本發(fā)明涉及一種用于檢測口蹄疫病毒O型和Asia1型混合感染的引物、試劑盒、使用方法及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

口蹄疫(aphthae epizooticae；foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒引起的一種人獸共患的急性、熱性、高度接觸性傳染病，其臨診特征是在口腔粘膜、四肢下端及乳等處皮膚形成水皰和爛斑。該病傳播迅速，流行面廣，成年動(dòng)物多取良性經(jīng)過，幼齡動(dòng)物多因心肌受損而死亡率較高?？谔阋邚V泛流行于世界各地，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，各國政府及國際組織高度重視，被列為全球各國共同商定撲滅的頭號(hào)法定傳染病。隨著國際貿(mào)易的日趨增加，物質(zhì)交流和國際交往越來越頻繁，給口蹄疫的預(yù)防和控制增加了難度，因此世界各國都花費(fèi)大量人力、物力和財(cái)力來研究、控制和消滅口蹄疫。

口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth disease virus)屬于微RNA病毒科中的口蹄疫病毒屬，是RNA病毒中最小的一個(gè)?？谔阋卟《揪哂卸嘈托?、易變異的特點(diǎn)。根據(jù)其血清學(xué)特性，可以分為7個(gè)血清型，即A、O、C、SAT1(南非Ⅰ)、SAT2(南非Ⅱ型)、SAT3(南非Ⅲ型)及Asia 1型(亞洲1型)。各個(gè)血清型間無交叉免疫現(xiàn)象。每一個(gè)血清型又包含若干個(gè)亞型，同型各個(gè)亞型之間也僅有部分交叉免疫性。該病毒的這種特性給口蹄疫的防制帶來了許多困難。

口蹄疫病毒在患病動(dòng)物的水皰液、水皰皮、淋巴液及發(fā)熱期血液內(nèi)的含量最高，其次是各組織器官、分泌物、排泄物，可長期存在并向外排毒，退熱后病毒可以出現(xiàn)于乳、糞、尿、淚、涎水及各臟器中?？谔阋卟《緦?duì)外界環(huán)境的抵抗力很強(qiáng)，耐干燥。在自然條件下，含毒組織及污染的飼料、飲水、飼草、皮毛及土壤等所含病毒在數(shù)日乃至數(shù)周內(nèi)仍具有感染性?？谔阋卟《緦?duì)酸和堿都特別敏感，在pH3.0和pH9.0以上的緩沖液中，病毒感染性將瞬間消失，2％～4％氫氧化鈉、3％～5％福爾馬林溶液、5％氨水、0.2％～0.5％過氧乙酸或5％次氯酸鈉等均為口蹄疫病毒良好的消毒劑。

口蹄疫是一種傳染性極強(qiáng)的傳染病，一經(jīng)發(fā)生往往呈流行性，在牧區(qū)，多呈現(xiàn)大流行，疫情一旦發(fā)生，可隨動(dòng)物的流動(dòng)迅速蔓延，經(jīng)過一定時(shí)期后疫情才逐漸平息。口蹄疫可感染多種動(dòng)物，偶蹄目動(dòng)物易感性最高，易感性高低的順序依次為黃牛、奶牛、牦牛、水牛、豬、羊、駱駝。

對(duì)于口蹄疫的防治目前尚無特效藥物療法，主要采取綜合防制措施及對(duì)癥療法。最根本的辦法是消除患病動(dòng)物、帶毒動(dòng)物和徹底消毒，切斷傳播途徑。因此應(yīng)加強(qiáng)檢疫和口蹄疫監(jiān)測，以防口蹄疫擴(kuò)散。

目前，根據(jù)流行病學(xué)、臨診癥狀和病例剖檢特點(diǎn)可以做出口蹄疫的初步診斷，但確診需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷。病毒的分離與鑒定和血清學(xué)診斷是實(shí)驗(yàn)室診斷常用的方法，但較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，耗時(shí)較長。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于檢測口蹄疫病毒O型和Asia1型混合感染的引物、試劑盒、使用方法及其應(yīng)用，采用本發(fā)明的試劑盒，能夠在三個(gè)小時(shí)內(nèi)做出診斷，為口蹄疫臨床診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查提供一種有效的分子生物學(xué)診斷方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種用于檢測口蹄疫病毒O型和Asia1型混合感染的引物，所述的引物包括引物對(duì)FMDO和FMDAsia，其中，

引物對(duì)FMDO：

上游引物FMDOF：5′-TGGCCTCAAAGACTCTCG-3′

下游引物FMDOR：5′-CAAGCTACAGATCACTTTAC-3′

引物對(duì)FMDAsia：

上游引物FMDAsiaF：5′-CTGGGTTTTACAAACCTGTG-3′

下游引物FMDAsiaR：5′-CTCTGACGTCACAATTGGC-3′。

一種用于檢測口蹄疫病毒O型和Asia1型混合感染的試劑盒，所述的試劑盒包括引物對(duì)FMDO和FMDAsia，其中，

引物對(duì)FMDO：

上游引物FMDOF：5′-TGGCCTCAAAGACTCTCG-3′

下游引物FMDOR：5′-CAAGCTACAGATCACTTTAC-3′

引物對(duì)FMDAsia：

上游引物FMDAsiaF：5′-CTGGGTTTTACAAACCTGTG-3′

下游引物FMDAsiaR：5′-CTCTGACGTCACAATTGGC-3′。

所述的試劑盒還包括5×RT Buffer、dNTPs、Taq酶、RNA酶抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶、超純水、裂解液和沖洗液。

所述的試劑盒還包括陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。

所述的裂解液的組分為：羥基喹啉3～5％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、磷酸三氯乙酯3.2～5.2μM、異硫氰酸苯酯1.5～3.5μM、聚乙烯基吡咯烷酮1.3～3.5％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、氯化鈉0.3～0.5M和檸檬酸鈉0.6～0.9M。

所述的沖洗液的組分為：三羥甲基氨基甲烷10μM，乙二胺四乙酸1μM，乙醇60～80％(體積分?jǐn)?shù))；pH 7.0。

一種用于檢測口蹄疫病毒O型和Asia1型混合感染的試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

(1)樣品的采集

(2)樣品RNA的提取

(3)RT-PCR

對(duì)樣品RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系25μl：5×RT Buffer 5μl、12.5μM dNTPs 5μl、125μM上游引物FMDOF和125μM下游引物FMDOR各1μl、125μM上游引物FMDAsiaF和125μM下游引物FMDAsiaR各1μl、25U/μl Taq酶0.5μl、2.5U/μl RNA酶抑制劑1μl、2.5μM反轉(zhuǎn)錄酶1μl、超純水3.5μl和5ng/μl RNA 5μl；

RT-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?0℃30min，94℃3min；94℃40s，55℃45s，72℃30s，共35個(gè)循環(huán)；72℃3min；

(4)RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

所述的樣品的采集分為固體狀動(dòng)物組織的采集或液體狀動(dòng)物組織的采集；其中，

固體狀動(dòng)物組織的采集方法為：無菌采集動(dòng)物組織病料0.1-100mg，裝入無RNA酶污染的離心管中備用；

液體狀動(dòng)物組織的采集分為分泌液的采集或血液的采集，分泌液的采集方法為：用鼻咽拭子采集鼻咽液，裝入無RNA酶污染的離心管中備用；血液的采集方法為：取全血、血清或血漿10-100μl，加入無RNA酶污染的離心管中備用。

所述的樣品RNA的提取，具體方法為：

(1)將固體狀的動(dòng)物組織先進(jìn)行研磨處理，液體狀的動(dòng)物組織直接用于提取；

(2)在研磨后成糊狀的動(dòng)物組織20-100mg或液體狀動(dòng)物組織20-100μl中，加裂解液500μl，12000rpm離心30s，分離出上清液；

(3)將上清液轉(zhuǎn)入離心管中，加無水乙醇500μl，分次轉(zhuǎn)到RNA純化柱上，12000rpm離心30s，得到粗提的RNA；

(4)用沖洗液500μl沖洗RNA純化柱，12000rpm離心30s；

(5)將RNA純化柱轉(zhuǎn)到另一離心管，加超純水50μl，12000rpm離心30s，得到病毒及組織基因組的RNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

一種用于檢測口蹄疫病毒O型和Asia1型混合感染的試劑盒在檢測口蹄疫病毒O型和Asia1型混合感染方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果

1、本發(fā)明對(duì)核酸提取過程進(jìn)行改進(jìn)，即采用與現(xiàn)有試劑盒不同配方的裂解液和沖洗液，大大縮短了核酸提取時(shí)間，使核酸的提取時(shí)間由原來的1-2小時(shí)縮短為2分鐘，節(jié)省了核酸提取的時(shí)間，從而提高了試劑盒的使用效率，使試劑盒的檢驗(yàn)更加快捷、經(jīng)濟(jì)。其中，本發(fā)明的裂解液可以使樣品迅速裂解，釋放出RNA。沖洗液可有效除去蛋白質(zhì)、鹽類及雜質(zhì)等，使所提取的RNA更加純凈。

2、本發(fā)明以口蹄疫病毒3D基因組序列作為目的基因區(qū)域，設(shè)計(jì)能夠檢測O型和Asia1型的特異性引物，同等條件下不能擴(kuò)增口蹄疫其他血清型，具有很高的特異性。同時(shí)，本發(fā)明的試劑盒具有很高的靈敏度，最低檢測限為0.1pg/μl。

3、本發(fā)明提供了一種用于檢測口蹄疫病毒O型和Asia1型混合感染的試劑盒，該試劑盒能快速、準(zhǔn)確的檢測出口蹄疫病毒O型和Asia1型混合感染毒株?？蓪?duì)口蹄疫感染的O型和Asia1型單個(gè)樣品檢測，也可對(duì)臨床病例中O型和Asia1型混合感染的檢測，可用于口蹄疫病毒病原普查、分子流行病學(xué)調(diào)查及疫苗篩選和監(jiān)測。

4、本發(fā)明的方法是建立在分子生物學(xué)基礎(chǔ)上的，檢測中提供了陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，大大提高了檢測的準(zhǔn)確度，降低假陽性的出現(xiàn)幾率，特異性較強(qiáng)，省時(shí)省力，該試劑盒將檢測時(shí)間縮短至3小時(shí)，大大提高了工作效率。

5、本發(fā)明特別適合于口蹄疫病毒感染的大量臨床樣本的快速診斷，可以為臨床和科研上口蹄疫病防治和治療提供科學(xué)依據(jù)，而且對(duì)提高口蹄疫病毒病原的檢測、監(jiān)控、疫苗研制等具有重要意義。

附圖說明

圖1為RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖；其中，泳道M代表DL 2000DNA Marker(從上到下依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)，泳道1、2為口蹄疫病毒陰性對(duì)照，3為口蹄疫病毒O型與Asia1型混合感染陽性對(duì)照，4為口蹄疫病毒O型和Asia1型混合感染樣品。

圖2為RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖；其中，泳道M代表DL 2000DNA Marker(從上到下依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)，a中泳道1代表口蹄疫病毒O型和Asia1型混合感染樣品，泳道2代表口蹄疫病毒O型樣品，泳道3代表口蹄疫病毒Asia1型樣品；b中泳道1代表口蹄疫病毒O型和Asia1型混合感染陽性對(duì)照，泳道2代表口蹄疫病毒O型陽性對(duì)照，泳道3代表口蹄疫病毒Asia1型陽性對(duì)照。

圖3為RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖；其中，泳道M代表DL 2000DNA Marker(從上到下依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)，泳道1代表口蹄疫病毒O型和Asia1型混合感染的樣品；泳道2-6分別代表口蹄疫病毒A型、C型、SAT1(南非Ⅰ)、SAT2(南非Ⅱ型)及SAT3(南非Ⅲ型)樣品。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

本發(fā)明所用的聚乙烯基吡咯烷酮的相對(duì)分子量為40000。

本發(fā)明所用的羥基喹啉為2-羥基喹啉。

實(shí)施例1 用于檢測口蹄疫病毒O型和Asia1型混合感染的試劑盒

1、引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)口蹄疫病毒的3D基因組序列，設(shè)計(jì)引物對(duì)FMDO和FMDAsia，其中，引物對(duì)FMDO：

上游引物FMDOF：5′-TGGCCTCAAAGACTCTCG-3′(SEQ ID NO.1)

下游引物FMDOR：5′-CAAGCTACAGATCACTTTAC-3′(SEQ ID NO.2)

引物對(duì)FMDAsia：

上游引物FMDAsiaF：5′-CTGGGTTTTACAAACCTGTG-3′(SEQ ID NO.3)

下游引物FMDAsiaR：5′-CTCTGACGTCACAATTGGC-3′(SEQ ID NO.4)。

2、RNA的提取

以確診攜帶口蹄疫病毒O型和Asia1型混合感染的黃牛為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，提取樣品RNA，包括以下步驟：

(1)樣品的采集

采集黃牛全血100μl，加入無RNA酶污染的離心管中備用。

(2)樣品RNA的提取

(a)在采集的100μl全血中，加裂解液500μl，12000rpm離心30s，分離出上清液；

(c)將上清液轉(zhuǎn)入離心管中，加無水乙醇500μl，分次轉(zhuǎn)到RNA純化柱上，12000rpm離心30s，得到粗提的RNA；

(d)用沖洗液500μl沖洗RNA純化柱，12000rpm離心30s；

(e)將RNA純化柱轉(zhuǎn)到另一離心管，加超純水50μl，12000rpm離心30s，得到病毒及組織基因組的RNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

裂解液的組分為：羥基喹啉3％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、磷酸三氯乙酯3.2μM、異硫氰酸苯酯3.5μM、聚乙烯基吡咯烷酮1.3％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、氯化鈉0.3M和檸檬酸鈉0.9M。

沖洗液的組分為：三羥甲基氨基甲烷10μM，乙二胺四乙酸1μM，乙醇60％(體積分?jǐn)?shù))；pH 7.0。

3、RT-PCR

以樣品RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，同時(shí)以豬水皰病病毒為陰性對(duì)照，以口蹄疫病毒O型和Asia1型混合感染為陽性對(duì)照，提取陰性對(duì)照和陽性對(duì)照樣品的RNA，RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系25μl：5×RT Buffer 5μl、12.5μM dNTPs 5μl、125μM上游引物FMDOF和125μM下游引物FMDOR各1μl、125μM上游引物FMDAsiaF和125μM下游引物FMDAsiaR各1μl、25U/μl Taq酶0.5μl、2.5U/μl RNA酶抑制劑1μl、2.5μM反轉(zhuǎn)錄酶1μl、超純水3.5μl和5ng/μl RNA 5μl。

RT-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?0℃30min，94℃3min；94℃40s，55℃45s，72℃30s，共35個(gè)循環(huán)；72℃3min。

4、RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測

取RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5μl和Loading Buffer 5μl混勻，加到含EB的1.0％的瓊脂糖凝膠中，同時(shí)加入陰性對(duì)照、陽性對(duì)照的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和DL2000DNA Marker，電壓為120V，電泳35min，然后在凝膠成像儀中觀察結(jié)果(結(jié)果見圖1)。

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，本發(fā)明樣品RNA的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1350bp和200bp出現(xiàn)條帶，與預(yù)期相符，證明本發(fā)明RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為口蹄疫病毒O型和Asia1型混合感染目的片段。

實(shí)施例2 用于檢測口蹄疫病毒O型和Asia1型混合感染的試劑盒

實(shí)施例2的試劑盒與實(shí)施例1的試劑盒基本相同，不同之處在于：本實(shí)施例的裂解液的組分為羥基喹啉5％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、磷酸三氯乙酯4μM、異硫氰酸苯酯2.5μM、聚乙烯基吡咯烷酮2％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、氯化鈉0.5M和檸檬酸鈉0.6M。沖洗液的組分為三羥甲基氨基甲烷10μM，乙二胺四乙酸1μM，乙醇80％(體積分?jǐn)?shù))；pH 7.0。

本實(shí)施例以確診攜帶口蹄疫病毒O型的黃牛為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以口蹄疫病毒O型為陽性對(duì)照，提取樣品RNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果見圖2(檢測方法同實(shí)施例1)。

實(shí)施例3 用于檢測口蹄疫病毒O型和AsiaⅠ混合感染的試劑盒

實(shí)施例3的試劑盒與實(shí)施例1的試劑盒基本相同，不同之處在于：本實(shí)施例的裂解液的組分為羥基喹啉4％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、磷酸三氯乙酯5.2μM、異硫氰酸苯酯1.5μM、聚乙烯基吡咯烷酮3.5％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、氯化鈉0.4M和檸檬酸鈉0.8M。沖洗液的組分為三羥甲基氨基甲烷10μM，乙二胺四乙酸1μM，乙醇70％(體積分?jǐn)?shù))；pH 7.0。

本實(shí)施例以確診攜帶口蹄疫病毒Asia1型的黃牛為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以口蹄疫病毒Asia1型為陽性對(duì)照，提取樣品RNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果見圖2(檢測方法同實(shí)施例1)。

使用本發(fā)明實(shí)施例1的試劑盒對(duì)不同樣品的基因組RNA進(jìn)行提取，對(duì)提取的基因組RNA進(jìn)行濃度和純度測定，結(jié)果見下表。

表 本發(fā)明試劑盒提取的基因組RNA濃度和純度測定結(jié)果

注：RNA濃度單位為ng/μl；吸光度比值為RNA在260nm和280nm處的吸光度比值(260/280)，通過吸光度比值來判斷RNA的純度，從上表可以看出，吸光度值在1.8～2.0之間，說明提取的RNA純度較好。

表中樣品1、2、3、4、5、6、7分別為使用該試劑盒從100μl血清中提取約1.02μg、1.09μg、1.04μg、1.09μg、0.99μg、1.09μg、1.04μg基因組。

實(shí)驗(yàn)例

1、用于檢測口蹄疫病毒O型和Asia1型混合感染的試劑盒特異性實(shí)驗(yàn)

以確診攜帶口蹄疫病毒O型和Asia1型混合感染的黃牛為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，驗(yàn)證本發(fā)明檢測口蹄疫病毒O型和Asia1型混合感染的RT-PCR試劑盒的特異性，包括以下步驟：

(1)樣品的采集

采集黃牛全血100μl，加入無RNA酶污染的離心管中備用。

(2)樣品RNA的提取(裂解液和沖洗液配方同實(shí)施例1)

(a)在采集的100μl全血中，加裂解液500μl，12000rpm離心30s，分離出上清液；

(c)將上清液轉(zhuǎn)入離心管中，加無水乙醇500μl，分次轉(zhuǎn)到RNA純化柱上，12000rpm離心30s，得到粗提的RNA；

(d)用沖洗液500μl沖洗RNA純化柱，12000rpm離心30s；

(e)將RNA純化柱轉(zhuǎn)到另一離心管，加超純水50μl，12000rpm離心30s，得到病毒及組織基因組的RNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)RT-PCR

以樣品RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，同時(shí)以A型、C型、SAT1(南非Ⅰ)、SAT2(南非Ⅱ型)及SAT3(南非Ⅲ型)樣品為對(duì)照，提取對(duì)照樣品的RNA，RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系25μl：5×RT Buffer 5μl、12.5μM dNTPs 5μl、125μM上游引物FMDOF和125μM下游引物FMDOR各1μl、125μM上游引物FMDAsiaF和125μM下游引物FMDAsiaR各1μl、25U/μl Taq酶0.5μl、2.5U/μl RNA酶抑制劑1μl、2.5μM反轉(zhuǎn)錄酶1μl、超純水3.5μl和5ng/μl RNA 5μl。

RT-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?0℃30min，94℃3min；94℃40s，55℃45s，72℃30s，共35個(gè)循環(huán)；72℃3min。

(4)RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測

取RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5μl和Loading Buffer 5μl混勻，加到含EB的1.0％的瓊脂糖凝膠中，同時(shí)加入對(duì)照的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和DL2000DNA Marker，電壓為120V，電泳35min，然后在凝膠成像儀中觀察結(jié)果(結(jié)果見圖3)。

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，本發(fā)明樣品RNA的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1350bp和200bp出現(xiàn)條帶，與預(yù)期相符，證明本發(fā)明RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為口蹄疫病毒O型和Asia1型混合感染目的片段。同時(shí)，對(duì)照的A型、C型、SAT1(南非Ⅰ)、SAT2(南非Ⅱ型)及SAT3(南非Ⅲ型)樣品RT-PCR擴(kuò)增未出現(xiàn)特異性條帶，說明本發(fā)明的RT-PCR試劑盒具有良好的特異性。

2、用于檢測口蹄疫病毒O型和Asia1型混合感染的試劑盒靈敏度實(shí)驗(yàn)

將提取的RNA取1μg/μl作10倍系列稀釋，分別取1μg/μl、100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、0.1pg/μl、0.01pg/μl、0.001pg/μl RNA進(jìn)行RT-PCR一步法進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明本發(fā)明的口蹄疫病毒O型和Asia1型最低檢測限均為0.1pg/μl，這比普通的RT-PCR兩步法的敏感性(1pg/μl)高出10倍。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所

<120> 一種用于檢測口蹄疫病毒O型和Asia1型混合感染的引物、試劑盒、使用方法

及其應(yīng)用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tggcctcaaa gactctcg 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caagctacag atcactttac 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctgggtttta caaacctgtg 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctctgacgtc acaattggc 19