本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種病毒檢測方法及同步檢測HIV-1、HBV和HCV的試劑盒。

背景技術(shù)：

在科學(xué)實驗或者其他行業(yè)中，對樣品中含有的待測病毒進行檢測時，一般都需要選用一個陽性對照樣本和內(nèi)在陽性質(zhì)控，來指示實驗結(jié)果的正確性。現(xiàn)有技術(shù)中，錯誤或者不當(dāng)選用陽性對照樣本和內(nèi)在陽性質(zhì)控，都不能很好的指示整個病毒檢測過程，容易造成假陽性或者假陰性現(xiàn)象，降低檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，需要選擇合適的內(nèi)在陽性質(zhì)控樣本，來準(zhǔn)確指示檢測結(jié)果。

所以，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的在于提供一種病毒檢測方法，以提高檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的技術(shù)問題。

本發(fā)明提供的一種病毒檢測方法，其特征在于，該方法以HTLV-1為內(nèi)在陽性質(zhì)控，包括如下步驟：

(1)提取待測樣本的核酸和HTLV-1的核酸；

(2)以待測樣本的核酸和HTLV-1的核酸為模板進行基因擴增反應(yīng)；

(3)對擴增結(jié)果進行分析。

進一步的，

步驟(2)中，所述以待測樣本的核酸和HTLV-1的核酸為模板進行基因擴增反應(yīng)，為直接以待測樣本的核酸和HTLV-1的核酸為模板進行基因擴增反應(yīng)。

進一步的，

步驟(2)中，所述以待測樣本的核酸和HTLV-1的核酸為模板進行基因擴增反應(yīng)，為先以待測樣本的核酸和HTLV-1的核酸為模板進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，再以反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)完成后的反應(yīng)液為模板進行基因擴增反應(yīng)。

進一步的，所述基因擴增反應(yīng)為定量PCR反應(yīng)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)或者依賴核酸序列的擴增反應(yīng)。

進一步的，所述基因擴增反應(yīng)的引物包括：

HIV-1的上游引物，HIV-1的下游引物，HBV的上游引物，HBV的下游引物，HCV的上游引物，HCV的下游引物，HTLV-1的上游引物，HTLV-1的下游引物，HIV-1的探針，HBV的探針，HCV的探針，HTLV-1的探針；

所述病毒檢測方法能夠同步檢測HIV-1、HBV和HCV三種病毒。

進一步的，

所述HIV-1的上游引物為：

5’-TAAAGCTTGCCTTGAGTGCT-3’(SEQ ID NO：1)，

所述HIV-1的下游引物為：

5’-GTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAG-3’(SEQ ID NO：2)，

所述HIV-1的探針為：

5’-FAM-AGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTG-3’(SEQ ID NO：3)，

所述HBV的上游引物為：

5’-CAACCTCCAATCACTCACCAACC-3’(SEQ ID NO：4)，

所述HBV的下游引物為：

5’-ATATGATAAAACGCCGCAGACAC-3’(SEQ ID NO：5)，

所述HBV的探針為：

5’-Cy5-TCCTCCAATTTGTCCTGGTTATCGCT-3’(SEQ ID NO：6)，

所述HCV的上游引物為：

5’-TGCTAGCCGAGTAGYGTTGG-3’(SEQ ID NO：7)，

所述HCV的下游引物為：

5’-ACTCGCAAGCACCCTATCAG-3’(SEQ ID NO：8)，

所述HCV的探針為：

5’-FAM-CAGCGCTTTCCGGAACACCA-3’(SEQ ID NO：9)，

所述HTLV-1的上游引物為：

5’-AATAATTCTACCCGAAGACTGTTTGC-3’(SEQ ID NO：10)，

所述HTLV-1的下游引物為：

5’-ATTGTCGGACCGTTGTGCC-3’(SEQ ID NO：11)，

所述HTLV-1的探針為：

5’-ROX-TTTCCAGCCTGTTAGGGCACCCGT-3’(SEQ ID NO：12)。

本發(fā)明提供的一種同步檢測HIV-1、HBV和HCV的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括HTLV-1內(nèi)在陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品。

進一步的，所述HTLV-1標(biāo)準(zhǔn)品中HTLV-1的濃度為0-10⁶IU/mL。

進一步的，所述試劑盒還包括：HIV-1的上游引物，HIV-1的下游引物，HBV的上游引物，HBV的下游引物，HCV的上游引物，HCV的下游引物，HTLV-1的上游引物，HTLV-1的下游引物。

進一步的，所述試劑盒還包括HIV-1的探針，HBV的探針，HCV的探針，HTLV-1的探針；

所述HIV-1的上游引物為：

5’-TAAAGCTTGCCTTGAGTGCT-3’(SEQ ID NO：1)，

所述HIV-1的下游引物為：

5’-GTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAG-3’(SEQ ID NO：2)，

所述HIV-1的探針為：

5’-FAM-AGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTG-3’(SEQ ID NO：3)，

所述HBV的上游引物為：

5’-CAACCTCCAATCACTCACCAACC-3’(SEQ ID NO：4)，

所述HBV的下游引物為：

5’-ATATGATAAAACGCCGCAGACAC-3’(SEQ ID NO：5)，

所述HBV的探針為：

5’-Cy5-TCCTCCAATTTGTCCTGGTTATCGCT-3’(SEQ ID NO：6)，

所述HCV的上游引物為：

5’-TGCTAGCCGAGTAGYGTTGG-3’(SEQ ID NO：7)，

所述HCV的下游引物為：

5’-ACTCGCAAGCACCCTATCAG-3’(SEQ ID NO：8)，

所述HCV的探針為：

5’-FAM-CAGCGCTTTCCGGAACACCA-3’(SEQ ID NO：9)，

所述HTLV-1的上游引物為：

5’-AATAATTCTACCCGAAGACTGTTTGC-3’(SEQ ID NO：10)，

所述HTLV-1的下游引物為：

5’-ATTGTCGGACCGTTGTGCC-3’(SEQ ID NO：11)，

所述HTLV-1的探針為：

5’-ROX-TTTCCAGCCTGTTAGGGCACCCGT-3’(SEQ ID NO：12)。

進一步的，所述試劑盒還包括：HIV-1的上游引物，HIV-1的下游引物，HBV的上游引物，HBV的下游引物，HCV的上游引物，HCV的下游引物，HTLV-1的上游引物，HTLV-1的下游引物。

本發(fā)明提供的病毒檢測方法，以HTLV-1作為內(nèi)在陽性質(zhì)控，從樣品處理的最初步驟監(jiān)測整個病毒檢測過程，增加了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外本發(fā)明提供的同步檢測HIV-1、HBV和HCV的試劑盒，通過以HTLV-1作為內(nèi)在陽性質(zhì)控，能夠監(jiān)測整個病毒檢測過程，增加檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為實施例1所建立的病毒檢測方法穩(wěn)定性驗證結(jié)果圖；

圖2為實施例1所建立的病毒檢測方法的檢測閾值驗證結(jié)果圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

本發(fā)明的一方面提供了一種病毒檢測方法，該方法以HTLV-1為內(nèi)在陽性質(zhì)控，包括如下步驟：

(1)提取待測樣本的核酸和HTLV-1的核酸；

(2)以待測樣本的核酸和HTLV-1的核酸為模板進行基因擴增反應(yīng)；

(3)對擴增結(jié)果進行分析。

其中HTLV-1為人類T淋巴細(xì)胞白血病病毒I型，本方法中用到的HTLV-1來自購自于美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection，ATCC)。

該方法中，選取了HTLV-1作為內(nèi)在陽性質(zhì)控，從檢測的最初階段進行監(jiān)控，能夠監(jiān)測整個病毒檢測過程，完美的體現(xiàn)了內(nèi)在陽性質(zhì)控的作用，增加了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

當(dāng)HTLV-1的檢測結(jié)果為陰性時，表明該檢測結(jié)果為假陰性，待測樣品的檢測結(jié)果不可信，需要進一步驗證，因此本方法能夠?qū)嶒灲Y(jié)果起到指示作用。

當(dāng)待檢測病毒包含HTLV-1時，待檢測樣品和HTLV-1需在不同的試管內(nèi)進行反應(yīng)；當(dāng)待檢測病毒不包含HTLV-1時，待檢測樣品和HTLV-1可在同一試管內(nèi)進行核酸的提取以及后續(xù)的基因擴增反應(yīng)，大大降低了操作的繁瑣程度，并同時監(jiān)控整個病毒檢測過程。

在一個優(yōu)選的實施方式中，HTLV-1的最佳使用濃度為0-10⁶IU/mL(其中不包括0IU/mL，但包括10⁶IU/mL)，0-10⁶IU/mL的HTLV-1能夠滿足檢測的需求，實現(xiàn)本發(fā)明要達到的功能。其中，IU表示HTLV-1的國際單位。

在另一優(yōu)選的實施方式中，待檢測病毒為一種病毒或者多種病毒。

在另一優(yōu)選的實施方式中，待檢測病毒為DNA病毒或者RNA病毒。例如可以為艾滋病病毒(HIV-1)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人類微小病毒B19(HPV B19)、人類皰疹病毒(HHV)、人類乳頭瘤病毒(HPV)、單純皰疹病毒(HSV)中的一種或者多種。

在另一個優(yōu)選的實施方式中，當(dāng)待檢測病毒中僅含有RNA病毒時，步驟(2)中的以待測樣本的核酸和HTLV-1的核酸為模板進行基因擴增反應(yīng)，具體為采用依賴核酸序列的擴增技術(shù)，直接以待測樣本的核酸和HTLV-1的核酸為模板進行依賴核酸序列的擴增反應(yīng)，而無需將待測樣本的核酸和HTLV-1的核酸進行反轉(zhuǎn)錄。

其中，依賴核酸序列的擴增技術(shù)，即Nuclear acid sequence-based amplification(NASBA)，依賴核酸序列的擴增反應(yīng)，即應(yīng)用了依賴核酸序列的擴增技術(shù)的反應(yīng)。

在另一個優(yōu)選的實施方式中，當(dāng)待檢測病毒中含有DNA病毒時時，同樣也采用依賴核酸序列的擴增技術(shù)，直接以待測樣本的核酸和HTLV-1的核酸為模板進行基因擴增，而無需進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，同樣能夠獲得擴增結(jié)果。

在另一個優(yōu)選的實施方式中，當(dāng)待檢測病毒中僅含有RNA病毒或者DNA病毒時，步驟(2)中以待測樣本的核酸和HTLV-1的核酸為模板進行基因擴增反應(yīng)，具體為先以待測樣本的核酸和HTLV-1的核酸為模板進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，再以反轉(zhuǎn)錄完成后的反應(yīng)液為模板進行定量PCR反應(yīng)。

在另一個優(yōu)選的實施方式中，當(dāng)待檢測病毒中僅含有RNA病毒或者DNA病毒時，步驟(2)中的以待測樣本的核酸和HTLV-1的核酸為模板進行基因擴增反應(yīng)，具體為先以待測樣本的核酸和HTLV-1的核酸為模板進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，再以反轉(zhuǎn)錄完成后的反應(yīng)液為模板進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)。

在另一個優(yōu)選的實施方式中，定量PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系中，各引物的最佳使用濃度為0.2-1μM，引物濃度過高或者過低均會對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。

在另一個優(yōu)選的實施方式中，定量PCR反應(yīng)的反應(yīng)步驟為：

現(xiàn)結(jié)合具體實施例對該方法進行詳細(xì)的介紹。

實施例1

實施例1以同步檢測待測樣品中HIV-1、HBV和HCV為例，對本發(fā)明提供的病毒檢測方法進行詳細(xì)介紹。

(一)儀器試劑

主要儀器：熒光定量PCR儀

主要試劑：核酸提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、定量PCR試劑盒

(二)引物設(shè)計

當(dāng)待檢測病毒為HIV-1、HBV和HCV時，根據(jù)HIV-1、HBV、HCV和HTLV-1的基因組序列，設(shè)計HIV-1、HBV、HCV和HTLV-1的上、下游引物以及HIV-1、HBV、HCV和HTLV-1的探針引物如下，

HIV-1的上游引物為：

5’-TAAAGCTTGCCTTGAGTGCT-3’(SEQ ID NO：1)，

HIV-1的下游引物為：

5’-GTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAG-3’(SEQ ID NO：2)，

HIV-1的探針為：

5’-FAM-AGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTG-3’(SEQ ID NO：3)，

HBV的上游引物為：

5’-CAACCTCCAATCACTCACCAACC-3’(SEQ ID NO：4)，

HBV的下游引物為：

5’-ATATGATAAAACGCCGCAGACAC-3’(SEQ ID NO：5)，

HBV的探針為：

5’-Cy5-TCCTCCAATTTGTCCTGGTTATCGCT-3’(SEQ ID NO：6)，

HCV的上游引物為：

5’-TGCTAGCCGAGTAGYGTTGG-3’(SEQ ID NO：7)，

HCV的下游引物為：

5’-ACTCGCAAGCACCCTATCAG-3’(SEQ ID NO：8)，

HCV的探針為：

5’-FAM-CAGCGCTTTCCGGAACACCA-3’(SEQ ID NO：9)，

HTLV-1的上游引物為：

5’-AATAATTCTACCCGAAGACTGTTTGC-3’(SEQ ID NO：10)，

HTLV-1的下游引物為：

5’-ATTGTCGGACCGTTGTGCC-3’(SEQ ID NO：11)，

HTLV-1的探針為：

5’-ROX-TTTCCAGCCTGTTAGGGCACCCGT-3’(SEQ ID NO：12)。

其中HIV-1、HBV、HCV和HTLV-1的探針引物中的FAM、Cy5、FAM、ROX為熒光集團，淬滅基團可以選擇BHQ1或者TAMRA。

(三)實驗

向離心管中加入10μL待測樣本和HTLV-1，得到混合樣本，混合樣本中HTLV-1的濃度為10³copies/mL，使用核酸提取試劑盒，按照其說明書操作步驟，提取混合樣本的核酸。

以混合樣本的核酸為模板，進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所用試劑來自反轉(zhuǎn)錄試劑盒，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的反應(yīng)體系如下：

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的反應(yīng)條件如下：

以反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)完成后的反應(yīng)液為模板，進行定量PCR反應(yīng)，定量PCR反應(yīng)所用試劑來自定量PCR試劑盒，定量PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系如下：

1x PCR buffer,5mM的MgCl₂,1.6μM的dNTPs,0.2μM的HIV-1的上游引物,0.2μM的HIV-1的下游引物,0.2μM的HBV的上游引物,0.2μM的HBV的下游引物，0.2μM的HCV的上游引物,0.2μM的HCV的下游引物，0.8μM的HTLV-1的上游引物,0.8μM的HTLV-1的下游引物，0.8μM的HIV-1探針引物，0.8μM的HBV的探針引物，0.8μM的HCV的探針引物，0.8μM的HTLV-1的探針引物，2.5UTaq DNA聚合酶，10μL的cDNA。

將定量PCR反應(yīng)的反應(yīng)液置于熒光定量PCR儀中進行定量PCR反應(yīng)，定量PCR反應(yīng)的反應(yīng)條件如下：

對反應(yīng)結(jié)果進行分析，分別得到HIV-1、HBV、HCV和HTLV-1的溶解曲線和擴增曲線。當(dāng)需要知道待測病毒的具體濃度時，由于HTLV-1的濃度已知，由此可計算出待測樣本中HIV-1、HBV和HCV的具體濃度；當(dāng)僅需確定樣品中有無待測病毒存在時，則只需判斷能否得到各病毒的擴增Ct值，即可確定樣本中是否有HIV-1、HBV或者HCV的存在，若HTLV-1的檢測結(jié)果為陰性，則表示操作過程或者所用試劑等有可能影響檢測結(jié)果的因素有誤，該檢測結(jié)果不可信，HTLV-1起到內(nèi)在陽性質(zhì)控的作用。

由于當(dāng)待檢測病毒為HIV-1、HBV和HCV時，HTLV-1的基因與HIV-1、HBV和HCV的基因不同，因此，從最初的核酸提取過程，即可將HTLV-1加入到待測樣本中，HTLV-1也因此能夠監(jiān)控包括核酸提取和基因擴增在內(nèi)的整個病毒檢測過程；而且HTLV-1作為非競爭性內(nèi)在陽性質(zhì)控，不會抑制HIV-1、HBV和HCV的復(fù)制。

實施例1所建立的病毒檢測方法穩(wěn)定性驗證

為了驗證選用HILV-1作為內(nèi)在陽性質(zhì)控的實驗結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性，以同步檢測待測樣本中HBV、HCV和HIV-1為例，進行驗證實驗如下：

(1)收集143份樣本，隨機分成7組；

(2)向每組樣本中添加10³拷貝數(shù)HTLV-1，使用核酸提取試劑盒，按照其說明書操作步驟，提取每組樣本的核酸。

(3)以步驟(2)中提取的核酸為模板，進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的反應(yīng)體系如下：

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的反應(yīng)條件如下：

以反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)完成后的反應(yīng)液為模板，進行定量PCR反應(yīng)，定量PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系如下：

1x PCR buffer,5mM的MgCl₂,1.6μM的dNTPs,0.2μM的HIV-1的上游引物,0.2μM的HIV-1的下游引物,0.2μM的HBV的上游引物,0.2μM的HBV的下游引物，0.2μM的HCV的上游引物,0.2μM的HCV的下游引物，0.8μM的HTLV-1的上游引物,0.8μM的HTLV-1的下游引物，0.8μM的HIV-1的探針引物，0.8μM的HBV的探針引物，0.8μM的HCV的探針引物，0.8μM的HTLV-1的探針引物，2.5UTaq DNA聚合酶，10μL的cDNA。

將定量PCR反應(yīng)的反應(yīng)液置于熒光定量PCR儀中進行定量PCR反應(yīng)，定量PCR反應(yīng)的反應(yīng)條件如下：

對擴增結(jié)果進行分析，得到各組針對HTLV-1的溶解曲線和擴增曲線，對反應(yīng)結(jié)果進行分析，將各組中針對HTLV-1的Ct值作圖，結(jié)果如圖1所示，圖1中橫坐標(biāo)表示1-7七個組，縱坐標(biāo)表示HTLV-1的Ct值，柱狀圖中的n表示每組中樣本的個數(shù)；以第一組為例，由圖1可以看出，第一組中樣本的個數(shù)為52個，該組檢測結(jié)果中HTLV-1的Ct值的平均值為33.6。

由圖1可知，各組中HTLV-1的擴增Ct平均值維持在33.4-34之間，表明實驗結(jié)果穩(wěn)定性和重復(fù)性良好。

實施例1所建立的病毒檢測方法的檢測閾值驗證

為了驗證應(yīng)用該病毒檢測方法同步檢測HBV、HCV和HIV-1時的靈敏性，特制作了含有相同已知核酸濃度的HBV、HCV和HIV-1的待測樣品，待測樣品標(biāo)號以HBCIV表示，例如樣品HBCIV 100,000表示該樣品中HBV、HCV和HIV-1的核酸濃度均為100,000IU/mL；樣品HBCIV 10,000表示該樣品中HBV、HCV和HIV-1的核酸濃度均為10,000IU/mL，以此類推。

針對每個待測樣品均進行如下操作：

向離心管中加入10μL待測樣品和一定濃度的HTLV-1，得到混合樣本，混合樣本中HTLV-1的濃度為10³copies/mL，使用核酸提取試劑盒，按照其說明書操作步驟，提取混合樣本的核酸。

以混合樣本的核酸為模板，進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的反應(yīng)體系如下：

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的反應(yīng)條件如下：

以反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)完成后的反應(yīng)液為模板，進行定量PCR反應(yīng)，定量PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系如下：

1x PCR buffer,5mM的MgCl₂,1.6μM的dNTPs,0.2μM的HIV-1的上游引物,0.2μM的HIV-1的下游引物,0.2μM的HBV的上游引物,0.2μM的HBV的下游引物，0.2μM的HCV的上游引物,0.2μM的HCV的下游引物，0.8μM的HTLV-1的上游引物,0.8μM的HTLV-1的下游引物，0.8μM的HIV-1的探針引物，0.8μM的HBV的探針引物，0.8μM的HCV的探針引物，0.8μM的HTLV-1的探針引物，2.5UTaq DNA聚合酶，10μL的cDNA。

將定量PCR反應(yīng)的反應(yīng)液置于熒光定量PCR儀中進行定量PCR反應(yīng)，定量PCR反應(yīng)的反應(yīng)條件如下：

對擴增結(jié)果進行分析，得到各病毒相應(yīng)的溶解曲線和擴增曲線，對反應(yīng)結(jié)果進行分析，將標(biāo)準(zhǔn)品濃度與擴增Ct值做圖，結(jié)果如圖2所示，圖2中橫坐標(biāo)表示標(biāo)準(zhǔn)品中核酸的濃度，縱坐標(biāo)表示擴增Ct值，以HBCIV 100，000為例，圖2結(jié)果表示：當(dāng)HBV核酸濃度為100，000IU/mL時，HBV有擴增Ct值，約為29。

由圖2可知，當(dāng)HIV-1核酸的濃度低于100IU/mL時，即有可能無法檢測到樣本中的核酸，即表示該方法中對待測樣本中HIV-1的可重復(fù)檢測閾值為100IU/mL。同樣可知，HBV的可重復(fù)檢測閾值為5IU/mL,HCV的可重復(fù)檢測閾值為50IU/mL。該方法可檢測到的HIV-1、HBV和HCV的最低濃度為100IU/mL，5IU/mL和50IU/mL，具有較高的靈敏度；且HTLV-1的Ct值穩(wěn)定在34.5，表明該方法具有較高的穩(wěn)定性，結(jié)果可信度較高。

另外，本發(fā)明的另一方面提供了一種同步檢測HIV-1、HBV和HCV的試劑盒，該試劑盒包括HTLV-1內(nèi)在陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品。

該試劑盒以HTLV-1標(biāo)準(zhǔn)品作為內(nèi)在陽性質(zhì)控，既監(jiān)控了樣品核酸的提取過程又監(jiān)控了基因擴增反應(yīng)過程，增大了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，減少了假陽性結(jié)果。

在一個優(yōu)選的實施方式中，試劑盒中HTLV-1內(nèi)在陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0-10⁶IU/mL(其中不包括0IU/mL，但包括10⁶IU/mL)，該濃度能夠滿足檢測的需求，實現(xiàn)本發(fā)明要達到的功能。其中，IU表示HTLV-1的國際單位。

在另一優(yōu)選的實施方式中，該試劑盒包括：HTLV-1標(biāo)準(zhǔn)品，HIV-1的上游引物，HIV-1的下游引物，HBV的上游引物，HBV的下游引物，HCV的上游引物，HCV的下游引物，HTLV-1的上游引物，HTLV-1的下游引物。

該試劑盒直接為實驗者提供了HIV-1、HBV、HCV和HTLV-1的上、下游引物，免去了實驗者自行設(shè)計引物的繁瑣步驟。

在另一優(yōu)選的實施方式中，該試劑盒包括：HTLV-1標(biāo)準(zhǔn)品，HIV-1的上游引物，HIV-1的下游引物，HBV的上游引物，HBV的下游引物，HCV的上游引物，HCV的下游引物，HTLV-1的上游引物，HTLV-1的下游引物，HIV-1的探針，HBV的探針，HCV的探針，HTLV-1的探針，其中，

HIV-1的上游引物為：

5’-TAAAGCTTGCCTTGAGTGCT-3’(SEQ ID NO：1)，

HIV-1的下游引物為：

5’-GTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAG-3’(SEQ ID NO：2)，

HIV-1的探針為：

5’-FAM-AGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTG-3’(SEQ ID NO：3)，

HBV的上游引物為：

5’-CAACCTCCAATCACTCACCAACC-3’(SEQ ID NO：4)，

HBV的下游引物為：

5’-ATATGATAAAACGCCGCAGACAC-3’(SEQ ID NO：5)，

HBV的探針為：

5’-Cy5-TCCTCCAATTTGTCCTGGTTATCGCT-3’(SEQ ID NO：6)，

HCV的上游引物為：

5’-TGCTAGCCGAGTAGYGTTGG-3’(SEQ ID NO：7)，

HCV的下游引物為：

5’-ACTCGCAAGCACCCTATCAG-3’(SEQ ID NO：8)，

HCV的探針為：

5’-FAM-CAGCGCTTTCCGGAACACCA-3’(SEQ ID NO：9)，

HTLV-1的上游引物為：

5’-AATAATTCTACCCGAAGACTGTTTGC-3’(SEQ ID NO：10)，

HTLV-1的下游引物為：

5’-ATTGTCGGACCGTTGTGCC-3’(SEQ ID NO：11)，

HTLV-1的探針為：

5’-ROX-TTTCCAGCCTGTTAGGGCACCCGT-3’(SEQ ID NO：12)。

該試劑盒為實驗者提供了HIV-1、HBV、HCV和HTLV-1的上、下游引物以及HIV-1、HBV、HCV和HTLV-1的探針引物，免去了實驗者自行設(shè)計引物和探針的繁瑣步驟，使實驗更快速的進行。

現(xiàn)結(jié)合具體實施例對本發(fā)明提供的檢測樣品中HIV-1、HBV和HCV的試劑盒進行詳細(xì)介紹。

實施例2

本發(fā)明提供的一種同步檢測HIV-1、HBV和HCV的試劑盒包括：HTLV-1內(nèi)在陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品。

本發(fā)明提供的同步檢測HIV-1、HBV和HCV的試劑盒通過選取HTLV-1作為內(nèi)在陽性質(zhì)控，從檢測的最初階段進行監(jiān)控，能夠監(jiān)測整個病毒檢測過程，完美的體現(xiàn)了內(nèi)在陽性質(zhì)控的作用，增加了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

此外，本發(fā)明提供的試劑盒能夠廣泛用于各種待測樣品中HIV-1、HBV和HCV病毒的檢測。當(dāng)待測樣品為血液樣本時，能夠方便、快速的同時檢測出血液樣本中是否含有HIV-1、HBV或者HCV病毒，為輸血、獻血等提供警示作用；當(dāng)待測樣本為其他樣本，例如科學(xué)研究中自行制備的樣本時，應(yīng)用該試劑盒能夠快速、準(zhǔn)確的檢測出待測樣本中HIV-1、HBV或者HCV的濃度，方便、快捷，準(zhǔn)確性高。該試劑盒的使用方法操作簡便，價格低廉，耗時短，具有較高的靈敏性和特異性，具有廣闊的市場前景和商業(yè)價值。

該試劑盒在使用過程中，需要實驗者自行合成或購買HIV-1、HBV、HCV和HTLV-1的上、下游引物，需要實驗者自行配備核酸提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑和定量PCR試劑。

該試劑盒的使用方法如下：

(1)向待測樣本中加入HTLV-1內(nèi)在陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品，使HTLV-1的終濃度為10³copies/mL，使用市售常規(guī)核酸提取試劑盒，提取樣本的核酸。

(2)使用市售常規(guī)反轉(zhuǎn)錄試劑盒，以步驟(1)中的核酸為模板，進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

(3)使用市售常規(guī)定量PCR試劑盒，以步驟(2)中的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液為模板，以實驗者自行合成或購買的的HIV-1、HBV、HCV和HTLV-1的上、下游引物為引物，進行定量PCR反應(yīng)。

其中，定量PCR反應(yīng)中，實驗者可自行合成或購買HIV-1、HBV、HCV和HTLV-1的探針通過探針法進行定量PCR反應(yīng)；也可通過染料法進行定量PCR反應(yīng)。

(4)反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)定量PCR的擴增曲線和溶解曲線，對擴增結(jié)果進行分析，精確計算待測樣品中HIV-1、HBV和HCV的核酸濃度，或者直接判斷待測樣品中有無HIV-1、HBV和HCV。

另外，上述使用方法以反轉(zhuǎn)錄定量PCR技術(shù)為例，進行了解釋說明，也可以采用其他技術(shù)對待測病毒進行檢測，如依賴核酸序列的擴增技術(shù)或者環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)等。

實施例3

本發(fā)明提供的一種同步檢測HIV-1、HBV和HCV的試劑盒包括：HTLV-1內(nèi)在陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品，HIV-1的上游引物，HIV-1的下游引物，HBV的上游引物，HBV的下游引物，HCV的上游引物，HCV的下游引物，HTLV-1的上游引物，HTLV-1的下游引物，HIV-1的探針，HBV的探針，HCV的探針，HTLV-1的探針，其中，

所述HIV-1的上游引物為：

5’-TAAAGCTTGCCTTGAGTGCT-3’(SEQ ID NO：1)，

HIV-1的下游引物為：

5’-GTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAG-3’(SEQ ID NO：2)，

HIV-1的探針為：

5’-FAM-AGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTG-3’(SEQ ID NO：3)，

HBV的上游引物為：

5’-CAACCTCCAATCACTCACCAACC-3’(SEQ ID NO：4)，

HBV的下游引物為：

5’-ATATGATAAAACGCCGCAGACAC-3’(SEQ ID NO：5)，

HBV的探針為：

5’-Cy5-TCCTCCAATTTGTCCTGGTTATCGCT-3’(SEQ ID NO：6)，

HCV的上游引物為：

5’-TGCTAGCCGAGTAGYGTTGG-3’(SEQ ID NO：7)，

HCV的下游引物為：

5’-ACTCGCAAGCACCCTATCAG-3’(SEQ ID NO：8)，

HCV的探針為：

5’-FAM-CAGCGCTTTCCGGAACACCA-3’(SEQ ID NO：9)，

HTLV-1的上游引物為：

5’-AATAATTCTACCCGAAGACTGTTTGC-3’(SEQ ID NO：10)，

HTLV-1的下游引物為：

5’-ATTGTCGGACCGTTGTGCC-3’(SEQ ID NO：11)，

HTLV-1的探針為：

5’-ROX-TTTCCAGCCTGTTAGGGCACCCGT-3’(SEQ ID NO：12)。

其中HIV-1、HBV、HCV和HTLV-1的探針引物中的FAM、Cy5、FAM、ROX為熒光集團，淬滅基團可以選擇BHQ1或者TAMRA。

該試劑盒的具體使用方法如下：

(1)向待測樣本中加入HTLV-1內(nèi)在陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品，使HTLV-1的終濃度為10³copies/mL，使用市售常規(guī)核酸提取試劑盒，提取樣本的核酸

(2)使用市售常規(guī)反轉(zhuǎn)錄試劑盒，以步驟(1)中的核酸為模板，進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下：

(3)使用市售常規(guī)定量PCR試劑盒，以步驟(2)中的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液為模板，以本試劑盒提供的HIV-1、HBV、HCV和HTLV-1的上、下游引物以及HIV-1、HBV、HCV和HTLV-1的探針引物為引物和探針，進行定量PCR反應(yīng)，定量PCR反應(yīng)條件如下：

(4)反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)定量PCR的擴增曲線和溶解曲線，對擴增結(jié)果進行分析，精確計算待測樣品中HIV-1、HBV和HCV的核酸濃度，或者直接判斷待測樣品中有無HIV-1、HBV和HCV。

另外，上述使用方法以反轉(zhuǎn)錄定量PCR技術(shù)為例，進行了解釋說明，也可以采用其他技術(shù)對待測病毒進行檢測，如依賴核酸序列的擴增技術(shù)或者環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)等。

最后應(yīng)說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 寧波迪亞生物科技有限公司

<120> 病毒檢測方法及同步檢測HIV-1、HBV和HCV的試劑盒

<130> 111

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

taaagcttgc cttgagtgct 20

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtctgaggga tctctagtta ccag 24

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agtagtgtgt gcccgtctgt tgtgtg 26

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caacctccaa tcactcacca acc 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atatgataaa acgccgcaga cac 23

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcctccaatt tgtcctggtt atcgct 26

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgctagccga gtagygttgg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

actcgcaagc accctatcag 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cagcgctttc cggaacacca 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aataattcta cccgaagact gtttgc 26

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

attgtcggac cgttgtgcc 19

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tttccagcct gttagggcac ccgt 24