本發(fā)明涉及一種熒光假單胞菌突變菌株，具體涉及一種熒光假單胞菌突變菌株的篩選方法及其在生物防治中的應(yīng)用。本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

熒光假單胞菌(pseudomonasprotegens)屬革蘭氏陰性桿狀細(xì)菌，常見于植物根圍和土壤中，是作為植物根際促生細(xì)菌(plantgrowth-promotingrhizobacteria,pgpr)中研究較多的一種細(xì)菌，由于其繁殖速度快、適應(yīng)能力強(qiáng)、易于人工培養(yǎng)、制劑穩(wěn)定、施用方便、不污染環(huán)境、防治多種植物病害等優(yōu)點(diǎn)，我國農(nóng)業(yè)部已將其列為可注冊登記的微生物農(nóng)藥和肥料品種之一，在全國范圍內(nèi)推廣使用。由于其能產(chǎn)生一種或多種抗生素，如2，4-二乙?；冱S酚(2,4-diacetylphloroglu-cinol,2,4-dapg)、藤黃綠膿菌素(pyoluteorin,plt)、吩嗪(phenazine)、硝吡咯菌素(pyrrolnitrin,prn)、apra蛋白酶和氫氰酸(hcn)等，所以對植物病害，尤其是土傳病害如猝倒病、根腐病、枯萎病等均有很好的防治作用，是一類重要的有益微生物資源，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有非常重要的意義。但是，熒光假單胞菌本身并不具有生物固氮的功能。

固氮斯氏假單胞菌dsm4166(pseudomonasstutzeridsm4166)是一株分離自德國高粱根際土壤的聯(lián)合固氮菌，已被保藏在德意志微生物保藏中心(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh)且分配有保藏號dsm4166。該菌在無氨和微好氧條件下可將空氣中的氮?dú)廪D(zhuǎn)化為植物可以直接利用的銨。目前該菌株的基因組測序工作已經(jīng)完成，在基因組序列中發(fā)現(xiàn)了一段69kb大小的nif固氮基因島，包含有58個(gè)不同的基因。然而基因組測序結(jié)果表明該細(xì)菌的次級代謝產(chǎn)物不豐富，抑菌能力較弱。

red/et同源重組和直接克隆技術(shù)是一種基于噬菌體重組酶的新型遺傳工程技術(shù)，它的基本原理是通過噬菌體重組酶介導(dǎo)大腸桿菌體內(nèi)的同源重組，從而對dna序列進(jìn)行修飾的重組技術(shù)。該技術(shù)不受dna分子大小和酶切位點(diǎn)的限制，能夠精確、高效地對基因簇進(jìn)行基因插入、基因敲除、點(diǎn)突變和模塊替換等操作，只需用30-50bp大小的同源臂就能獲得較高的重組效率。直接克隆技術(shù)則是利用recet重組酶將天然產(chǎn)物基因簇直接從微生物基因組一步克隆到大腸桿菌表達(dá)載體上，只需3天就能完成整個(gè)基因簇的克隆，而且重組步驟在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)發(fā)生，可以避免基因簇在克隆過程中發(fā)生突變。目前，該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于微生物天然產(chǎn)物基因簇的克隆和異源表達(dá)研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供熒光假單胞菌(pseudomonasprotegenspf5)突變菌株pf5-nif、pf5-△rets或pf5-△rets-nif。

本發(fā)明還提供上述菌株的篩選方法及其在生物防治中的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

熒光假單胞菌(pseudomonasprotegenspf5)突變菌株pf5-nif、pf5-△rets或pf5-△rets-nif，其保藏編號分別為cgmccno.13948、cgmccno.13949和cgmccno.13950(保藏單位：中國普通微生物菌種保藏管理中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期：2017年3月28日)。

熒光假單胞菌(pseudomonasprotegenspf5)突變菌株pf5-nif在促進(jìn)植物生長、殺菌和固氮方面的應(yīng)用。

熒光假單胞菌(pseudomonasprotegenspf5)突變菌株pf5-△rets在促進(jìn)植物生長和殺菌方面的應(yīng)用。

熒光假單胞菌(pseudomonasprotegenspf5)突變菌株pf5-△rets-nif在促進(jìn)植物生長、殺菌和固氮方面的應(yīng)用。

一種微生物菌劑，其有效成分為pf5-nif。

一種微生物菌劑，其有效成分為pf5-△rets。

一種微生物菌劑，其有效成分為pf5-△rets-nif。

熒光假單胞菌(pseudomonasprotegenspf5)突變菌株pf5-nif的篩選方法，將固氮斯氏假單胞菌dsm4166(pseudomonasstutzeridsm4166)基因組中的nif固氮基因島整體克隆到熒光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)的基因組中，使之順利異源表達(dá)，得到基因工程菌株pf5-nif。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，具體步驟如下：

(1)利用red/et直接克隆的方法，先使用限制性內(nèi)切酶aflii和sspi對固氮斯氏假單胞菌dsm4166的基因組dna進(jìn)行酶切，得到69kb大小nif固氮基因島，連接到相應(yīng)的載體上構(gòu)建質(zhì)粒，利用如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4所示的引物構(gòu)建質(zhì)粒pbelobac11-orit-tnpa-genta-nif，通過限制性內(nèi)切酶kpni進(jìn)行酶切鑒定，然后將結(jié)果正確的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入到大腸桿菌et12567中；

(2)通過接合轉(zhuǎn)移把來自大腸桿菌et12567中的質(zhì)粒pbelobac11-orit-tnpa-genta-nif導(dǎo)入熒光假單胞菌pf5中，然后通過轉(zhuǎn)座的方式nif基因隨機(jī)插入到pf5的基因組dna中；

(3)將菌落pcr驗(yàn)證后正確的轉(zhuǎn)化子pf5-nif送去測序，結(jié)果正確的分裝凍存。

作為進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟(2)的具體方法是：挑取單菌落，將熒光假單胞菌pf5(lb培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化鈉5g/l，調(diào)節(jié)ph至7.0)，30℃)與大腸桿菌et12567(lb+genta2μg/ml+cm10μg/ml+km1μg/ml培養(yǎng)基，37℃)分別過夜培養(yǎng)；將兩種過夜的菌液7000rpm，離心1分鐘，用新鮮的lb培養(yǎng)基分別將熒光假單胞菌pf5和大腸桿菌et12567洗滌兩遍后，用300μllb培養(yǎng)基重懸，分別各取50μl懸浮液，混勻，小范圍涂在lb平板中間，晾干，在37℃條件下孵育4h后，然后將平板在30℃的培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過夜；用接種環(huán)將平板上的菌刮下來，用ml無菌水懸浮混勻，取100μl菌液z字形劃線涂布于pmm(磷酸氫二鉀8g/l，磷酸二氫鉀5g/l，硫酸銨1g/l，琥珀酸鈉6.6g/l，調(diào)節(jié)ph至7.0，滅菌后加入1m硫酸鎂1.2ml/l)+genta25μg/ml+amp100μg/ml固體培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)2天，直至單菌落出現(xiàn)；挑單菌落接種于1mllb+genta25μg/ml+amp100μg/ml過夜培養(yǎng)，之后用seqidno.5～seqidno.14所示的5對引物進(jìn)行菌落pcr驗(yàn)證。

熒光假單胞菌(pseudomonasprotegenspf5)突變菌株pf5-△rets的篩選方法，通過基因定向無痕敲除熒光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)基因組中的rets基因，得到基因工程菌株pf5-△rets。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，具體步驟如下：

(1)把質(zhì)粒pbbr1-rha-tegpsy-kan通過電轉(zhuǎn)的方式導(dǎo)入到野生型的熒光假單胞菌pf5中，篩選到正確的轉(zhuǎn)化子pf5：：pbbr1-rha-tegpsy-kan；

(2)敲除熒光假單胞菌pf5基因組上的rets基因；

(3)將pcr驗(yàn)證和測序后正確的轉(zhuǎn)化子pf5-△rets分裝凍存。

作為進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟(1)的具體方法是：將電轉(zhuǎn)后的細(xì)菌涂布于含有30μg/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基的平板上，隨機(jī)挑選單菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，篩選到正確的轉(zhuǎn)化子pf5：：pbbr1-rha-tegpsy-kan。

作為進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟(2)的具體方法是：

(21)將線性dna片段loxm-genta電轉(zhuǎn)到步驟(1)得到的pf5：：pbbr1-rha-tegpsy-kan中，利用red/et同源重組的方法，在重組酶的作用下，慶大霉素抗性基因genta替換熒光假單胞菌pf5基因組上的rets基因，經(jīng)培養(yǎng)篩選得到正確的轉(zhuǎn)化子pf5：：△rets-genta-loxm；

(22)把能夠表達(dá)cre重組酶的pcm157質(zhì)粒電轉(zhuǎn)導(dǎo)入pf5：：△rets-genta-loxm中，經(jīng)培養(yǎng)篩選，利用異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)進(jìn)行誘導(dǎo)，挑取genta抗性基因已被消除的重組子進(jìn)行菌落pcr驗(yàn)證和測序。

作為更進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟(21)中線性dna片段loxm-genta是利用seqidno.15和seqidno.16所示的一對引物通過pcr擴(kuò)增得到的。

作為更進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟(21)的培養(yǎng)篩選方法為：將重組后的細(xì)菌涂布于含有15μg/mlgenta的lb培養(yǎng)基的平板上，隨機(jī)挑選多個(gè)單菌落進(jìn)行菌落pcr驗(yàn)證，篩選到正確的轉(zhuǎn)化子pf5：：△rets-genta-loxm。

作為更進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案之一，pcr驗(yàn)證是利用seqidno.13和seqidno.14所示的一對引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增驗(yàn)證的。

作為更進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟(22)的具體方法是：把能夠表達(dá)cre重組酶的pcm157質(zhì)粒電轉(zhuǎn)導(dǎo)入pf5：：△rets-genta-loxm中，涂布于含有25μg/ml四環(huán)素的lb培養(yǎng)基的平板上篩選；將得到的重組子接種到1ml含有25μg/ml四環(huán)素的lb培養(yǎng)基中，900rpm，30℃培養(yǎng)過夜；第二天將50μl過夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接到新鮮的1ml含有25μg/ml四環(huán)素的lb培養(yǎng)基中，900rpm，30℃培養(yǎng)3小時(shí)后，加入1mm的異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)后用藍(lán)色接種環(huán)將菌液z字形劃線于lb平板上，待長出單菌落后將分別雙劃線于lb培養(yǎng)基和含有g(shù)enta15μg/ml的lb培養(yǎng)基的兩種平板上30℃過夜培養(yǎng)；如果在兩種平板上都長出了單菌落，說明說明該重組子內(nèi)的genta抗性基因沒有被消除；如果在lb平板菌落生長出來，而在lb+genta15μg/m的平板上不生長，則說明該重組子內(nèi)的genta抗性基因已被消除；挑取此類genta抗性基因已被消除的重組子進(jìn)行菌落pcr驗(yàn)證和測序。

作為更進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案之一，pcr驗(yàn)證是利用seqidno.13和seqidno.14所示的一對引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增驗(yàn)證的。

熒光假單胞菌(pseudomonasprotegenspf5)突變菌株pf5-△rets-nif的篩選方法，通過接合轉(zhuǎn)移把來自大腸桿菌et12567中的質(zhì)粒pbelobac11-orit-tnpa-genta-nif導(dǎo)入突變的熒光假單胞菌pf5-△rets中，然后通過轉(zhuǎn)座的方式nif基因隨機(jī)插入到pf5-△rets的基因組dna中。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，具體步驟如下：

(1)把質(zhì)粒pbbr1-rha-tegpsy-kan通過電轉(zhuǎn)的方式導(dǎo)入到野生型的熒光假單胞菌pf5中，篩選到正確的轉(zhuǎn)化子pf5：：pbbr1-rha-tegpsy-kan；

(2)敲除熒光假單胞菌pf5基因組上的rets基因，得到突變的熒光假單胞菌pf5-△rets；

(3)利用red/et直接克隆的方法，先使用限制性內(nèi)切酶aflii和sspi對固氮斯氏假單胞菌dsm4166的基因組dna進(jìn)行酶切，獲得的69kb大小nif固氮基因島，dna片段凝膠電泳驗(yàn)證正確后，再連接到相應(yīng)的表達(dá)載體上，利用如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4所示的引物構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pbelobac11-orit-tnpa-genta-nif，通過限制性內(nèi)切酶kpni進(jìn)行酶切鑒定，然后將結(jié)果正確的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入到大腸桿菌et12567中；

(4)通過接合轉(zhuǎn)移把來自大腸桿菌et12567中的質(zhì)粒pbelobac11-orit-tnpa-genta-nif導(dǎo)入突變的熒光假單胞菌pf5-△rets中，然后通過轉(zhuǎn)座的方式nif基因隨機(jī)插入到pf5的基因組dna中。

作為進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟(1)的具體方法是：將電轉(zhuǎn)后的細(xì)菌涂布于含有30μg/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基的平板上，隨機(jī)挑選單菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，篩選到正確的轉(zhuǎn)化子pf5：：pbbr1-rha-tegpsy-kan。

作為進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟(2)的具體方法是：

(21)將線性dna片段loxm-genta電轉(zhuǎn)到步驟(1)得到的pf5：：pbbr1-rha-tegpsy-kan中，利用red/et同源重組的方法，在重組酶的作用下，慶大霉素抗性基因genta替換熒光假單胞菌pf5基因組上的rets基因，經(jīng)培養(yǎng)篩選得到正確的轉(zhuǎn)化子pf5：：△rets-genta-loxm；

(22)把能夠表達(dá)cre重組酶的pcm157質(zhì)粒電轉(zhuǎn)導(dǎo)入pf5：：△rets-genta-loxm中，經(jīng)培養(yǎng)篩選，利用異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)進(jìn)行誘導(dǎo)，挑取genta抗性基因已被消除的重組子進(jìn)行菌落pcr驗(yàn)證和測序。

作為更進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟(21)中線性dna片段loxm-genta是利用seqidno.15和seqidno.16所示的一對引物通過pcr擴(kuò)增得到的。

作為更進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟(21)的培養(yǎng)篩選方法為：將重組后的細(xì)菌涂布于含有15μg/mlgenta的lb培養(yǎng)基的平板上，隨機(jī)挑選多個(gè)單菌落進(jìn)行菌落pcr驗(yàn)證，篩選到正確的轉(zhuǎn)化子pf5：：△rets-genta-loxm。

作為更進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案之一，pcr驗(yàn)證是利用seqidno.13和seqidno.14所示的一對引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增驗(yàn)證的。

作為更進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟(22)的具體方法是：把能夠表達(dá)cre重組酶的pcm157質(zhì)粒電轉(zhuǎn)導(dǎo)入pf5：：△rets-genta-loxm中，涂布于含有25μg/ml四環(huán)素的lb培養(yǎng)基的平板上篩選；將得到的重組子接種到1ml含有25μg/ml四環(huán)素的lb培養(yǎng)基中，900rpm，30℃培養(yǎng)過夜；將50μl過夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接到新鮮的1ml含有25μg/ml四環(huán)素的lb培養(yǎng)基中，900rpm，30℃培養(yǎng)3小時(shí)后，加入1mm的異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)誘導(dǎo)2小時(shí)后，用藍(lán)色接種環(huán)將菌液z字形劃線于lb平板上，培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落。將分別雙劃線于lb培養(yǎng)基和含有15μg/mlgenta的lb培養(yǎng)基的兩種平板上30℃過夜培養(yǎng)；如果在兩種平板上都長出單菌落，說明說明該重組子內(nèi)的genta抗性基因沒有被消除；如果在lb平板菌落生長出來，而在lb+genta15μg/m的平板上不生長，則說明該重組子內(nèi)的genta抗性基因已被消除；挑取此類genta抗性基因已被消除的重組子進(jìn)行菌落pcr驗(yàn)證和測序。

作為更進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案之一，pcr驗(yàn)證是利用seqidno.13和seqidno.14所示的一對引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增驗(yàn)證的。

作為進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟(4)的具體方法是：

把突變的熒光假單胞菌pf5-△rets(lb培養(yǎng)基，30℃)與大腸桿菌et12567(lb+genta2μg/ml培養(yǎng)基，37℃)分別過夜培養(yǎng)；第二天用新鮮的lb培養(yǎng)基分別將突變的熒光假單胞菌pf5-△rets和大腸桿菌et12567清洗兩遍后，分別用300μllb等量溶解，混勻在一起，總共為600μl，9000rpm離心1分鐘后，棄大部分上清液，留50μl菌液與混菌重懸后，均勻地小范圍涂布于lb平板，37℃條件下溫育4h后，放入30℃的培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)；第三天用黃色接種環(huán)從lb平板上把共菌體轉(zhuǎn)到1mllb中混勻，取30μl菌液z字形劃線于pmm培養(yǎng)基+genta25μg/ml+amp100μg/ml，兩天后長出菌落，挑單菌落接種于1mllb+genta25μg/ml+amp100μg/ml過夜培養(yǎng)，之后用seqidno.5～seqidno.14所示的5對引物進(jìn)行菌落pcr驗(yàn)證，將pcr驗(yàn)證后正確的轉(zhuǎn)化子pf5-△rets-nif送去測序，結(jié)果正確的分裝凍存。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明利用red/et重組和直接克隆技術(shù)，將固氮斯氏假單胞菌dsm4166(pseudomonasstutzeridsm4166)基因組中的nif固氮基因島整體克隆到熒光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)的基因組中，使之順利異源表達(dá)，得到基因工程菌株pf5-nif，從而使本身無生物固氮的熒光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)產(chǎn)生生物固氮功能；此外，基因定向無痕敲除熒光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)基因組中的rets基因，得到基因工程菌株pf5-△rets，提高了抗生素2，4-二乙酰基藤黃酚(2,4-dapg)和紅色素的表達(dá)量，從而得到殺菌活性更強(qiáng)的熒光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)突變菌株。以前從未報(bào)道熒光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)能夠自身進(jìn)行生物固氮，用于植物生長促進(jìn)特性。將該基因工程菌株pf5-nif施用于栽培在溫室和田間條件下的不同作物后，其提供了顯著的生物固氮和生長促進(jìn)效果。此外，根據(jù)可得到的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，其作用一貫比任何其他先前記錄的植物生長促進(jìn)微生物制劑更加穩(wěn)定和可重復(fù)。

本發(fā)明提供了一株熒光假單胞突變菌株pf5-△rets及以其為活性成分的菌劑，室溫盆栽和田間試驗(yàn)證明該菌株具有防病害和促生長雙重功效，不僅對多種植物的土傳病害，如猝倒病、根腐病、枯萎病等均有很好的防治作用，而且還能夠很好地促進(jìn)植物生長?；蚪M學(xué)和分子生物學(xué)研究表明該菌株防治植物病害的主要機(jī)制是其能夠產(chǎn)生抑制病原菌生長的抗生素類物質(zhì)，如2，4-二乙?；冱S酚(2,4-dapg)和藤黃綠膿菌素等，以及良好的植物根際定殖能力。促進(jìn)植物生長的主要機(jī)制是其含有1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸鹽脫氨基酶基因，這種酶可以降低植物苗期根部及其周圍的乙烯含量，從而刺激植物的生長。

熒光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)及其突變菌株pf5-nif，pf5-△rets和pf5-△rets-nif在lb固體培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)2-3天后可長出單菌落，挑取單菌落接種到lb液體培養(yǎng)基中(可加入適當(dāng)?shù)目股赜糜谂囵B(yǎng)和篩選)，進(jìn)行后續(xù)的培養(yǎng)和遺傳操作，得到相應(yīng)的基因工程菌轉(zhuǎn)化子，經(jīng)酶切鑒定和測序后，將正確的基因工程菌大規(guī)模培養(yǎng)后用于室溫盆栽和田間試驗(yàn)。

本發(fā)明提供的熒光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)及其突變菌株pf5-nif，pf5-△rets和pf5-△rets-nif制成的菌劑，所述菌劑中熒光假單胞菌pf5的菌數(shù)可達(dá)1x10⁹cfu/ml以上；其菌劑制備工藝簡單，發(fā)酵周期短，具有很大的工業(yè)化生產(chǎn)潛能。本發(fā)明在防治作物土傳病害和促進(jìn)植物生長等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用空間和市場。

附圖說明

圖1為本發(fā)明中熒光假單胞突變菌株pf5-△rets的菌落pcr驗(yàn)證圖。

圖2為本發(fā)明中固氮斯氏假單胞菌dsm4166(pseudomonasstutzeridsm4166)的基因組dna中的nif固氮基因島的示意圖。

圖3為本發(fā)明中通過red/et直接克隆方法構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pbelobac11-orit-tnpa-genta-nif經(jīng)過限制性內(nèi)切酶kpni的酶切鑒定驗(yàn)證圖。

圖4為本發(fā)明中本發(fā)明中通過red/et直接克隆方法構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pbelobac11-orit-tnpa-genta-nif實(shí)驗(yàn)流程圖。

圖5為本發(fā)明中固氮熒光假單胞菌株pf5-nif的菌落pcr驗(yàn)證圖。

圖6為本發(fā)明中固氮突變的熒光假單胞菌株pf5-△rets-nif的菌落pcr驗(yàn)證圖。

圖7為本發(fā)明中熒光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)及其突變菌株pf5-nif，pf5-△rets和pf5-△rets-nif對枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)的抑菌實(shí)驗(yàn)。

圖8a～圖8c為本發(fā)明中擬南芥移栽入盆4周后固氮熒光假單胞菌株pf5-nif處理與對照施加氮肥no3^-和pf5盆栽效果示意圖。

保藏信息

分類名詞：熒光假單胞菌pseudomonasprotegens

保藏單位名稱：中國普通微生物菌種保藏管理中心

保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號

保藏日期：2017年3月28日

保藏號：cgmccno.13948

分類名詞：熒光假單胞菌pseudomonasprotegens

保藏單位名稱：中國普通微生物菌種保藏管理中心

保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號

保藏日期：2017年3月28日

保藏號：cgmccno.13949

分類名詞：熒光假單胞菌pseudomonasprotegens

保藏單位名稱：中國普通微生物菌種保藏管理中心

保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號

保藏日期：2017年3月28日

保藏號：cgmccno.13950

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述，應(yīng)該說明的是，下述說明僅是為了解釋本發(fā)明，并不對其內(nèi)容進(jìn)行限定。

實(shí)施例1：

熒光假單胞菌突變菌株pf5-△rets的篩選方法，具體操作步驟如下：

(1)把質(zhì)粒pbbr1-rha-tegpsy-kan(該質(zhì)粒可以在假單胞菌中表達(dá)重組酶)通過電轉(zhuǎn)的方式導(dǎo)入到野生型的熒光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)中，將電轉(zhuǎn)后的細(xì)菌涂布于lb培養(yǎng)基+卡那霉素(km，30μg/ml)的平板上，隨機(jī)挑選12個(gè)單菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，篩選到正確的轉(zhuǎn)化子pf5：：pbbr1-rha-tegpsy-kan；

(2)敲除熒光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)基因組上的rets基因。將線性dna片段loxm-genta(此片段通過pcr的方法得到，所用的一對引物為rets-genta-loxm-5’gcacacgcccttgccgtgcggtcattacgccgcgcatagttataatcaggcatcaaccaacgaagggatttcgccagctgaattacattcccaaccg/rets-genta-loxm-3’tggagcatggtgggagctcacgactaaaggagggcgagcgagagtttaacaggcgccgcagagcctgtcggctcacaacttaaatgtgaaagtgggtc，分別如seqidno.15和seqidno.16所示)電轉(zhuǎn)到步驟1)得到的pf5：：pbbr1-rha-tegpsy-kan中，利用red/et同源重組的方法，在重組酶的作用下，慶大霉素抗性基因(genta)將替換熒光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)基因組上的rets基因，將重組后的細(xì)菌涂布于lb培養(yǎng)基+genta15μg/ml的平板上，隨機(jī)挑選多個(gè)單菌落進(jìn)行菌落pcr驗(yàn)證(驗(yàn)證時(shí)用的引物為check-5’tgcttctaccgcaaggacatc/check-3’gctgatgaagcacgagagcac，分別如seqidno.13和seqidno.14所示)，篩選到正確的轉(zhuǎn)化子pf5：：△rets-genta-loxm；

消除pf5：：△rets-genta-loxm中的genta抗性基因。把能夠表達(dá)cre重組酶的pcm157質(zhì)粒電轉(zhuǎn)導(dǎo)入pf5：：△rets-genta-loxm中，涂布于lb培養(yǎng)基+四環(huán)素(tet25μg/ml)的平板上篩選。將得到的重組子接種到1mllb+tet25μg/ml液體培養(yǎng)基中，900rpm，30℃培養(yǎng)過夜。將50μl過夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接到新鮮的1mllb+tet25μg/ml液體培養(yǎng)基中，900rpm，30℃培養(yǎng)3小時(shí)后，加入1mm的異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)后用藍(lán)色接種環(huán)將菌液z字形劃線于lb平板上，待長出單菌落后將分別雙劃線于lb和lb+genta15μg/ml兩種平板上30℃過夜培養(yǎng)。如果在兩種平板上都長出了單菌落，說明說明該重組子內(nèi)的genta抗性基因沒有被消除；如果在lb平板菌落生長出來，而在lb+genta15μg/ml的平板上不生長，則說明該重組子內(nèi)的genta抗性基因已被消除。挑取此類genta抗性基因已被消除的重組子進(jìn)行菌落pcr驗(yàn)證和測序，引物為：

check-5’tgcttctaccgcaaggacatc/

check-3’gctgatgaagcacgagagcac；分別如seqidno.13和seqidno.14所示。

(3)將pcr驗(yàn)證和測序后正確的轉(zhuǎn)化子pf5-△rets分裝凍存，用于后續(xù)的抑菌、室溫盆栽和田間試驗(yàn)。

圖1顯示，m為dl5,000dna的marker，1-5號樣品為最終的轉(zhuǎn)化子pf5-△rets，6號樣品為pf5：：△rets-genta-loxm，在經(jīng)過iptg誘導(dǎo)產(chǎn)生的cre重組酶的作用下，介導(dǎo)兩個(gè)loxm位點(diǎn)(序列)之間的特異性重組，使loxm位點(diǎn)間的genta抗性基因序列被刪除，從而消除了外源抗性基因?qū)τ跓晒饧賳伟鷓f5(pseudomonasprotegenspf5)生長、繁殖和定殖等方面的影響，可以更加放心的使用。

實(shí)施例2：熒光假單胞菌突變菌株pf5-nif的篩選方法，具體操作步驟如下：

(1)利用red/et直接克隆的方法，先使用限制性內(nèi)切酶aflii和sspi對固氮斯氏假單胞菌dsm4166(pseudomonasstutzeridsm4166)的基因組dna進(jìn)行酶切，獲得的69kb大小nif固氮基因島(圖2)dna片段凝膠電泳驗(yàn)證正確后，再連接到相應(yīng)的表達(dá)載體上，所使用的引物為：

primer1:agtgaattgtaatacgactcactatagggcgaattcgagctcggtacccgcttaagtacggctacctggagctcgcgccagtg，如seqidno.1所示；

primer2:tacggctacctggagctcgcgccagtgcttgccgacatcgaatcacggccgctgctgcagcacgtggtggtcaccggccgggatccgtttaaacacaaatggcaagggctaatg，如seqidno.2所示；

primer3:attgatgttttccttggccagcgcctcgaacatccggctggcgacgcctgcgtgcgaacgcataccgacaccgacgatagggatccgtttaaacggtgtggtagctcgcgtatt，如seqidno.3所示；

primer4:gcgacactatagaatactcaagcttggcatgaatgcaggtcgactctagagaatattgatgttttccttggccagcgcctcgaac，如seqidno.4所示；

構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒pbelobac11-orit-tnpa-genta-nif(圖3)，通過限制性內(nèi)切酶kpni進(jìn)行酶切鑒定，然后將結(jié)果正確的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入到大腸桿菌et12567中(圖4)；

(2)通過接合轉(zhuǎn)移把來自大腸桿菌et12567中的質(zhì)粒pbelobac11-orit-tnpa-genta-nif導(dǎo)入熒光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)中，然后通過轉(zhuǎn)座的方式，nif基因可隨機(jī)插入到pf5的基因組dna中。接合轉(zhuǎn)移詳細(xì)操作為：平板挑取單菌落，把熒光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)(lb培養(yǎng)基，30℃)與大腸桿菌et12567(lb+genta2μg/ml+cm10μg/ml+km1μg/ml培養(yǎng)基，37℃)分別過夜培養(yǎng)；將兩種過夜的菌液7000rpm，離心1分鐘。用新鮮的lb培養(yǎng)基分別將熒光假單胞菌pf5和大腸桿菌et12567洗滌兩遍后，用300μllb培養(yǎng)基重懸，分別各取50μl懸浮液，混勻，小范圍涂在lb平板中間，晾干。在37℃條件下孵育4h后，將平板在30℃的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜；用接種環(huán)將平板上的菌刮下來，用1ml無菌水懸浮混勻，取100μl菌液z字形劃線涂布于pmm培養(yǎng)基+genta25μg/ml平板上，30℃倒置培養(yǎng)2天，直至單菌落出現(xiàn)；兩天后長出菌落，挑單菌落接種于1mllb+genta25μg/ml過夜培養(yǎng)，之后用以下的5對引物進(jìn)行菌落pcr驗(yàn)證，引物為：

nif-check-1ggtctaccagctcgacct/

nif-check-2cgattccagcgtcgaatgat；

nif-check-3gctgacctccttgaggtgct/

nif-check-4cagcggcacctcgaggagt；

nif-check-5gatagagcaggtcctcgat/

nif-check-6ggtgctctacgtcagccatt；

nif-check-7cgacagatcctgattaccgt/

nif-check-8taccctcgaccagcttgagca；

check-5’tgcttctaccgcaaggacatc/

check-3’gctgatgaagcacgagagcac；分別如seqidno.5～seqidno.14所示；

前4對引物用于驗(yàn)證nif固氮基因是否已經(jīng)整體整合到熒光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)的基因組當(dāng)中，擴(kuò)增出的pcr片段的分別為1000bp、970bp、830bp、1080bp，第5對引物是為了驗(yàn)證導(dǎo)入nif固氮基因的菌株是熒光假單胞菌pf5而不是大腸桿菌et12567，其pcr擴(kuò)增結(jié)果是dna片段大小為3200bp的rets基因；

(3)將菌落pcr驗(yàn)證后正確的轉(zhuǎn)化子pf5-nif送去測序，結(jié)果正確的分裝凍存，用于后續(xù)的抑菌、室溫盆栽和田間試驗(yàn)。

圖5顯示，m為dl5,000dna的marker，ck1為野生型熒光假單胞菌pf5，ck2為大腸桿菌et12567，二者作為對照組。其中5列dna電泳圖代表了一個(gè)pf5-nif轉(zhuǎn)化子用上述的5對引物做了5次菌落pcr驗(yàn)證，經(jīng)過反復(fù)仔細(xì)比對后，有藍(lán)色方框標(biāo)注的為正確的轉(zhuǎn)化子pf5-nif，從而證明固氮斯氏假單胞菌dsm4166(pseudomonasstutzeridsm4166)中的nif固氮基因已經(jīng)整體整合到熒光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)的基因組當(dāng)中，從而獲得了正確的轉(zhuǎn)化子pf5-nif。

實(shí)施例3：熒光假單胞菌突變菌株pf5-△rets-nif的篩選方法，具體操作步驟如下：

通過接合轉(zhuǎn)移把來自大腸桿菌et12567中的質(zhì)粒pbelobac11-orit-tnpa-genta-nif導(dǎo)入突變的熒光假單胞菌pseudomonasprotegenspf5-△rets中，然后通過轉(zhuǎn)座的方式nif基因可隨機(jī)插入到pf5-△rets的基因組dna中。接合轉(zhuǎn)移詳細(xì)操作為：把突變的熒光假單胞菌pseudomonasprotegenspf5-△rets(lb培養(yǎng)基，30℃)與大腸桿菌et12567(lb+genta2μg/ml培養(yǎng)基，37℃)分別過夜培養(yǎng)。第二天用新鮮的lb培養(yǎng)基分別將突變的熒光假單胞菌pseudomonasprotegenspf5-△rets和大腸桿菌et12567清洗兩遍后，分別用500μllb等量溶解，混勻在一起，總共為1ml，9000rpm離心1分鐘后，棄大部分上清液，留100μl菌液與混菌重懸后，均勻地小范圍涂布于lb平板，37℃條件下溫育4h后，放入30℃的培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。第三天用黃色接種環(huán)從lb平板上把共菌體轉(zhuǎn)到1mllb中混勻，取30μl菌液z字形劃線于pmm培養(yǎng)基+genta25μg/ml，兩天后長出菌落，挑單菌落接種于1mllb+genta25μg/ml過夜培養(yǎng)，之后用實(shí)施例2中的5對引物進(jìn)行菌落pcr驗(yàn)證，其中為了前4對引物用于驗(yàn)證nif固氮基因是否已經(jīng)整體整合到熒光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)的基因組當(dāng)中，擴(kuò)增出的pcr片段的分別為1000bp、970bp、830bp、1080bp，第5對引物是為了驗(yàn)證導(dǎo)入nif固氮基因的菌株是熒光假單胞菌pf5而不是大腸桿菌et12567，但因?yàn)檫@次nif固氮基因電轉(zhuǎn)入的是已經(jīng)敲除了rets基因的突變熒光假單胞菌株pf5-△rets，所以其pcr擴(kuò)增結(jié)果是大小為400bp的dna片段；將pcr驗(yàn)證后正確的轉(zhuǎn)化子pf5-△rets-nif送去測序，結(jié)果正確的分裝凍存，用于后續(xù)的抑菌、室溫盆栽和田間試驗(yàn)。

圖6顯示，m為1kbdna的marker，ck1為已經(jīng)敲除了rets基因的突變熒光假單胞菌pf5-△rets，ck2為大腸桿菌et12567，二者作為對照組。其中5列dna電泳圖代表了一個(gè)pf5-nif轉(zhuǎn)化子用上述的5對引物做了5次菌落pcr驗(yàn)證，經(jīng)過反復(fù)仔細(xì)比對后，有藍(lán)色方框標(biāo)注的為正確的轉(zhuǎn)化子pf5-nif，從而證明固氮斯氏假單胞菌dsm4166(pseudomonasstutzeridsm4166)中的nif固氮基因已經(jīng)整體整合到已經(jīng)敲除了rets基因的突變熒光假單胞菌pf5-△rets的基因組當(dāng)中，從而獲得了正確的轉(zhuǎn)化子pf5-△rets-nif。

本發(fā)明得到的幾種熒光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)及其突變菌株pf5-nif，pf5-△rets和pf5-△rets-nif的相關(guān)信息，如表1所示。

表1.各個(gè)菌株的相關(guān)信息

試驗(yàn)例1

采用濾紙片法，檢測熒光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)及其突變菌株pf5-nif，pf5-△rets和pf5-△rets-nif對枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)的抑制作用，具體操作步驟如下：

(1)將枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)和實(shí)驗(yàn)菌株熒光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)及其突變菌株pf5-nif，pf5-△rets和pf5-△rets-nif分別接種到1mllb液體培養(yǎng)基，900rpm，30℃過夜培養(yǎng)；

(2)第二天把枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)9000rpm，離心1分鐘后，留100μl菌液均勻涂布在lb固體平板上，待晾干后在該平板上放置若干個(gè)直徑6mm的雙層濾紙片，取5μl過夜培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)菌株熒光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)及其突變菌株pf5-nif，pf5-△rets和pf5-△rets-nif的菌液分別滴加到濾紙片上。將此平板放置在30℃條件下培養(yǎng)過夜；

(3)第三天觀察平板上各個(gè)小濾紙片周邊的抑菌圈大小。

圖7顯示，已經(jīng)敲除了rets基因的熒光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)突變菌株pf5-△rets和pf5-△rets-nif的抑菌圈比未敲除rets基因的熒光假單胞菌pf5和pf5-nif的抑菌圈明顯要大，從而說明其抑制枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)的能力，在△rets基因敲除后得到了增強(qiáng)。

試驗(yàn)例2

固氮熒光假單胞菌株pf5-nif的室溫盆栽試驗(yàn)，以擬南芥為試驗(yàn)對象，試驗(yàn)方案如下：

1)使用野生型擬南芥col-0為試驗(yàn)對象，試驗(yàn)條件：溫度為20℃，光照強(qiáng)度80μmol·m^-2·s^-1，

光照周期：16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗；試驗(yàn)分為3個(gè)組：

①正常施加氮肥1mm(no3^-)組，作為對照

②未施加氮肥，但施加了正常的熒光假單胞菌株pf5

③未施加氮肥，但施加了固氮熒光假單胞菌株pf5-nif

2)擬南芥種子預(yù)處理：種子放置于4℃的冰箱2-4天(讓種子春化，使該批試驗(yàn)種子的發(fā)芽率保持齊平)；種子消毒：在2w.t.％次氯酸鈉(naclo)中脫毒15分鐘后(脫毒過程中不斷搖晃，使種子充分被接觸)，隨后用無菌水對種子進(jìn)行沖洗5-10遍；

3)將擬南芥種子播種在1/2ms固體培養(yǎng)基上(相同位置的種子不能過多)。具體操作：將ep管中的上清液用移液槍頭吸掉，吸取200μl培養(yǎng)基，讓液體緩慢流至槍尖，然后輕輕地點(diǎn)在ms培養(yǎng)基上，之后把平皿豎著培養(yǎng)；

4)移苗：當(dāng)ms培養(yǎng)基上長出小苗后(需10天左右的時(shí)間)，移植到土壤培養(yǎng)基中(蛭石：黑土(質(zhì)量比)＝1:1)，每個(gè)花盆三棵苗，移植過程中一定不要弄斷小苗的根部；

5)接菌：挑平板上的pf5-nif單菌落在kb培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜，第二天按照過夜菌液：新鮮培養(yǎng)基(體積比)＝1:50的比例接種于lb培養(yǎng)基，220rpm，30℃培養(yǎng)至od600＝0.6左右(pf5-nif的菌數(shù)可達(dá)1x10⁹cfu/ml)，取1ml菌液接種于擬南芥幼苗根際周圍0.5mm范圍內(nèi)，連續(xù)接種3天；

6)在溫室中按照設(shè)定的試驗(yàn)條件進(jìn)行培育，

用于室溫盆栽試驗(yàn)的各培養(yǎng)基成分如下：

ms培養(yǎng)基：nh4no31.65g/l，kno31.9g/l，cacl2·2h2o0.44g/l，mgso4·7h2o0.37g/l，kh2po40.17g/l，ki0.83mg/l，h3bo36.2mg/l，mnso4·4h2o22.3mg/l，znso4·7h2o8.6mg/l，na2moo4·2h2o0.25mg/l，cuso4·5h2o0.025mg/l，cocl2·6h2o0.025mg/l，feso4·7h2o27.8mg/l，na2-edta·2h2o37.3mg/l，肌醇100mg/l，煙酸0.5mg/l，維生素b60.5mg/l，維生素b10.1mg/l，甘氨酸2mg/l。

kb培養(yǎng)基：k2hpo40.1g/l，kh2po40.4g/l，nacl0.1g/l，mgso4·7h2o0.01g/l，fe2(so4)3·h2o0.01g/l，znso4·7h2o0.01g/l，mncl2h2o0.01g/l，namoo40.01g/l，cacl22h2o0.1g/l，檸檬酸鈉1g/l，葡萄糖5.5g/l，酵母提取物0.2g/l，調(diào)節(jié)ph至7.0。

圖8a～圖8c顯示，經(jīng)過四周的室溫盆栽試驗(yàn)，未施加氮肥，但施加了正常的熒光假單胞菌株pf5的②試驗(yàn)組中，擬南芥的長勢不好，葉小莖短，遠(yuǎn)不如其余兩個(gè)試驗(yàn)組(圖8a，圖8c)。而在未施加氮肥，但施加了固氮熒光假單胞菌株pf5-nif③試驗(yàn)組中，擬南芥的長勢和葉子大小等表型還要優(yōu)于施加了氮肥的①試驗(yàn)組(圖8c)，這是由于pf5-nif不僅能夠進(jìn)行生物固氮，減少氮肥的使用，更由于熒光假單胞菌株pf5其自身的殺菌和促植物生長的功效，使得植物能夠茁壯生長，各項(xiàng)指標(biāo)超過了對照組(圖8a，圖8c)。

利用本發(fā)明獲得的固氮熒光假單胞菌株pf5-nif處理的盆栽擬南芥綠色質(zhì)量平均提高了約8％(圖8b)，植株在未施加氮肥的條件下，看上去更綠更茁壯。

上述雖然結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但并非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動(dòng)即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。

sequencelisting

<110>山東大學(xué)，德州邁科生物技術(shù)有限公司

<120>熒光假單胞菌突變菌株的篩選方法及其在生物防治中的應(yīng)用

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