啟動(dòng)子是纖維素酶基因啟動(dòng)子或淀粉酶基因啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述啟動(dòng)子是cbh1啟動(dòng)子或glaa啟動(dòng)子或amya啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施例中，所述碳源是生物質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述生物質(zhì)是葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油、乳糖、纖維素、纖維素水解物、淀粉、淀粉水解物、麥芽糖或麥芽糊精。

在另一個(gè)方面，所述式(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(v)的化合物是從得自于化學(xué)催化或酶催化的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的粗產(chǎn)物混合物中分離。在一個(gè)實(shí)施例中，所述式(vi)化合物是從天然內(nèi)酯型槐糖脂的甲酸處理過(guò)程分離。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述式(vii)化合物是從酵母假絲酵母菌(candidabombicola)的培養(yǎng)物分離。在另一個(gè)實(shí)施例中，r是選自未經(jīng)取代的c1-c24烷基、經(jīng)取代的c1-c24烷基、未經(jīng)取代的c2-c24烯基和經(jīng)取代的c2-c24烯基的脂肪族部分。在另一個(gè)實(shí)施例中，r是選自經(jīng)羥基取代的c1-c24烷基和經(jīng)羥基取代的c2-c24烯基的脂肪族部分。在又另一個(gè)實(shí)施例中，r是選自經(jīng)羧基取代的c1-c24烷基和經(jīng)羧基取代的c2-c24烯基的脂肪族部分。在另一個(gè)實(shí)施例中，r是選自經(jīng)芳香族基團(tuán)取代的c1-c24烷基和經(jīng)芳香族基團(tuán)取代的c2-c24烯基的脂肪族部分。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述式(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)和(vii)化合物包含：

其中rd是h或c(o)ch3；

re是h或c(o)ch3；

rf是h或c(o)ch3；

且rg是h或c(o)ch3。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于產(chǎn)生一或多種式(i)、式(ii)、式(iii)、式(iv)或式(v)化合物的方法，所述方法包含提供二糖；和使所述二糖與乙烯酯在脂肪酶存在下在溶劑系統(tǒng)中接觸。在一個(gè)實(shí)施例中，所述二糖包含乳糖、槐糖、纖維二糖、麥芽糖或異麥芽糖。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述脂肪酶包含novozyme435、lipozymetl、lipozymerm或amano脂肪酶ps。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述乙烯酯包含乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、肉桂酸乙烯酯、甲基丙烯酸乙烯酯、油酸乙烯酯、亞油酸乙烯酯、棕櫚酸乙烯酯或硬脂酸乙烯酯。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述溶劑系統(tǒng)包含與叔戊醇、叔丁醇、四氫呋喃、丙酮、甲醇或乙腈混合的極性溶劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述極性溶劑包含二甲亞砜(dmso)、吡啶或二甲基甲酰胺(dmf)。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述方法還包含加熱到40℃至100℃之間的溫度。在又另一個(gè)實(shí)施例中，所述方法還包含進(jìn)行真空蒸餾以去除所述溶劑系統(tǒng)和分離相關(guān)產(chǎn)物。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于產(chǎn)生一或多種式(i)、式(ii)、式(iii)、式(iv)或式(v)化合物的方法，其是通過(guò)適當(dāng)?shù)亩桥c合適的乙烯酯在溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行酸或堿催化的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)來(lái)進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施例中，所述堿是碳酸鉀(k2co3)、氫氧化鈉(naoh)或氫氧化鉀(koh)。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述酸是硫酸(h2so4)或鹽酸(hcl)。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述乙烯酯包含乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、肉桂酸乙烯酯、甲基丙烯酸乙烯酯、油酸乙烯酯、亞油酸乙烯酯、棕櫚酸乙烯酯或硬脂酸乙烯酯。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述溶劑系統(tǒng)包含例如二甲亞砜(dmso)、吡啶或二甲基甲酰胺(dmf)等極性溶劑。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于產(chǎn)生一或多種式(vi)化合物的方法，其包含在實(shí)質(zhì)上非水性條件下使天然內(nèi)酯型槐糖脂與甲酸或乙酸反應(yīng)；和部分或完全去除所形成的甲酸酯或乙酸酯。在一個(gè)實(shí)施例中，所述第二種酸催化天然槐糖脂與甲酸或乙酸的反應(yīng)。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述第二種酸包含硫酸(h2so4)或鹽酸(hcl)。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述天然槐糖脂是由發(fā)酵宿主產(chǎn)生。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述發(fā)酵宿主是假絲酵母菌。在一個(gè)實(shí)施例中，所述實(shí)質(zhì)上非水性條件包含水含量不超過(guò)約10％的反應(yīng)混合物。另一個(gè)實(shí)施例還包含在所述部分或完全去除所形成的甲酸酯或乙酸酯步驟之前在40℃至120℃之間的溫度下進(jìn)行加熱的步驟。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述去除甲酸酯包含在乙酸和甲醇中回流。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述去除乙酸酯包含用酸或堿進(jìn)行處理。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于由發(fā)酵宿主產(chǎn)生一或多種式(vii)化合物的方法。在一個(gè)實(shí)施例中，所述發(fā)酵宿主是假絲酵母菌。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述式(vii)和(viia)化合物是從得自于假絲酵母菌培養(yǎng)物的粗混合物分離。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于產(chǎn)生槐糖的方法，其包含使天然槐糖苷與甲酸在實(shí)質(zhì)上非水性條件下反應(yīng)和完全去除所形成的甲酸酯，其中獲得了經(jīng)過(guò)純化的槐糖。在一個(gè)實(shí)施例中，所述天然槐糖苷是甜菊苷、槐糖脂和類黃酮槐糖苷。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述使天然槐糖苷與甲酸反應(yīng)步驟是由第二種酸催化。在一個(gè)實(shí)施例中，所述第二種酸包含硫酸(h2so4)或鹽酸(hcl)。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述實(shí)質(zhì)上非水性條件包含水含量不超過(guò)約10％的反應(yīng)混合物。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述方法還包含在所述完全去除甲酸酯步驟之前在40℃至120℃之間的溫度下進(jìn)行加熱的步驟。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述完全去除甲酸酯步驟包含在溶劑中用堿進(jìn)行處理。在一個(gè)實(shí)施例中，所述堿是甲醇鈉(ch3nao)或氨(nh3)，且所述溶劑是甲醇或乙醇。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種具有式(ii)結(jié)構(gòu)的化合物：

其中：

ra是h或c(o)r；

rb是h或c(o)r；

rc是h或c(o)r；且

r是脂肪族部分，其限制條件是當(dāng)ra是h或c(o)ch3且rb是h或c(o)ch3時(shí)，rc是h。在一個(gè)實(shí)施例中，r是選自由以下各項(xiàng)組成的群組：未經(jīng)取代的c1-c24烷基；經(jīng)羥基、羧基或芳香族基團(tuán)取代的c1-c24烷基；未經(jīng)取代的c2-c24烯基；和經(jīng)羥基、羧基或芳香族基團(tuán)取代的c2-c24烯基。在另一個(gè)實(shí)施例中，r是選自未經(jīng)取代的c1-c24烷基、經(jīng)取代的c1-c24烷基、未經(jīng)取代的c2-c24烯基和經(jīng)取代的c2-c24烯基的脂肪族部分。在另一個(gè)實(shí)施例中，r是選自經(jīng)羥基取代的c1-c24烷基和經(jīng)羥基取代的c2-c24烯基的脂肪族部分。在另一個(gè)實(shí)施例中，r是選自經(jīng)羧基取代的c1-c24烷基和經(jīng)羧基取代的c2-c24烯基的脂肪族部分。在另一個(gè)實(shí)施例中，r是選自經(jīng)芳香族基團(tuán)取代的c1-c24烷基和經(jīng)芳香族基團(tuán)取代的c2-c24烯基的脂肪族部分。

附圖說(shuō)明

已經(jīng)闡述了本發(fā)明的新穎特征，特別是在所附權(quán)利要求書中。通過(guò)參考利用本發(fā)明原理和所附圖式闡述說(shuō)明性實(shí)施例的以下詳細(xì)描述，將能更好地理解本發(fā)明的特征和優(yōu)勢(shì)，其中：

圖1顯示用作基因表達(dá)誘導(dǎo)劑的糖酯的實(shí)例：(a)6"乙酰化乳糖單酯；(b)6'和6"乙?；?槐糖二酯；(c)6'和6"乙?；溠刻嵌ィ?d)在c-4"位置上經(jīng)18碳單不飽和脂肪醇酯化的脫乙?；?'和/或6"乙?；?槐糖酯，所述脂肪醇在脂肪醇鏈的c-17位置上被羥基化；和(e)脫乙酰化或6'和/或6"乙?；刍碧侵?。在這個(gè)圖中，rd＝h或c(o)ch3；re＝h或c(o)ch3；rf＝h或c(o)ch3；且rg＝h或c(o)ch3。

圖2顯示由對(duì)含有單不飽和脂肪酰基部分的內(nèi)酯型槐糖脂進(jìn)行甲酸處理而產(chǎn)生的兩種其它化合物的實(shí)例：(a)在9位和(b)在10位具有經(jīng)額外羥基取代的17-羥基脂肪酰基的槐糖酯。在這個(gè)圖中，rd＝h或c(o)ch3；re＝h或c(o)ch3；rf＝h或c(o)ch3；且rg＝h或c(o)ch3。

圖3描繪了用于制備糖酯的合成途徑：(a)通過(guò)化學(xué)催化或酶催化的轉(zhuǎn)酯化來(lái)制備乳糖、纖維二糖、麥芽糖和槐糖酯；和(b)通過(guò)假絲酵母菌(c.bombicola)發(fā)酵制備槐糖脂和二聚槐糖脂酯，和通過(guò)對(duì)槐糖脂進(jìn)行甲酸處理，隨后分別進(jìn)行完全和部分脫脂來(lái)制備槐糖和槐糖酯。在這個(gè)圖中，ra＝h或c(o)r；rb＝h或c(o)r；rc＝h或c(o)r；rd＝h或c(o)ch3；re＝h或c(o)ch3；rf＝h或c(o)ch3；且rg＝h或c(o)ch3；且r是脂肪族部分。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明涉及用成本有效的方式對(duì)例如乳糖、槐糖和麥芽糖等已知糖誘導(dǎo)劑進(jìn)行化學(xué)或生物學(xué)改性以增強(qiáng)其在生產(chǎn)工業(yè)上合乎需要的蛋白質(zhì)時(shí)的誘導(dǎo)力。通過(guò)對(duì)二糖酯，特別是呈可溶性單酯、二酯和三酯形式的二糖酯進(jìn)行改性，將乳糖、槐糖和麥芽糖的誘導(dǎo)力增強(qiáng)若干倍。可以比當(dāng)前可能的產(chǎn)率更高的產(chǎn)率誘導(dǎo)在合適的啟動(dòng)子的控制下得以顯著改良的纖維素酶、淀粉酶或其它蛋白質(zhì)的產(chǎn)率。本發(fā)明有可能通過(guò)改良制造工廠的生產(chǎn)率和操作邏輯而顯著影響當(dāng)前的酶生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)學(xué)。

本發(fā)明還涉及一種用于由天然內(nèi)酯型槐糖脂并且使用新穎槐糖脂二聚物酯化合物作為高效誘導(dǎo)劑來(lái)生產(chǎn)新穎而且具有高度誘導(dǎo)性的槐糖酯的更有效方法。由于這類新化合物容易制備，故可以生產(chǎn)容易使用且工業(yè)水適用的誘導(dǎo)劑，所述誘導(dǎo)劑也是高效而且成本有效的。此外，還描述了由例如甜菊苷和槐糖脂等天然槐糖苷生產(chǎn)槐糖的更有效方法。

糖酯

通過(guò)根據(jù)本發(fā)明方法進(jìn)行未改性二糖與乙烯酯的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)來(lái)生產(chǎn)乳糖、槐糖、纖維二糖、麥芽糖或異麥芽糖單酯或二酯化合物。圖1a至1c描繪了可由根據(jù)本發(fā)明方法進(jìn)行二糖與乙酸乙烯酯的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)以化學(xué)或酶方式產(chǎn)生的三種例示性二糖單乙酸酯或二乙酸酯。圖1a顯示了乳糖單乙酸酯，而圖1b描繪了槐糖二乙酸酯。圖1c顯示了麥芽糖二乙酸酯。所有三種化合物都在6'和/或6"位置上被酯化。

在另一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)甲酸或乙酸與天然內(nèi)酯型槐糖脂在非水性條件下反應(yīng)，產(chǎn)生甲酰或乙酰受保護(hù)而且c-1'環(huán)開(kāi)放的槐糖脂來(lái)產(chǎn)生槐糖酯。在這之后由經(jīng)過(guò)處理的槐糖脂部分或完全裂解甲酸酯或乙酸酯。還可能存在例如未改性槐糖脂和高級(jí)酯(ds>3的酯)等其它副產(chǎn)物。圖1d描繪了在c-4"位置上經(jīng)18碳單不飽和脂肪醇酯化的脫乙酰化或6'和/或6"乙?；?槐糖酯，所述脂肪醇在脂肪醇鏈的c-17位置上被羥基化。通過(guò)以硫酸催化天然二乙?；瘍?nèi)酯型槐糖脂(獲自假絲酵母菌培養(yǎng)物)的甲酸反應(yīng)，隨后通過(guò)在乙酸和甲醇混合物中對(duì)底物進(jìn)行加熱或回流而由經(jīng)過(guò)處理的母體化合物裂解甲酸酯來(lái)產(chǎn)生所述化合物。硫酸是廉價(jià)而且容易獲得的催化劑。甲酸還可以參與跟在脂肪?；糠稚虾胁伙柡投鹊膬?nèi)酯型槐糖脂的加成反應(yīng)，且可能在甲酸酯裂解后在不飽和位置上形成羥基。圖2中提供了由對(duì)9位置上含有單不飽和18碳脂肪酰基部分的內(nèi)酯型槐糖脂進(jìn)行甲酸處理產(chǎn)生的兩種例示性產(chǎn)物。圖2a和圖2b分別描繪了具有在9位置和10位置上經(jīng)額外羥基取代的17-羥基脂肪酸的槐糖脂酯。

在另一個(gè)方面，通過(guò)使用本發(fā)明方法，由酵母假絲酵母菌產(chǎn)生槐糖二聚物。所述化合物可以從假絲酵母菌粗培養(yǎng)物分離，其中其它副產(chǎn)物可由天然乙酰化內(nèi)酯型槐糖脂或酸性槐糖脂組成。圖1e描繪了在c-4"位置上以18碳單不飽和脂肪鏈酯化的脫乙?；?'和/或6"乙?；碧侵畚秕ァＭㄟ^(guò)使用葡萄糖和芥花籽油作為原料對(duì)假絲酵母菌進(jìn)行發(fā)酵來(lái)產(chǎn)生所述化合物。

由本發(fā)明方法產(chǎn)生的乳糖、槐糖、纖維二糖、麥芽糖、異麥芽糖酯、槐糖酯(獲自天然內(nèi)酯型槐糖脂的甲酸處理)和槐糖脂二聚物分別具有由式(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)和(vii)所描繪的結(jié)構(gòu)：

其中ra是h或c(o)r；

rb是h或c(o)r；

rc是h或c(o)r；

rd是h或c(o)ch3；

re是h或c(o)ch3；

rf是h或c(o)ch3；

rg是h或c(o)ch3；且

r是脂肪族部分，其限制條件是在式(ii)中，當(dāng)ra是h或c(o)ch3且rb是h或c(o)ch3時(shí)，rc是h。

在一些實(shí)施例中，r是選自未經(jīng)取代的c1-c24烷基、經(jīng)取代的c1-c24烷基、未經(jīng)取代的c2-c24烯基和經(jīng)取代的c2-c24烯基的脂肪族部分。

在其它實(shí)施例中，r是選自經(jīng)羥基取代的c1-c24烷基和經(jīng)羥基取代的c2-c24烯基的脂肪族部分。

在其它實(shí)施例中，r是選自經(jīng)羧基取代的c1-c24烷基和經(jīng)羧基取代的c2-c24烯基的脂肪族部分。

在某些實(shí)施例中，r是選自經(jīng)芳香族基團(tuán)取代的c1-c24烷基和經(jīng)芳香族基團(tuán)取代的c2-c24烯基的脂肪族部分。

在一些實(shí)施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的酯具有式(ia)、(iia)、(iiia)、(iva)、(va)、(via)或(viia)化合物所描繪的結(jié)構(gòu)：

其中rd是h或c(o)ch3；re是h或c(o)ch3；rf是h或c(o)ch3；且rg是h或c(o)ch3。

在另一個(gè)實(shí)施例中，所述槐糖酯是具有式(ii)結(jié)構(gòu)的新穎化合物：

其中：

ra是h或c(o)r；

rb是h或c(o)r；

rc是h或c(o)r；且

r是脂肪族部分，其限制條件是當(dāng)ra是h或c(o)ch3且rb是h或c(o)ch3時(shí)，rc是h。

如本文中所使用，“脂肪族部分”是非芳香族碳部分。在一些實(shí)施例中，脂肪族部分可以包括直鏈、分支鏈或環(huán)狀碳部分。在某些實(shí)施例中，脂肪族部分可以包括飽和或不飽和的部分，包括單價(jià)和二價(jià)部分。在一些實(shí)施例中，所述脂肪族部分是脂肪族烷基、脂肪族烯基、脂肪族炔基、脂肪族環(huán)烷基、脂肪族環(huán)烯基、脂肪族環(huán)炔基或其任何二價(jià)基團(tuán)。

“烷基”包括當(dāng)未經(jīng)取代時(shí)僅含有碳和氫原子的飽和直鏈或分支鏈烴結(jié)構(gòu)和這些結(jié)構(gòu)的組合。在一些實(shí)施例中，烷基具有1至24個(gè)碳原子(即，c1-c24烷基)、5至24個(gè)碳原子(即，c5-c24烷基)或15至18個(gè)碳原子(即，c15-c18烷基)。當(dāng)命名具有特定碳原子數(shù)的烷基殘基時(shí)，可涵蓋具有所述碳原子數(shù)的所有幾何異構(gòu)體。舉例來(lái)說(shuō)，在一些實(shí)施例中，“丁基”可包括正丁基、仲丁基、異丁基和叔丁基；在一些實(shí)施例中，“丙基”可包括正-丙基和異丙基。在一些實(shí)施例中，烷基可能經(jīng)取代。在一個(gè)實(shí)施例中，經(jīng)取代的烷基可以具有羥基取代基。經(jīng)羥基取代的烷基可以包括例如-(ch2)2oh和-(ch2)4oh。在另一個(gè)實(shí)施例中，經(jīng)取代的烷基可以具有羧基取代基。經(jīng)羧基取代的烷基可以包括例如-(ch2)2cooh。在另一個(gè)實(shí)施例中，經(jīng)取代的烷基可以具有芳香族取代基。經(jīng)芳香族取代的烷基可以包括例如-ch2(苯基)。

“環(huán)烷基”是指環(huán)狀烷基，并且可具有一個(gè)環(huán)(例如環(huán)己基)或多個(gè)環(huán)(例如金剛烷基)。

“亞烷基”是指與烷基相同但具有二價(jià)的殘基。亞烷基的實(shí)例包括亞甲基(-ch2-)、亞乙基(-ch2ch2-)、亞丙基(-ch2ch2ch2-)、亞丁基(-ch2ch2ch2ch2-)，以及更長(zhǎng)的鏈，包括-(ch2)17-。

“烯基”是指具有至少一個(gè)烯系不飽和位點(diǎn)(即，具有至少一個(gè)式-c＝c-的部分)的不飽和烴基。當(dāng)烯基具有一個(gè)烯系不飽和位點(diǎn)時(shí)，烯基是單不飽和型。當(dāng)烯基具有兩個(gè)或兩個(gè)以上烯系不飽和位點(diǎn)時(shí)，烯基是多不飽和型。在一些實(shí)施例中，烯基具有2至24個(gè)碳原子(即，c2-c24烯基)、5至24個(gè)碳原子(即，c5-c24烯基)或15至18個(gè)碳原子(即，c15-c18烯基)。烯基可以包括例如-ch2-ch＝ch-ch3和-(ch2)7-ch＝ch-(ch2)7-ch3。在一些實(shí)施例中，烯基可能經(jīng)取代。在一個(gè)實(shí)施例中，經(jīng)取代的烯基可以具有羥基取代基。經(jīng)羥基取代的烯基可以包括例如-(ch2)2oh和-(ch2)4oh。在另一個(gè)實(shí)施例中，經(jīng)取代的烯基可以具有羧基取代基。經(jīng)羧基取代的烯基可以包括例如-(ch2)2cooh。在另一個(gè)實(shí)施例中，經(jīng)取代的烯基可以具有芳香族取代基。經(jīng)芳香族取代的烯基可以包括例如-ch2(苯基)。

“環(huán)烯基”是指環(huán)狀烯基，并且可具有一個(gè)環(huán)(例如環(huán)己烯基、-ch2-ch2-環(huán)己烯基)或多個(gè)環(huán)(例如降冰片烯基)。

“亞烯基”是指與烯基相同但具有二價(jià)的殘基。亞烯基的實(shí)例包括亞乙基(-ch＝ch-)、亞丙基(-ch2-ch＝ch-)、亞丁基(-ch2-ch＝ch-ch2-)，以及更長(zhǎng)的鏈，包括-(ch2)7-ch＝ch-(ch2)8-和-(ch2)7-ch＝ch-(ch2)6-ch＝ch-。

除非另有規(guī)定，否則以具有式(i)至(vii)和(ia)至(viia)的結(jié)構(gòu)描繪的本發(fā)明糖酯具有以下糖苷鍵：式(i)、(ia)，乳糖(gal(β1,4)glc)；式(ii)、(iia)，槐糖(glc(β1,2)glc)；式(iii)、(iiia)，纖維二糖(glc(β1,4)glc)；式(iv)、(iva)，麥芽糖(glc(α1,4)glc)；式(v)、(va)，異麥芽糖(glc(α1,6)glc)；式(vi)、(via)，槐糖(glc(β1,2)glc)；和式(vii)、(viia)，槐糖(glc(β1,2)glc)。

糖酯的用途

可以使用由本文中所描述的方法產(chǎn)生的一或多種糖酯或其任何組合物作為誘導(dǎo)劑，與細(xì)胞在不存在所述誘導(dǎo)劑時(shí)將會(huì)產(chǎn)生的相比，所述誘導(dǎo)劑引起細(xì)胞產(chǎn)生大量的酶或其它物質(zhì)。可以使用由本發(fā)明方法產(chǎn)生的經(jīng)過(guò)分離和純化的糖酯作為誘導(dǎo)劑，或可以使用含有糖酯的粗反應(yīng)混合物作為誘導(dǎo)劑而不進(jìn)行進(jìn)一步純化。

在一個(gè)方面，可以使用由本文中所描述的本發(fā)明方法產(chǎn)生的一或多種糖酯或其任何組合物以便在含有適當(dāng)碳源的液體培養(yǎng)基中在能夠產(chǎn)生纖維素酶或淀粉酶的發(fā)酵宿主生物體中誘導(dǎo)蛋白質(zhì)產(chǎn)生(例如，纖維素酶或淀粉酶產(chǎn)生)。舉例來(lái)說(shuō)，在某些實(shí)施例中，可以使用一或多種具有式(i)至(vii)的結(jié)構(gòu)的糖酯或其任何組合物來(lái)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)產(chǎn)生。這種生物體的實(shí)例包括絲狀真菌，其能夠通過(guò)產(chǎn)生能水解纖維素的β-(1,4)-連接糖苷鍵或淀粉的α-(1,4)-連接糖苷鍵以產(chǎn)生葡萄糖的纖維素酶或淀粉酶來(lái)代謝纖維素或淀粉。

合適的絲狀真菌可包括亞門真菌門的所有絲狀形式。(參見(jiàn)阿歷斯波爾c.j.(alexopoulos,c.j.)(1962),菌物學(xué)概論(introductorymycology),威立出版社(wiley),紐約(newyork))。這些真菌通常以營(yíng)養(yǎng)菌絲體為特征，其中細(xì)胞壁由甲殼素、纖維素和其它復(fù)合多糖構(gòu)成。用于與本發(fā)明的糖酯誘導(dǎo)劑一起使用的絲狀真菌或細(xì)菌或其它宿主的合適物種包括例如選自以下各屬的宿主：木霉屬、腐殖菌屬、側(cè)耳菌屬、鐮刀菌屬、曲霉屬、鏈霉屬、嗜熱單孢霉屬、牙胞桿菌屬、纖維桿菌屬、青霉屬、擔(dān)子菌屬、金孢屬、擬盤多毛孢屬、脈孢菌屬、頭孢霉屬、綿霉屬、柄孢殼菌屬、內(nèi)座殼屬、毛霉屬、旋孢腔菌屬、毀絲霉屬、籃狀菌屬和梨孢菌屬。具體的宿主可以包括例如里氏木霉(qm9414、mcg77、mcg80、rut-c30、cl-847、vtt-d、svg和rl-p37)(參見(jiàn)艾斯特鮑爾(esterbauer)等人,bioresourcetech.,36(1):51-65,(1991))、黑曲霉、米曲霉(aspergillusoryzae)、枯草桿菌(bacillussubtilis)、斜臥青霉(penicilliumdecumbens)、繩狀青霉(penicilliumfuniculosum)、產(chǎn)紫青霉、金孢子菌屬lucknowense、嗜熱毀絲霉和埃默森籃狀菌(talaromycesemersonii)。

在一些實(shí)施例中，使用由本發(fā)明方法產(chǎn)生的糖酯中的一或多種或其任何組合物在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)蛋白質(zhì)產(chǎn)生(例如纖維素酶或淀粉酶產(chǎn)生)，所述宿主細(xì)胞是木霉屬、青霉屬、金孢子菌屬、腐殖菌屬、側(cè)耳屬、鐮刀菌屬、曲霉屬、鏈霉屬、嗜熱單孢霉屬、毀絲霉屬、籃狀菌屬、牙胞桿菌屬或纖維桿菌屬的成員。在某些實(shí)施例中，使用一或多種糖酯或其任何組合物在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)蛋白質(zhì)產(chǎn)生(例如纖維素酶或淀粉酶產(chǎn)生)，所述宿主細(xì)胞是木霉屬或曲霉屬的成員。在一個(gè)實(shí)施例中，使用一或多種糖酯或其任何組合物在里氏木霉、綠色木霉(trichodermaviride)、黑曲霉或米曲霉中誘導(dǎo)蛋白質(zhì)產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)“木霉屬”是指先前或當(dāng)前被分類為木霉屬的任何真菌屬。在某些實(shí)施例中，糖酯是一或多種具有式(i)至(vii)的結(jié)構(gòu)或優(yōu)選地具有式(ia)至(viia)的結(jié)構(gòu)的酯。

對(duì)于工業(yè)酶生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，典型地使用例如乳糖、纖維二糖、纖維素、纖維素水解物、淀粉水解物和槐糖等得自于葡萄糖逆化的常規(guī)誘導(dǎo)劑在里氏木霉中誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)，而麥芽糖、麥芽糊精、淀粉和淀粉水解物是選擇用于曲霉屬的誘導(dǎo)劑。在一些情況下，這些誘導(dǎo)劑由于量不足或無(wú)意中受雜質(zhì)或代謝物阻遏而不能表現(xiàn)得最佳。相對(duì)于單獨(dú)常規(guī)誘導(dǎo)劑可達(dá)成的蛋白質(zhì)表達(dá)，用本文中所公開(kāi)的誘導(dǎo)劑補(bǔ)充常規(guī)誘導(dǎo)劑可增加蛋白質(zhì)表達(dá)。因此，使用本發(fā)明的誘導(dǎo)劑可單獨(dú)或者與彼此或與常規(guī)誘導(dǎo)劑組合使用。

在一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)加入具有圖1d和圖2a和2b中所示的結(jié)構(gòu)的槐糖酯來(lái)加強(qiáng)乳糖對(duì)木霉屬的誘導(dǎo)作用。在另一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)加入具有圖1d和圖2a和2b中所示的結(jié)構(gòu)的槐糖酯來(lái)加強(qiáng)含有槐糖的葡萄糖逆化混合物對(duì)木霉屬的誘導(dǎo)作用。在又另一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)加入具有圖1d和圖2a和2b中所示的結(jié)構(gòu)的槐糖酯來(lái)加強(qiáng)生物質(zhì)水解物(例如纖維素、淀粉)對(duì)木霉屬的誘導(dǎo)作用。在另一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)用具有式iv和圖1c所描繪的結(jié)構(gòu)的麥芽糖酯補(bǔ)充誘導(dǎo)劑混合物來(lái)增強(qiáng)麥芽糖或麥芽糊精對(duì)曲霉屬蛋白質(zhì)表達(dá)的誘導(dǎo)作用。

在另一個(gè)實(shí)施例中，可使用具有式ii、vi和vii的結(jié)構(gòu)的槐糖酯在固相發(fā)酵中誘導(dǎo)增強(qiáng)的蛋白質(zhì)產(chǎn)生。使用固相發(fā)酵生產(chǎn)酶和其它蛋白質(zhì)產(chǎn)物依賴于微生物(特別是絲狀真菌)在無(wú)自由流動(dòng)液體的潮濕固體底物上的生長(zhǎng)。與液體深層發(fā)酵相反，固相發(fā)酵在一些情形下在性能和生產(chǎn)成本兩方面都可提供顯著優(yōu)勢(shì)。合適的固體底物包括容易獲得而且廉價(jià)的基于例如麥麩或玉米芯或其混合物等農(nóng)業(yè)殘余物的碳源。用于本實(shí)施例的合適的絲狀真菌已描述于上文中，并且包括里氏木霉和黑曲霉。

用適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基潤(rùn)濕固體底物直到達(dá)到40％、50％、60％或70％的起始水分含量，以允許真菌在底物上生長(zhǎng)。在使用前，可通過(guò)用蒸汽和所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理來(lái)活化這些固體底物。將粗制的或經(jīng)過(guò)純化的槐糖酯混入固體底物中，并且通過(guò)接種含合適絲狀真菌的適當(dāng)制備的培養(yǎng)物的混合物來(lái)起始發(fā)酵。然后利用所屬領(lǐng)域中已知的方法從所述混合物分離所得產(chǎn)物，例如酶，例如纖維素酶。典型分離涉及用液體洗滌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。在一些情況下，可以壓制固體底物和/或可以向洗滌液中加入洗滌劑以提高效率。在一些應(yīng)用(例如動(dòng)物飼料)中，不分離酶且將其依照產(chǎn)生原樣與固體底物一起使用。

還應(yīng)理解，本文中所描述的糖酯或其任何組合物可與經(jīng)過(guò)基因工程改造的宿主細(xì)胞一起使用。為了用重組dna技術(shù)產(chǎn)生蛋白質(zhì)，可以構(gòu)筑包括編碼指定蛋白質(zhì)的氨基酸序列的核酸的dna構(gòu)筑體，并且轉(zhuǎn)移到例如里氏木霉、黑曲霉或米曲霉宿主細(xì)胞中。載體可以是所屬領(lǐng)域中已知的任何載體，當(dāng)被引入到宿主細(xì)胞中時(shí)，其可以被并入宿主細(xì)胞基因組中并且可以被復(fù)制。編碼蛋白質(zhì)的核酸可以可操作地連接到合適的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子在木霉屬或曲霉屬宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性。合適的啟動(dòng)子可以包括例如纖維二糖水解酶1(cbh1)、內(nèi)切葡聚糖酶、木聚糖酶、葡糖淀粉酶a(glaa)和高峰淀粉酶(amya)。在一個(gè)例示性實(shí)施例中，本文中所描述的具有式(i)、(ii)、(iii)、(vi)、(vii)的結(jié)構(gòu)的糖酯或其任何組合物可以是木霉屬中的cbh1啟動(dòng)子的強(qiáng)力誘導(dǎo)劑，與其它已知纖維素酶誘導(dǎo)劑相比，其可以使纖維素酶產(chǎn)生增加若干倍。在另一個(gè)例示性實(shí)施例中，本文中所描述的具有式(iv)或(v)的結(jié)構(gòu)的糖酯或其任何組合物可以是曲霉屬中的glaa或amya啟動(dòng)子的強(qiáng)力誘導(dǎo)劑，與其它已知淀粉酶誘導(dǎo)劑相比，其可以使淀粉酶產(chǎn)生增加若干倍。

然而，應(yīng)理解，本文中所描述的糖酯或其任何組合物可以在例如cbh1或glaa等天然或經(jīng)工程改造啟動(dòng)子的控制下誘導(dǎo)蛋白質(zhì)產(chǎn)生。所述啟動(dòng)子可以源自于編碼可與宿主細(xì)胞同源或異源的蛋白質(zhì)的基因。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，啟動(dòng)子可以經(jīng)工程改造以增強(qiáng)其功能，并且這種新誘導(dǎo)劑的適用性不會(huì)因其變化而受限制。在這種啟動(dòng)子控制下的同源或異源蛋白質(zhì)表達(dá)可以使用所屬領(lǐng)域中已知的重組分子生物學(xué)技術(shù)用常規(guī)方式進(jìn)行，這可能依賴于編碼相關(guān)蛋白質(zhì)的基因的成功重組。相關(guān)同源和異源蛋白質(zhì)的實(shí)例包括例如酶、激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、疫苗、抗體和多肽。在一些實(shí)施例中，本文中所描述的糖酯可誘導(dǎo)酶產(chǎn)生，所述酶包括例如纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、酯酶、植酸酶、果膠酶、過(guò)氧化氫酶、支鏈淀粉酶、漆酶、氧化酶、葡萄糖異構(gòu)酶、裂解酶、酰化酶和轉(zhuǎn)移酶。

用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的發(fā)酵程序?qū)τ谒鶎兕I(lǐng)域的技術(shù)人員一般是已知的。一般來(lái)說(shuō)，在含有生理鹽和營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。(參見(jiàn)例如普爾基耶j.(pourquie,j.)等人,纖維素降解的生物化學(xué)與基因?qū)W(biochemistryandgeneticsofcellulosedegradation),奧伯特j.p.(aubert,j.p.)等人編,學(xué)術(shù)出版社(academicpress),第71-86頁(yè),1988；和伊爾門m.(ilmen,m.)等人,應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)(appl.environ.microbiol.),63:1298-1306(1997)。舉例來(lái)說(shuō)，可以分別如英格蘭(england)等人(美國(guó)公開(kāi)專利申請(qǐng)案第2010/0009408號(hào))和巴頓等人(細(xì)菌學(xué)雜志),111(3):771-777(1972))所描述在培養(yǎng)基中培養(yǎng)木霉屬和曲霉屬細(xì)胞。培養(yǎng)條件(例如溫度、ph值、持續(xù)時(shí)間)在所屬領(lǐng)域中一般也是已知的。舉例來(lái)說(shuō)，可以在振蕩培養(yǎng)物或發(fā)酵器中的適當(dāng)培養(yǎng)基中在大約28℃下培育培養(yǎng)物，直到達(dá)到所需要的纖維素酶表達(dá)水平。在已經(jīng)確定真菌生長(zhǎng)之后，將細(xì)胞暴露于能有效引起或允許蛋白質(zhì)表達(dá)的條件。還在培養(yǎng)基中提供適當(dāng)?shù)奶荚?。適當(dāng)碳源生物質(zhì)的實(shí)例包括但不限于葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油、乳糖、纖維素、纖維素水解物、淀粉、淀粉水解物、麥芽糖或麥芽糊精。

可以能有效誘導(dǎo)蛋白質(zhì)產(chǎn)生(例如纖維素酶或淀粉酶產(chǎn)生)的濃度向培養(yǎng)基中加入本文中所描述的糖酯中的一或多者或其任何組合物。還可以向培養(yǎng)基中加入呈不溶或可溶形式的酯。在某些實(shí)施例中，可在引入發(fā)酵培養(yǎng)物中作為培養(yǎng)基組分或作為誘導(dǎo)進(jìn)料之前在水或一或多種溶劑(例如乙醇或二甲亞砜)中將糖酯復(fù)原。在工業(yè)分批進(jìn)料發(fā)酵過(guò)程中，溶解誘導(dǎo)劑允許其作為濃縮進(jìn)料用于蛋白質(zhì)產(chǎn)生。此外，應(yīng)理解，糖酯誘導(dǎo)劑可以用于分批、分批進(jìn)料或連續(xù)發(fā)酵過(guò)程。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與例如乳糖、槐糖、麥芽糖或天然槐糖脂等未改性起始材料相比，使用一或多種本文中所描述的糖酯令人驚訝地使纖維素酶或淀粉酶產(chǎn)生增加若干倍。在某些實(shí)施例中，使用一或多種糖酯或其任何組合物可以使木霉屬宿主(例如里氏木霉)中的纖維素酶產(chǎn)生或曲霉屬宿主(例如黑曲霉)中的淀粉酶產(chǎn)生增加為未改性乳糖或槐糖的至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少十倍、至少二十倍或至少三十倍。在某些實(shí)施例中，糖酯是一或多種具有式(i)至(vii)的結(jié)構(gòu)或優(yōu)選地具有式(ia)至(viia)的結(jié)構(gòu)的酯。

盡管由本發(fā)明方法產(chǎn)生的糖酯可以呈含有其它副產(chǎn)物的粗反應(yīng)混合物形式直接用于誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)，但也應(yīng)該理解，可以個(gè)別地分離或離析粗混合物的活性糖酯組分并且任選地進(jìn)行進(jìn)一步純化。舉例來(lái)說(shuō)，在一些實(shí)施例中，可以分離一或多種具有式(i)至(vii)的結(jié)構(gòu)或優(yōu)選地具有式(ia)至(viia)的結(jié)構(gòu)的酯以用于蛋白質(zhì)產(chǎn)生。在一些實(shí)施例中，使用從粗酯混合物中分離的經(jīng)過(guò)純化的乳糖單酯或槐糖二酯可以使木霉屬中的纖維素酶產(chǎn)生與使用未純化粗混合物相比增加至少一倍、至少兩倍或至少三倍。應(yīng)理解，未改性乳糖或槐糖是制備乳糖酯和槐糖酯的乳糖或槐糖。

選擇本說(shuō)明書中的實(shí)施例以便最好地解釋本發(fā)明的原理和其在所描述條件下的實(shí)際使用(可能未經(jīng)優(yōu)化)。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，可以通過(guò)方法條件變化和對(duì)產(chǎn)生宿主進(jìn)行的變化來(lái)增強(qiáng)這些新穎誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)力。本發(fā)明的適用性不會(huì)因這些變化而受限制。

制備糖酯的方法

本文中提供了通過(guò)未改性二糖與乙烯酯的酶催化或化學(xué)催化轉(zhuǎn)酯化來(lái)產(chǎn)生乳糖、槐糖、纖維二糖、麥芽糖和異麥芽糖酯的方法。所屬領(lǐng)域中已知若干種用于酯化糖類的方法，包括例如化學(xué)或酶促合成蔗糖酯(波拉特(polat)和林哈特(linhardt),表面活性劑與洗滌劑雜志(j.surfact.deterg.),4(4):415-421(2001))、酶促合成麥芽糖單月桂酸酯(普盧(plou)等人,生物技術(shù)雜志(j.biotech.),96:55-66(2002))和乳糖單月桂酸酯(美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)案第2011/0257108號(hào))和化學(xué)合成麥芽糖單硬脂酸酯(艾倫(allen)和陶(tao),表面活性劑與洗滌劑雜志,5(3):245-255(2002))。

通過(guò)以下方式制備一或多種式(i)至(v)化合物：a)提供優(yōu)選無(wú)水且優(yōu)選具有高純度的二糖，例如乳糖、槐糖、纖維二糖、麥芽糖或異麥芽糖；和b)使所述二糖與乙烯酯和酶或化學(xué)催化劑在合適的溶劑系統(tǒng)中接觸以產(chǎn)生所述組合物。在一些實(shí)施例中，將反應(yīng)混合物加熱到40℃至100℃的溫度。在其它實(shí)施例中，酸水解可以在至少40℃、至少50℃、至少60℃、至少70℃、至少80℃、至少90℃或至少100℃溫度下進(jìn)行。在又另一個(gè)實(shí)施例中，所述用于產(chǎn)生包括一或多種式(i)至(v)化合物的組合物的方法還包括進(jìn)行真空蒸餾以去除溶劑；和從所述組合物分離相關(guān)產(chǎn)物。

乙烯酯可以是脂肪酸乙烯酯或芳香族乙烯酯。合適的脂肪酸乙烯酯包括乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、甲基丙烯酸乙烯酯、油酸乙烯酯、亞油酸乙烯酯、棕櫚酸乙烯酯和硬脂酸乙烯酯。芳香族乙烯酯的實(shí)例包括肉桂酸乙烯酯和咖啡酸乙烯酯。

用于本發(fā)明方法中的合適的脂肪酶包括novozyme435(經(jīng)過(guò)固定的南極假絲酵母(candidaantarctica)脂肪酶b)、tl、rm和amano脂肪酶ps。

在一些實(shí)施例中，可以用化學(xué)催化劑(例如碳酸鉀(k2co3)、氫氧化鈉(naoh)、硫酸(h2so4)和鹽酸(hcl))置換酶催化劑，并且可以用酰氯(例如乙酰氯或棕櫚酰氯)置換乙烯酯。

合適的溶劑包括二甲亞砜(dmso)、吡啶、二甲基甲酰胺(dmf)、甲基乙基酮、異丁醇、叔戊醇、叔丁醇、四氫呋喃、丙酮或其混合物。

在一個(gè)方面，本文中所描述的方法涉及通過(guò)與乙烯酯進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)對(duì)二糖進(jìn)行酶改性或化學(xué)改性。這些經(jīng)改性二糖酯對(duì)絲狀真菌宿主細(xì)胞(例如木霉屬或曲霉屬)中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生(例如纖維素酶或淀粉酶產(chǎn)生)具有高度誘導(dǎo)性，超過(guò)了未改性起始材料的誘導(dǎo)能力若干倍。

本文中所描述的方法典型地產(chǎn)生由作為組分的活性糖酯組成的粗混合物。所屬領(lǐng)域中已知的任何分離技術(shù)都可以用于分離活性酯，例如真空蒸餾、沉淀、結(jié)晶、溶劑提取或柱色譜法。

所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，可以按照本發(fā)明的精神進(jìn)行許多變化。在某些實(shí)施例中，可以使用與本發(fā)明中所公開(kāi)的原理相同的原理將其它二糖和可溶性多糖改性成有效誘導(dǎo)劑。其它二糖的實(shí)例包括蔗糖、海藻糖、龍膽二糖、昆布二糖和木二糖。多糖的實(shí)例包括纖維糊精和麥芽糊精。

本文中還提供了用于產(chǎn)生具有式(vi)的結(jié)構(gòu)的新穎而且具有高度有效性的槐糖酯的方法，所述方法是通過(guò)與天然內(nèi)酯型槐糖脂在實(shí)質(zhì)上非水性條件下進(jìn)行甲酸或乙酸反應(yīng)，隨后從受甲酰或乙酰保護(hù)且c-1'內(nèi)酯環(huán)開(kāi)放的槐糖脂上部分或完全裂解甲酸酯或乙酸酯。為了獲得具有式(vi)結(jié)構(gòu)的化合物，需要通過(guò)選擇性裂解c-1'(端基碳)位置上的醚樣鍵，隨后再生出羥基脂肪酸的羥基(保持由酯鍵連接至c-4")來(lái)對(duì)天然內(nèi)酯型槐糖脂進(jìn)行開(kāi)環(huán)(如圖1d中所示)。先前描述的用于這種轉(zhuǎn)化的方法因所獲得的產(chǎn)率較低而受限制。發(fā)明人公開(kāi)了使用0.1n鹽酸與天然槐糖脂在水性條件下產(chǎn)生這些化合物(國(guó)際申請(qǐng)案第wo2013/003291號(hào))。本發(fā)明包含高產(chǎn)率方法，其涉及在非水性條件下進(jìn)行甲酸或乙酸與天然內(nèi)酯型槐糖脂的反應(yīng)。這種新方法促進(jìn)天然內(nèi)酯型槐糖脂的醚樣鍵(c-1')優(yōu)先于酯鍵(c-4")裂解，因而獲得高產(chǎn)率。可以在對(duì)槐糖脂進(jìn)行甲酸或乙酸處理期間與開(kāi)放羥基形成非所要甲酸酯和乙酸酯，這需要裂解以便產(chǎn)生由式(vi)描述的化合物。

甲酸或乙酸反應(yīng)可以由另一種酸來(lái)催化。合適的酸催化劑的實(shí)例包括例如硫酸(h2so4)或鹽酸(hcl)，或酸催化劑混合物，其濃度(重量％)在約0.05％至約1％之間。適當(dāng)?shù)臐舛劝?.05％、0.10％、0.15％、0.20％、0.30％、0.50％、0.75％和1％。天然內(nèi)酯型槐糖脂可以由發(fā)酵宿主產(chǎn)生，包括但不限于假絲酵母菌。實(shí)質(zhì)上非水性條件可以包含以重量計(jì)不超過(guò)約10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或小于1％的水含量。

在一些實(shí)施例中，酸處理是在高溫下進(jìn)行。甲酸和乙酸處理可以分別以甲酰分解和乙酰分解反應(yīng)為特征。在某些實(shí)施例中，甲酰分解和乙酰分解可以在至少40℃的溫度下進(jìn)行。在其它實(shí)施例中，甲酰分解或乙酰分解可以在至少80℃、至少90℃、至少100℃、至少110℃或至少120℃的溫度下進(jìn)行。在其它實(shí)施例中，甲酰分解或乙酰分解可以在40℃與120℃之間或100℃與120℃之間的溫度下進(jìn)行?？梢栽诟邷叵率固烊换碧侵旌衔锱c酸接觸，持續(xù)一定范圍的時(shí)間，例如從數(shù)分鐘到數(shù)小時(shí)。

在一個(gè)實(shí)施例中，甲酸酯從內(nèi)酯開(kāi)環(huán)槐糖脂上裂解涉及在乙酸與甲醇混合物中加熱或回流起始材料。舉例來(lái)說(shuō)，乙酸與甲醇的比率可以是3:2(v/v)。在另一個(gè)實(shí)施例中，乙酸酯的裂解涉及用酸(例如hcl)或堿(例如氨)或酶(例如酯酶)處理起始材料。甲酸酯或乙酸酯從經(jīng)過(guò)處理的槐糖脂裂解可以是部分的。脂肪酰基和乙?；；w移可以在裂解期間發(fā)生。此外，在其脂肪酸?；糠稚虾袉蝹€(gè)或多個(gè)不飽和度的內(nèi)酯型槐糖脂可參與在不飽和位置上與甲酸的加成反應(yīng)，且在槐糖酯含有單不飽和或多不飽和脂肪酸部分的情況下，例如在圖2中所描述的化合物中，甲酸酯的裂解可以導(dǎo)致在不飽和位置上形成羥基。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，甲酸酯和乙酸酯的部分裂解、?；w移和不飽和度羥基化可產(chǎn)生誘導(dǎo)性可能等于或高于具有由(vi)描繪的結(jié)構(gòu)的化合物的新化合物。這種方法的適用性不因這些變化而受限制。

在另一個(gè)實(shí)施例中，首先可以用甲酸酐或乙酸酐預(yù)處理天然內(nèi)酯型槐糖脂，以產(chǎn)生在所有開(kāi)放羥基上受甲酸酯和/或乙酸酯保護(hù)的化合物。然后，在這之后進(jìn)行甲酸和乙酸處理，以便在c-1'端基位置上選擇性地裂解槐糖脂內(nèi)酯環(huán)，且隨后從羥基上部分或完全裂解甲酸酯和乙酸酯。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，這種預(yù)處理可因c-1'端基位置上的選擇性有所改良而顯著增加產(chǎn)率。

在又另一個(gè)實(shí)施例中，可以首先利用氫化反應(yīng)對(duì)天然內(nèi)酯型槐糖脂進(jìn)行預(yù)處理，以去除其脂肪?；系臐撛诓伙柡投?例如單不飽和17-羥基油酸、二不飽和17-二羥基亞油酸)。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，這種預(yù)處理可以顯著減少所產(chǎn)生的副產(chǎn)物，最終產(chǎn)物主要由具有飽和脂肪酰基的槐糖酯組成。還可以由氫化預(yù)處理獲得更便利的處理。

本文中還提供了一種用于使用由式(vii)描述的槐糖脂二聚物作為高效誘導(dǎo)劑的方法。普賴斯(price)等人(碳水化合物研究(carbohyd.res.),348:33-41(2012))最近描述了這種化合物，但普賴斯等人并未認(rèn)識(shí)到其在基因誘導(dǎo)方面的潛力。與其它已知天然槐糖脂(例如乙?；兔撘阴；瘍?nèi)酯型或酸性槐糖脂)相反，即使二聚槐糖脂以痕量存在，也能如本文中所描述在木霉屬中令人驚訝地誘導(dǎo)基因表達(dá)。用于槐糖脂二聚物的合適發(fā)酵宿主包括例如假絲酵母菌。用于這種發(fā)酵方法的適當(dāng)原料的實(shí)例包含葡萄糖和植物油，包括(但不限于)芥花籽油、大豆油、玉米油或棕櫚油。在某些實(shí)施例中，式(vii)化合物可以從假絲酵母菌培養(yǎng)物中分離為粗混合物，并且仍具有令人驚訝的強(qiáng)誘導(dǎo)作用。

本文中還提供了一種通過(guò)使甲酸與天然槐糖苷在非水性條件下反應(yīng)，隨后完全裂解不需要的甲酸酯來(lái)產(chǎn)生槐糖的方法。所屬領(lǐng)域中當(dāng)前已知若干種低產(chǎn)率方法，包括直接合成(考克森(coxon)和弗萊徹(fletcher),有機(jī)化學(xué)雜志(j.org.chem.),26(8):2892-2894(1961))、與甜菊苷八乙酸酯進(jìn)行乙酸和氫溴酸反應(yīng)隨后進(jìn)行脫乙酰化(維斯(vis)和弗萊徹,美國(guó)化學(xué)會(huì)志(j.am.chem.soc.),78:4709-4710(1956))和對(duì)甜菊苷進(jìn)行稀鹽酸處理隨后進(jìn)行純化(草壁(kusakabe)等人,農(nóng)業(yè)與生物化學(xué)(agric.biol.chem.),51(8):2255-2256(1987))。

本發(fā)明描述了一種提高槐糖產(chǎn)率的簡(jiǎn)單方法，其使用甲酸與天然槐糖苷在非水性條件下反應(yīng)，隨后裂解不需要的甲酸酯。在一個(gè)方面，槐糖苷是由作為其組分之一的槐糖組成的任何化合物。槐糖苷的實(shí)例包括甜菊苷、槐糖脂和類黃酮槐糖苷。在一個(gè)實(shí)施例中，可以用另一種酸來(lái)催化甲酸反應(yīng)。合適的酸催化劑的實(shí)例包括硫酸(h2so4)和鹽酸(hcl)，或酸催化劑混合物，其濃度(重量％)在約0.05％至約1％之間。適當(dāng)?shù)臐舛劝?.05％、0.10％、0.15％、0.20％、0.30％、0.50％、0.75％和1％。

在一個(gè)實(shí)施例中，槐糖苷是由發(fā)酵宿主產(chǎn)生的槐糖脂，所述發(fā)酵宿主包括(但不限于)假絲酵母菌。實(shí)質(zhì)上非水性條件可以包含以重量計(jì)不超過(guò)約10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或小于1％的水含量。

在一些實(shí)施例中，所述甲酸處理是在高溫下進(jìn)行。在某些實(shí)施例中，所述甲酸的酸甲酰分解可以在至少40℃的溫度下進(jìn)行。在其它實(shí)施例中，甲酰分解可以在至少80℃、至少90℃、至少100℃、至少110℃或至少120℃的溫度下進(jìn)行。在其它實(shí)施例中，甲酰分解可以在40℃與120℃之間或100℃與120℃之間的溫度下進(jìn)行?？梢栽诟邷叵率固烊换碧侵旌衔锱c甲酸接觸，持續(xù)一定范圍的時(shí)間，例如從數(shù)分鐘到數(shù)小時(shí)。

在一個(gè)實(shí)施例中，從經(jīng)過(guò)處理的槐糖苷裂解甲酸酯涉及在溶劑中用堿處理反應(yīng)混合物。合適的堿的實(shí)例包括(但不限于)甲醇鈉(ch3nao)和氨(nh3)。合適的溶劑的實(shí)例包括(但不限于)甲醇、乙醇和1-丙醇。

在另一個(gè)實(shí)施例中，首先可以用甲酸酐或乙酸酐預(yù)處理槐糖苷，以產(chǎn)生在所有開(kāi)放羥基上受甲酸酯和/或乙酸酯保護(hù)的化合物。然后，在這預(yù)處理之后進(jìn)行甲酸處理，以便在c-1'端基位置上選擇性地裂解槐糖苷，隨后從羥基上完全裂解甲酸酯和乙酸酯。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，這種預(yù)處理可由于c-1'端基位置上的選擇性有所改良而顯著增加槐糖產(chǎn)率。

在又另一個(gè)實(shí)施例中，可以在氫化反應(yīng)之后首先進(jìn)行基于槐糖苷的天然內(nèi)酯型和/或酸性槐糖脂的甲酸處理，以去除其脂肪?；系臐撛诓伙柡投?。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，這種預(yù)處理可以顯著減少所產(chǎn)生的副產(chǎn)物，且由于對(duì)槐糖脂進(jìn)行了氫化預(yù)處理，故預(yù)期更方便對(duì)槐糖進(jìn)行處理。

可以通過(guò)所屬領(lǐng)域中已知的方法從最終反應(yīng)混合物中分離槐糖并且加以純化。合適的純化方法包括例如色譜法、吸附、提取、沉淀、再沉淀、結(jié)晶和再結(jié)晶。

制備天然內(nèi)酯型槐糖脂和二聚槐糖脂的方法

可以使用酵母由微生物培養(yǎng)物制備上文提到的天然內(nèi)酯型槐糖脂混合物和槐糖脂二聚物。合適的酵母菌株可選自例如以下各屬：假絲酵母屬、斯塔摩酵母屬(starmerella)、紅酵母屬(rhodotorula)和擬威克酵母屬(wickerhamiella)。適用于槐糖脂產(chǎn)生的特定菌株包括例如假絲酵母菌(例如atcc22214、nrrly-30816)、斯塔摩酵母屬bombicola、蜂生假絲酵母(candidaapicola)、假絲酵母屬riodocensis、星形假絲酵母(candidastellata)和假絲酵母屬nrrly-27208。(參見(jiàn)庫(kù)茲曼(kurtzman)等人,歐洲微生物學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)微生物通訊(femsmicrobiol.lett.),311:140-146(2010))。

在一些實(shí)施例中，由酵母假絲酵母菌或蜂生假絲酵母產(chǎn)生天然槐糖脂混合物。舉例來(lái)說(shuō)，假絲酵母菌具有首先將來(lái)自于植物油的三酸甘油酯裂解成容易被酵母吸收的游離脂肪酸的活性細(xì)胞外脂肪酶系統(tǒng)。脂肪酸然后通過(guò)細(xì)胞色素p450的作用在最后一個(gè)或倒數(shù)第二個(gè)碳上進(jìn)行羥基化。然后通過(guò)兩個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶的作用將槐糖添加到羥基化脂肪酸上。(參見(jiàn)弗雷拉科(fleurackers),歐洲脂質(zhì)科學(xué)與技術(shù)雜志(eur.j.lipidsci.technol.),108:5-12,(2006))。乙酰化和內(nèi)酯化完成了槐糖脂形成，然后由酵母分泌。

用于產(chǎn)生槐糖脂的發(fā)酵程序?qū)τ谒鶎兕I(lǐng)域的技術(shù)人員一般是已知的。用于產(chǎn)生天然槐糖脂的發(fā)酵中所使用的合適的碳底物可以包括疏水性底物，例如植物油(例如芥花籽油、大豆油、玉米油、棕櫚油、椰子油、葵花籽油、棉籽油或橄欖油)、脂肪酸(例如棕櫚酸、油酸、反油酸、亞油酸、α-亞麻酸或硬脂酸)、脂肪酸酯(例如脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯)、烷烴(例如十五烷、十六烷、十七烷或十八碳烷)和脂肪醇(例如十五醇、十六醇、十七醇或十八醇)。

用于產(chǎn)生天然槐糖脂的發(fā)酵中所使用的碳底物的長(zhǎng)度一般取決于發(fā)酵宿主。舉例來(lái)說(shuō)，在使用假絲酵母屬宿主(例如假絲酵母菌)的某些實(shí)施例中，脂肪酸和/或烷烴具有介于15與18個(gè)碳原子之間的鏈長(zhǎng)度。在一個(gè)變化方案中，碳鏈介于15與18個(gè)碳原子之間的脂肪酸可能優(yōu)于碳鏈介于15與18個(gè)碳原子之間的烷烴。(參見(jiàn)馮·博加特(vanbogaert)等人,過(guò)程生物化學(xué)(processbiochem.),46(4):821-833(2011))。在一個(gè)實(shí)施例中，用于產(chǎn)生天然槐糖脂的發(fā)酵中所使用的碳底物是芥花籽油，其具有高c18含量和單不飽和脂肪酸鏈。此外，還應(yīng)理解，可以使用其它較長(zhǎng)或較短的碳底物，但可減短或伸長(zhǎng)到15至18個(gè)碳成員的鏈以便與假絲酵母屬宿主一起使用。

酵母典型地產(chǎn)生槐糖脂混合物，且所述混合物的槐糖脂分子通常具有一個(gè)在槐糖分子的c-1'位置上與羥基化脂肪酸連接的槐糖分子。天然槐糖脂混合物可包括呈內(nèi)酯型或酸性形式的二乙?；碧侵?。對(duì)于由假絲酵母菌產(chǎn)生的天然槐糖脂混合物，二乙?；瘍?nèi)酯型槐糖脂的存在量(例如大于60％)典型地大于酸性槐糖脂(例如少于10％)。參見(jiàn)艾斯馬(asmer)等人,美國(guó)油類化學(xué)家學(xué)會(huì)雜志(j.am.oilchem.soc.),65(9):1460-1466(1988)；達(dá)維拉(davila),色譜學(xué)雜志(j.chromatography),648:139-149(1993)；達(dá)維拉等人,工業(yè)微生物學(xué)雜志(j.indust.microbio.),13:249-257(1994)；拉特塞普(ratsep)和沙阿(shah),微生物學(xué)方法雜志(j.microbio.methods),78:54-356(2009)。天然槐糖脂混合物的槐糖脂典型地在槐糖分子的c-6"和/或c-6'位置上具有乙?；?。參見(jiàn)馮·博加特等人,過(guò)程生物化學(xué)46(4):821-833(2011)。脂肪酸基團(tuán)可以是飽和的或不飽和的，并且可以在長(zhǎng)度上變化。典型地，天然槐糖脂混合物中的槐糖脂具有16至18個(gè)碳原子的脂肪酸鏈。

天然槐糖脂混合物的組成可取決于原料類型和培養(yǎng)條件。舉例來(lái)說(shuō)，如果原料是脂肪酸酯而不是植物油或游離脂肪酸，則可以產(chǎn)生更多的游離酸性槐糖脂。(參見(jiàn)阿什比(ashby)等人,美國(guó)公開(kāi)專利申請(qǐng)案第2006/0199244號(hào)。)另一方面，如果使用例如十六烷或十七烷等烷烴，則產(chǎn)生更多的內(nèi)酯型槐糖脂。(參見(jiàn)格倫斯(glenns)和庫(kù)柏(cooper),美國(guó)油類化學(xué)家學(xué)會(huì)雜志(j.am.oilchemistsoc.),83(2):137-145(2006)。)

以下實(shí)例僅意在進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明而不是意在限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍如權(quán)利要求書所界定。

實(shí)例

實(shí)例1.用于在木霉屬中誘導(dǎo)基因表達(dá)的酶促制備的乳糖乙酸酯

本實(shí)例描述了使用酶催化轉(zhuǎn)酯化由乳糖制備圖1a中所描繪的乳糖乙酸酯，由此增強(qiáng)其在木霉屬中的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)力。

首先在20ml玻璃閃爍小瓶中用0.20ml二甲亞砜(dmso)溶解25mgd-乳糖(西格瑪-奧德里奇公司(sigma-aldrich))來(lái)開(kāi)始制備。在這之后加入1.8ml叔戊醇、0.125g分子篩(sylosiv，格雷斯公司(wrgrace)，哥倫比亞(columbia)，馬里蘭州(md))和0.125g固定脂肪酶(lipozymetl，諾維信公司(novozymes)，弗蘭克林頓(franklinton)，北卡羅來(lái)納州(nc))。在振蕩培育器內(nèi)在50℃和150轉(zhuǎn)/分下將混合物預(yù)培育1小時(shí)，此后加入0.142ml乙酸乙烯酯(西格瑪-奧德里奇公司，圣路易斯(st.louis)，密蘇里州(mo))以引發(fā)轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)。允許反應(yīng)在振蕩培育器內(nèi)在50℃和150轉(zhuǎn)/分下進(jìn)行16小時(shí)。

在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，從閃爍小瓶中取出粗產(chǎn)物混合物且經(jīng)由離心回收為上清液，其中使用speedvac濃縮器(savant，賽默科技公司(thermoscientific))蒸發(fā)溶劑。為了進(jìn)行nmr和誘導(dǎo)研究，通過(guò)急驟色譜法從粗混合物中分餾出乳糖單乙酸酯。將5g自填充硅膠(飛世爾(fisher)，230-400目)柱與洗脫液(1-丙醇:乙酸乙酯:水，4:5:1)一起用于等度洗脫。

使用具有waterszq2000質(zhì)譜儀和waters2487uv檢測(cè)器的waters2695hplc，經(jīng)由lc-ms證實(shí)乳糖單乙酸酯的純度。使用waterssymmetryc18柱(4.6×250mm，5μm)，以含有0.1％甲酸的(5％/95％)乙腈和水洗脫液作為移動(dòng)相，等度運(yùn)行持續(xù)15分鐘的總運(yùn)行時(shí)間來(lái)進(jìn)行分析。

為了準(zhǔn)備使用木霉屬的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)研究，首先制備檸檬酸鹽基本培養(yǎng)基。如由英格蘭等人(美國(guó)專利第7,713,725號(hào))改性的培養(yǎng)基組合物由14.4g/l檸檬酸、4g/lkh2po4、6.35g/l(nh4)2so4、2g/lmgso4-7h2o、0.53g/lcacl2-2h2o和1ml/l痕量金屬元素(包含5g/lfeso4-7h2o、1.6g/lmnso4-h2o和1.4g/lznso4-7h2o)組成。使用naoh將最終ph值調(diào)節(jié)到5.50。選擇纖維素酶過(guò)度分泌者里氏木霉rut-c30作為宿主以測(cè)試蛋白質(zhì)表達(dá)。它是獲自atcc(56765)，且開(kāi)發(fā)為得自于親本菌株ng14和野生型qm6a的經(jīng)典突變發(fā)生的分解代謝去阻遏菌株(塞德?tīng)?seidl)等人,英國(guó)醫(yī)學(xué)研究理事會(huì)基因組學(xué)(bmcgenomics),9:327,(2008))。為了使木霉屬增殖，首先將得自于atcc的凍干儲(chǔ)備物溶解于無(wú)菌去離子水中，然后使用無(wú)菌環(huán)轉(zhuǎn)移到pda(馬鈴薯右旋糖瓊脂)板(teknovap0047)上。在室溫下將pda板維持白色熒光下，且在大約7天之后，可見(jiàn)綠色木霉屬孢子。另外，制備60％(w/v)葡萄糖儲(chǔ)備液且用作對(duì)照和木霉屬生長(zhǎng)用碳源。

為了起始蛋白質(zhì)誘導(dǎo)研究，首先將0.5ml葡萄糖儲(chǔ)備液放到125ml三角燒瓶?jī)?nèi)的14ml檸檬酸鹽基本培養(yǎng)基中，隨后加入0.5ml預(yù)期誘導(dǎo)劑。對(duì)于葡萄糖(無(wú)誘導(dǎo)劑)對(duì)照，將0.5ml葡萄糖儲(chǔ)備液放到14.5ml基本培養(yǎng)基中以得到最終葡萄糖濃度2％。為了開(kāi)始發(fā)酵，使用無(wú)菌環(huán)從含有木霉屬孢子的pda瓊脂板去除大約1cm×1cm方形瓊脂塞，并且放到欲測(cè)試的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。在以175轉(zhuǎn)/分進(jìn)行振蕩下將培養(yǎng)物放在28℃培育器內(nèi)。在發(fā)酵第3天，收集樣品并且分析羧甲基纖維素(cmc)內(nèi)切葡聚糖酶活性。因?yàn)槔锸夏久箁ut-c30是纖維素酶過(guò)度生產(chǎn)者，所以cmc活性與所誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)的量直接相關(guān)。cmc活性測(cè)定按照由曼德?tīng)査购屠锼剐薷牡某绦蚶?.3ml反應(yīng)體積(細(xì)菌學(xué)雜志,73:269-278,(1957))。一個(gè)cmc單位表示在50℃和ph4.8的規(guī)定條件下在1分鐘內(nèi)釋出1μmol還原糖(表示為葡萄糖當(dāng)量)的活性。

表1中給出了cmc活性測(cè)定的結(jié)果，其顯示已知誘導(dǎo)劑對(duì)比酶促制備的粗乳糖乙酸酯混合物和經(jīng)純化乳糖單乙酸酯的纖維素酶活性。含有乳糖單乙酸酯和乳糖二乙酸酯的粗乳糖單乙酸酯混合物已經(jīng)非常強(qiáng)效而且效率很高。在0.8g/l下，其容易地勝過(guò)乳糖和纖維二糖在1.0g/l下的誘導(dǎo)力。其特異性誘導(dǎo)力(表示為單位數(shù)u/mg誘導(dǎo)劑)是未改性乳糖的14倍。

表1

*所有培養(yǎng)基都含有2％葡萄糖作為碳源。

即使不純的粗乳糖酯混合物具有高度誘導(dǎo)性，相等質(zhì)量的經(jīng)純化乳糖單乙酸酯也更加強(qiáng)效。乳糖單乙酸酯在0.09g/l、0.51g/l和1.05g/l下的特異性誘導(dǎo)活性分別是未改性乳糖的大約34、31和21倍(在第3天測(cè)量)。此外，0.09g/l(22.0u/mg)乳糖單乙酸酯的特異性誘導(dǎo)力幾乎接近槐糖(26.9u/mg)，這在當(dāng)前是木霉屬中纖維素酶誘導(dǎo)的黃金標(biāo)準(zhǔn)。

通過(guò)lc-ms證實(shí)經(jīng)純化的乳糖單乙酸酯含有摩爾質(zhì)量384(402[m+nh4]⁺和407[m+na]⁺)。通過(guò)使用核磁共振(nmr；varian400mhz)進(jìn)行分析進(jìn)一步證實(shí)了乳糖單乙酸酯的結(jié)構(gòu)。

基于¹hnmr、¹³c-nmr和二維¹³c-¹hhsqcnmr光譜，如圖1a中所描繪的乳糖單乙酸酯被證實(shí)為在6"位置上經(jīng)單乙?；娜樘堑腶和p端基異構(gòu)體混合物。以下表2中概括了所分離的乳糖單乙酸酯洗脫分的質(zhì)子和碳的分配。

表2

實(shí)例2.酶促制備的槐糖乙酸酯用于在木霉屬中誘導(dǎo)基因表達(dá)

本實(shí)例顯示，可以通過(guò)酶催化轉(zhuǎn)酯化由槐糖制備槐糖乙酸酯，由此增強(qiáng)其在木霉屬中的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)力。按照實(shí)例1中所描述的程序進(jìn)行粗槐糖酯混合物、經(jīng)純化槐糖二乙酸酯的制備和隨后的誘導(dǎo)研究，但乙酸乙烯酯的用量為0.026ml。

表3中所示的cmc活性結(jié)果比較了粗槐糖乙酸酯混合物和經(jīng)純化槐糖二乙酸酯的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)力與槐糖的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)力。在0.17g/l下，粗混合物即使不純也已經(jīng)高度有效而且強(qiáng)效。其在70.2u/mg下的特異性誘導(dǎo)力是未改性槐糖的約3倍。經(jīng)純化的槐糖二乙酸酯在0.12g/l下甚至更強(qiáng)效。其在193.3u/mg下的特異性誘導(dǎo)力是未改性槐糖的約7倍。

表3

*所有培養(yǎng)基都含有2％葡糖糖作為碳源。

使用與實(shí)例1中所描述相同的程序通過(guò)lc-ms分析粗槐糖乙酸酯混合物，且發(fā)現(xiàn)其由質(zhì)量為384(402[m+nh4]⁺)的槐糖單乙酸酯、質(zhì)量為426(444[m+nh4]⁺)的二乙酸酯和未反應(yīng)槐糖的混合物組成。從lc-ms中證實(shí)了經(jīng)過(guò)純化的槐糖二乙酸酯的純度。

實(shí)例3.用于在木霉屬中誘導(dǎo)基因表達(dá)的酶促制備的槐糖棕櫚酸酯

本實(shí)例顯示，可以通過(guò)酶催化轉(zhuǎn)酯化由槐糖制備屬于式(ii)結(jié)構(gòu)類別的槐糖棕櫚酸酯，以進(jìn)一步增強(qiáng)其在木霉屬中的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)力。

按照實(shí)例1中所描述的程序進(jìn)行粗槐糖棕櫚酸酯混合物的制備和隨后的誘導(dǎo)研究，但使用5mg槐糖作為底物且使用棕櫚酸乙烯酯(美國(guó)東京化成工業(yè)公司(tciamerica)，波特蘭(portland)，俄勒岡州(or))代替乙酸乙烯酯。不對(duì)粗產(chǎn)物混合物進(jìn)行進(jìn)一步純化。

表4中所示的cmc活性結(jié)果比較了粗槐糖棕櫚酸酯混合物的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)力與槐糖的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)力。在0.17g/l下，粗混合物即使不純也已經(jīng)高度有效而且強(qiáng)效。其在73.8u/mg下的特異性誘導(dǎo)力類似于粗槐糖乙酸酯混合物(表3)并且是未改性槐糖的約3倍。

表4

*所有培養(yǎng)基都含有2％葡萄糖作為碳源。

使用與實(shí)例1中所描述相同的程序，通過(guò)lc-ms分析粗槐糖單棕櫚酸酯混合物，但使用(70％/30％)乙腈和含0.1％甲酸的水的移動(dòng)相，并且純化是以等度方式運(yùn)行，總運(yùn)行時(shí)間為30分鐘。發(fā)現(xiàn)樣品由摩爾質(zhì)量為580(603[m+na]⁺)的單棕櫚酸酯與質(zhì)量為818(841[m+na]⁺)的二棕櫚酸酯的混合物組成。

實(shí)例4.用于在木霉屬中誘導(dǎo)基因表達(dá)的化學(xué)制備的乳糖乙酸酯

本實(shí)例顯示，還可以通過(guò)化學(xué)催化轉(zhuǎn)酯化由乳糖制備乳糖乙酸酯，以增強(qiáng)其在木霉屬中的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)力。

首先通過(guò)在二甲亞砜(dmso)中制備0.4m乳糖溶液來(lái)開(kāi)始所述程序。將所述溶液(2ml)與3mg碳酸鉀(k2co3)催化劑混合，且在50℃下預(yù)熱30分鐘以活化催化劑。在去除未溶解的催化劑之后，通過(guò)以不同摩爾比(乙酸乙烯酯:乳糖)加入乙酸乙烯酯來(lái)起始反應(yīng)以便控制取代度。各反應(yīng)的體積為200μl且使用熱循環(huán)儀在不攪拌的情況下將其加熱到60℃后維持30分鐘。隨后的樣品回收和誘導(dǎo)研究按照實(shí)例1中所描述的程序來(lái)進(jìn)行。

表5中給出了cmc活性測(cè)定的結(jié)果。以2:1的乙酸乙烯酯:乳糖比率制備的粗乳糖乙酸酯混合物得到了最高誘導(dǎo)。其與纖維二糖和乳糖相比非常強(qiáng)效且高度有效。在0.91g/l下，其容易地勝過(guò)乳糖和纖維二糖在1.0g/l下的誘導(dǎo)力。其特異性誘導(dǎo)力(表示為單位數(shù)u/mg誘導(dǎo)劑)是未改性乳糖的13倍且類似于酶促制備的粗乳糖乙酸酯混合物(表1)。

表5

*所有培養(yǎng)基都含有2％葡萄糖作為碳源。

基于lc-ms分析，在變化的乙酸乙烯酯:乳糖比率下化學(xué)制備的粗乳糖乙酸酯混合物由具有多種取代度的乙酸酯混合物組成。在高乙酸乙烯酯:乳糖比率(例如4:1)下，大部分是三乙酸酯和二乙酸酯，而在較低比率(例如1:4)下，大部分是單乙酸酯和未改性乳糖。比率2:1得到最高誘導(dǎo)，產(chǎn)生了主要由單乙酸酯、二乙酸酯和三乙酸酯組成的產(chǎn)物。

實(shí)例5.用于在木霉屬中誘導(dǎo)基因表達(dá)的化學(xué)制備的槐糖乙酸酯

本實(shí)例顯示，還可以通過(guò)化學(xué)催化轉(zhuǎn)酯化由槐糖制備槐糖乙酸酯，和可以如何對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步純化以增強(qiáng)其在木霉屬中的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)力。按照與實(shí)例4中所描述相同的程序化學(xué)制備槐糖乙酸酯的程序，且按照實(shí)例1中詳細(xì)描述的程序進(jìn)行隨后的樣品回收和誘導(dǎo)研究，但基于實(shí)例1中所描述的程序?qū)Υ只旌衔镞M(jìn)行進(jìn)一步純化以分離槐糖二乙酸酯。

表6中示出了cmc活性測(cè)定的結(jié)果。以1:1的乙酸乙烯酯:槐糖比率制備的粗槐糖乙酸酯混合物得到了最高誘導(dǎo)。其非常強(qiáng)效且高度有效并且大大超過(guò)了未改性槐糖。在0.09g/l下，其特異性誘導(dǎo)力(表示為單位數(shù)u/mg誘導(dǎo)劑)是未改性槐糖的5倍，并且對(duì)粗混合物進(jìn)行進(jìn)一步純化以分離槐糖二乙酸酯，且其特異性誘導(dǎo)是未改性槐糖的約8倍。

表6

*所有培養(yǎng)基都含有2％葡萄糖作為碳源。

基于lc-ms分析，在變化的乙酸乙烯酯:槐糖比率下化學(xué)制備的粗槐糖乙酸酯混合物由具有多種取代度的乙酸酯混合物組成。在高乙酸乙烯酯:槐糖比率(例如4:1)下，產(chǎn)物主要是三乙酸酯、四乙酸酯、五乙酸酯和六乙酸酯，而在較低比率(例如1:4)下，產(chǎn)物主要是二乙酸酯和單乙酸酯和未改性槐糖。比率1:1得到了最高誘導(dǎo)，且大部分產(chǎn)物是單乙酸酯、二乙酸酯和三乙酸酯。

通過(guò)lc-ms證實(shí)經(jīng)純化的槐糖二乙酸酯含有摩爾質(zhì)量426(444[m+nh4]⁺和449[m+na]⁺)。通過(guò)使用核磁共振(nmr；varian400mhz)進(jìn)行分析進(jìn)一步證實(shí)槐糖二乙酸酯的結(jié)構(gòu)。

基于¹hnmr、¹³c-nmr和二維¹³c-¹hhsqcnmr光譜，如圖1b中所描繪的槐糖二乙酸酯被證實(shí)為在6'和6"位置上乙?；摩?槐糖二酯。以下表7中概括了所分離的槐糖乙酸酯洗脫分的質(zhì)子和碳的分配。

表7

實(shí)例6.用于在曲霉屬中誘導(dǎo)基因表達(dá)的化學(xué)制備的麥芽糖乙酸酯

本實(shí)例顯示，還可以通過(guò)化學(xué)催化轉(zhuǎn)酯化由麥芽糖制備麥芽糖乙酸酯，以增強(qiáng)其在曲霉屬中的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)力。化學(xué)制備麥芽糖乙酸酯和隨后進(jìn)行樣品回收的程序沿襲與實(shí)例4中所描述的程序相同的程序。為了準(zhǔn)備使用曲霉屬的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)研究，首先用1g/lkh2po4、2g/lnh4cl、0.5g/lmgso4-7h2o、0.2mg/lcuso4-5h2o、12.5mg/lfeso4-7h2o、1mg/lznso4-7h2o和0.09mg/lmnso4制備基本培養(yǎng)基。在室溫下將獲自美國(guó)農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心(arsculturecollection)的黑曲霉(nrrl330)維持在pda板上且允許生成孢子，持續(xù)一周。為了進(jìn)行接種，首先去除2cm×2cm面積的瓊脂塞，并且懸浮在5ml無(wú)菌水中。利用劇烈攪拌從瓊脂上洗掉孢子且在125ml三角燒瓶中，在14ml培養(yǎng)基和作為碳源的1％山梨糖醇存在下，使用1ml懸浮液作為接種液。允許培養(yǎng)在振蕩培育器(28℃和200轉(zhuǎn)/分)內(nèi)進(jìn)展2天，此時(shí)加入誘導(dǎo)劑。再過(guò)24小時(shí)之后，按照與巴頓等人(細(xì)菌學(xué)雜志,1972,111(3):771-777)所描述的那些程序類似的程序測(cè)定培養(yǎng)物的淀粉酶活性。

表8中示出了淀粉酶活性測(cè)定的結(jié)果。以2:1的乙酸乙烯酯:麥牙糖比率制備的粗麥牙糖乙酸酯混合物得到了最高誘導(dǎo)。其與麥芽糖相比更強(qiáng)效且高度有效。在0.05g/l下，其特異性誘導(dǎo)力(138.1u/mg)是未改性麥芽糖(44.0u/mg)的3倍。

表8

*所有培養(yǎng)基都含有1％山梨糖醇作為碳源。

基于lc-ms分析，在變化的乙酸乙烯酯:麥牙糖比率下化學(xué)制備的粗麥牙糖乙酸酯混合物由具有多種取代度的乙酸酯混合物組成。在高乙酸乙烯酯:麥芽糖比率(例如4:1)下，產(chǎn)物主要是三乙酸酯、四乙酸酯、五乙酸酯和六乙酸酯，而在較低比率(例如1:2)下，產(chǎn)物主要是三乙酸酯、二乙酸酯和單乙酸酯和未改性麥芽糖。比率2:1得到了最高誘導(dǎo)，且產(chǎn)物主要是單乙酸酯、二乙酸酯和三乙酸酯。

實(shí)例7.用于在木霉屬中誘導(dǎo)基因表達(dá)的獲自天然內(nèi)酯型槐糖脂的甲酸處理的槐糖酯

本實(shí)例描述了一種使用甲酸將非誘導(dǎo)性天然內(nèi)酯型槐糖脂轉(zhuǎn)化成具有由圖1d和圖2描述的結(jié)構(gòu)的新穎而且高誘導(dǎo)性的槐糖酯的高度有效的方法。為了制備天然內(nèi)酯型槐糖脂，使用假絲酵母菌(atcc22214)。玻璃瓶中的凍干儲(chǔ)備物樣品是獲自atcc，且首先將其轉(zhuǎn)移到酵母提取物、蛋白胨、右旋糖(ypd)培養(yǎng)肉湯中，然后允許在28℃下生長(zhǎng)48小時(shí)(兩天)。然后將培養(yǎng)物與滅菌甘油混合以制備含有20％甘油的最終培養(yǎng)物。然后使用含1ml各種菌培養(yǎng)物的冷凍小瓶建立細(xì)胞庫(kù)，并且存儲(chǔ)在-80℃下。

為了由芥花籽油產(chǎn)生天然槐糖脂，首先制備產(chǎn)生培養(yǎng)基，且其包括以下組分：100g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、1g/l尿素和100g/l芥花籽油(crisco，斯馬克公司(thej.m.smuckercompany)，奧爾維爾(orrville)，俄亥俄州(oh))?；谥圃焐趟峁┑臄?shù)據(jù)，芥花籽油具有64％主要來(lái)自于油酸脂肪酸的單不飽和脂肪和29％主要來(lái)自于亞油酸和α-亞麻酸脂肪酸的多不飽和脂肪。為了起始發(fā)酵，將1ml來(lái)自于如上制備的冷凍小瓶的假絲酵母菌菌種放到在28℃和250轉(zhuǎn)/分(rpm)下培育的250ml三角燒瓶?jī)?nèi)的50ml產(chǎn)生培養(yǎng)基中。在7天之后，培養(yǎng)基中出現(xiàn)呈粘性棕色油相形式的槐糖脂，且在一些情況下，槐糖脂結(jié)晶成黃色至白色殘余物。使用分液漏斗分離棕色油性槐糖脂，并且使用乙酸乙酯等度洗脫，使用自填充硅膠柱(飛世爾公司，230-400目)進(jìn)行進(jìn)一步純化以回收二乙?；瘍?nèi)酯型槐糖脂。為了回收主要由二乙?；瘍?nèi)酯型槐糖脂組成的結(jié)晶槐糖脂，允許槐糖脂靜置直到形成沉渣，通過(guò)傾析和用水洗滌隨后冷凍干燥來(lái)回收。由得自于lc-ms的結(jié)果證實(shí)所收集樣品的純度，且發(fā)現(xiàn)是摩爾質(zhì)量為688(706[m+h2nh4]⁺和711[m+na]⁺)的經(jīng)衍生而具有羥基油酸酯脂肪基團(tuán)的二乙?；瘍?nèi)酯型槐糖脂。

下一個(gè)步驟是用甲酸處理。所述過(guò)程開(kāi)始于將5mg二乙?；瘍?nèi)酯型槐糖脂溶解于200μl甲酸中。在某些運(yùn)行中，在這個(gè)步驟之后加入0.31μl(0.15％)濃硫酸。在熱循環(huán)儀中在不進(jìn)行攪拌的情況下將反應(yīng)混合物加熱到80℃后維持30分鐘。然后加入水(1ml)以使樣品沉淀，隨后離心以回收沉淀物并且在speedvac中干燥以去除殘余水和甲酸。然后將經(jīng)過(guò)干燥的樣品于200μl乙酸中溶液化成甲醇(3:2v/v)溶液，并且加熱到90℃后維持6小時(shí)，以便從經(jīng)過(guò)處理的槐糖脂裂解不需要的甲酸酯。在這個(gè)步驟之后使用speedvac進(jìn)行另一個(gè)干燥步驟以去除乙酸和甲醇。按照實(shí)例1中所描述的程序，在木霉屬中測(cè)試呈粗產(chǎn)物混合物形式的最終樣品的誘導(dǎo)。

表9中所示的cmc活性結(jié)果比較了由天然內(nèi)酯型槐糖脂的甲酸處理獲得的粗槐糖酯與其它已知誘導(dǎo)劑的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)力。與已知誘導(dǎo)劑相比，所測(cè)試的樣品即使不純也高度有效而且強(qiáng)效。相對(duì)于葡萄糖對(duì)照，天然二乙?；瘍?nèi)酯型槐糖脂不具誘導(dǎo)性，在甲酸處理之后，其在0.33g/l下的特異性誘導(dǎo)增強(qiáng)了52倍。如果將0.15％硫酸與甲酸一起使用，則在0.03g/l濃度下的特異性誘導(dǎo)增強(qiáng)了多達(dá)487倍。即使作為不純的粗樣品，所述混合物在496.5u/mg下的特異性誘導(dǎo)力也是當(dāng)前同類中最佳誘導(dǎo)劑槐糖的18倍。

表9

*所有培養(yǎng)基都含有2％葡萄糖作為碳源。

實(shí)例8.用于在木霉屬中誘導(dǎo)基因表達(dá)的獲自c.bombicola培養(yǎng)物的天然槐糖脂二聚物酯

本實(shí)例說(shuō)明圖1e中所描繪的天然槐糖脂二聚物也可以充當(dāng)木霉屬中的基因表達(dá)的高度有效誘導(dǎo)劑。根據(jù)實(shí)例7中所描述的程序，由假絲酵母菌培養(yǎng)物制備含有槐糖脂二聚物的粗樣品，并且典型地收集為棕色油性殘余物。除芥花籽油以外，還使用大豆油和玉米油作為原料(crisco，斯馬克公司，奧爾維爾，俄亥俄州)。在大部分情況下，假絲酵母菌酵母不產(chǎn)生二聚槐糖脂。在很少的情況下，產(chǎn)生痕量且通過(guò)lc-ms揭示其存在，lc-ms顯示摩爾質(zhì)量為1030、1028、1072、1070、1114和1112(分別為1053[m+na]⁺、1051[m+na]⁺、1095[m+na]⁺、1093[m+na]⁺、1137[m+na]⁺和1135[m+na]⁺)。摩爾質(zhì)量1030和1028分別表示經(jīng)衍生而具有油酸酯或亞油酸酯脂肪基團(tuán)的二乙?；碧侵畚?。摩爾質(zhì)量1072和1070分別表示經(jīng)衍生而具有油酸酯或亞油酸酯脂肪基團(tuán)的三乙?；畚?。摩爾質(zhì)量1114和1112分別表示經(jīng)衍生而具有油酸酯或亞油酸酯脂肪基團(tuán)的四乙?；畚铩２贿M(jìn)一步分離這些二聚化合物，且按照實(shí)例1中所描述的程序，使用粗樣品進(jìn)行誘導(dǎo)研究。

表10中所示的cmc活性結(jié)果比較了獲自假絲酵母菌培養(yǎng)物的粗槐糖脂二聚物混合物與其它已知誘導(dǎo)劑的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)力。與已知的誘導(dǎo)劑相比，粗樣品即使不純(如lc-ms和tlc所示)也高度有效而且強(qiáng)效。不含二聚物的粗樣品的誘導(dǎo)性顯著低于含有二聚物的樣品。在0.90g/l下，在芥花籽油上生長(zhǎng)的含有二聚物的樣品的特異性誘導(dǎo)(19.7u/mg)是無(wú)二聚物的樣品所產(chǎn)生的誘導(dǎo)的7倍，并且?guī)缀踹_(dá)到槐糖的誘導(dǎo)(26.9u/mg)。因?yàn)檫@些二聚物僅作為痕量存在于粗樣品中，所以經(jīng)過(guò)純化的二聚化合物在分離后就可能甚至更強(qiáng)效。

表10

*所有培養(yǎng)基都含有2％葡萄糖作為碳源。

實(shí)例9.使用甲酸由天然槐糖苷產(chǎn)生槐糖

為了最適用于商業(yè)應(yīng)用，槐糖需要更便宜而且更容易獲得。本實(shí)例提供了一種用于由在非水性條件下對(duì)天然槐糖苷(甜菊苷和槐糖脂)進(jìn)行甲酸處理而以高產(chǎn)率產(chǎn)生槐糖的簡(jiǎn)單而且有效的方法。所述程序類似于實(shí)例7中所描述的程序，但在甲酸處理之后將樣品凍干，然后在室溫下，在含0.5m甲醇鈉的甲醇中溶液化15分鐘。這個(gè)過(guò)程去除了不需要的甲酸酯或脂肪酯以產(chǎn)生槐糖。在使用speedvac進(jìn)行另一個(gè)干燥步驟以去除甲醇之后，通過(guò)hplc(waters2695，401r1檢測(cè)器和bioradhpx-87h柱)分析樣品以測(cè)定槐糖濃度。作為比較，按照草壁等人(農(nóng)業(yè)與生物化學(xué),1987,51(8):2255-2256)詳細(xì)描述的程序，用0.1n鹽酸處理甜菊苷以產(chǎn)生槐糖。

表11中的結(jié)果顯示，當(dāng)與草壁所描述的稀鹽酸處理相比較時(shí)，甲酸處理產(chǎn)生顯著有所增加的產(chǎn)率。通過(guò)使用甜菊苷作為起始材料，使用甲酸處理的槐糖產(chǎn)率增加到三倍。通過(guò)使用二乙?；瘍?nèi)酯型槐糖脂作為起始材料，當(dāng)對(duì)甲酸處理補(bǔ)充添加0.15％硫酸時(shí)，槐糖產(chǎn)率加倍。

表11

實(shí)例10.使用槐糖酯作為固相發(fā)酵中基因表達(dá)的誘導(dǎo)劑

使用固相發(fā)酵生產(chǎn)酶和其它蛋白質(zhì)產(chǎn)物依賴于微生物(特別是絲狀真菌)在無(wú)自由流動(dòng)液體的潮濕固體底物上的生長(zhǎng)。與液體深層發(fā)酵相反，固相發(fā)酵在一些情形下在性能和生產(chǎn)成本兩方面都可提供顯著優(yōu)勢(shì)。本實(shí)例顯示，具有圖1d和圖2所描述的結(jié)構(gòu)的槐糖酯可以用作固相發(fā)酵中使用里氏木霉產(chǎn)生纖維素酶的非常有效的誘導(dǎo)劑。

所使用的固體底物是購(gòu)自本地寵物供應(yīng)商店的麥麩與玉米芯的1:1摻合物。每次運(yùn)行由放到125ml燒瓶中的8克這種摻合物組成，然后通過(guò)高壓釜處理進(jìn)行滅菌。然后加入實(shí)例1中所描述的檸檬酸鹽基本培養(yǎng)基(ph4.8)。所加入的檸檬酸鹽培養(yǎng)基的量是5.3ml、8ml、12ml、18.7ml，由此分別得到40％、50％、60％和70％的起始水分含量。所使用的槐糖酯是獲自天然內(nèi)酯型槐糖脂的甲酸處理的粗混合物(實(shí)例7)。對(duì)于每次運(yùn)行，然后將與檸檬酸鹽基本培養(yǎng)基預(yù)混的粗槐糖酯(10mg)混入固體底物中。通過(guò)將2ml里氏木霉預(yù)培養(yǎng)物接種液(來(lái)自于第2天，實(shí)例1)混入固體底物中，隨后在28℃下在不振蕩的情況下培育燒瓶來(lái)起始發(fā)酵。在第3天從各燒瓶收集固體樣品且用10倍體積的50mm檸檬酸鹽緩沖液(ph4.8)進(jìn)行處理，并且如實(shí)例1中所描述分析cmc活性。

表12中的結(jié)果顯示，不管起始水分含量如何，在使用里氏木霉的固相發(fā)酵中，向固體底物中加入槐糖酯誘導(dǎo)劑都能夠顯著提高纖維素酶產(chǎn)生。在40％、50％、60％和70％起始水分下，所觀測(cè)到的每克固體底物的纖維素酶活性提高分別是4倍、7倍、12倍和5倍。

表12

盡管本文中已經(jīng)顯示并且描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)顯而易見(jiàn)，所述實(shí)施例僅以舉例方式提供。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員現(xiàn)在應(yīng)能在不背離本發(fā)明的情況下想到許多變化、改變和替代。應(yīng)理解，可以采用本文中所描述的本發(fā)明實(shí)施例的各種替代方案來(lái)實(shí)施本發(fā)明。希望以下權(quán)利要求書界定本發(fā)明的范圍且從而涵蓋在這些權(quán)利要求及其等效物范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)。