本發(fā)明屬于基因檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種蚊蟲(chóng)感染登革病毒的極早期檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

登革熱(denguefever，df)是由伊蚊(aedes)傳播的、登革病毒(denguevirus,denv)感染引起的人類最嚴(yán)重的蟲(chóng)媒傳染病，可引起登革熱(dv)、重癥登革熱和登革休克綜合征等。尤其是以高熱、嚴(yán)重出血、休克等為臨床癥狀的重癥登革熱，病死率較高。

登革病毒自1943年首次被分離以來(lái)，已在100多個(gè)國(guó)家出現(xiàn)過(guò)病毒流行，全球?qū)⒔话氲娜丝?約25億)有罹患登革熱的危險(xiǎn)，世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示每年約5千萬(wàn)～1億會(huì)發(fā)生顯性感染，近3億人會(huì)發(fā)生隱性感染，顯性感染者中約50萬(wàn)人因重癥登革熱需住院治療，其中很大一部分是兒童，某些地區(qū)的死亡率約5％。由于全球氣候變暖、人口快速增長(zhǎng)、人員流動(dòng)性激增等因素，登革病毒感染的威脅正日趨嚴(yán)重，近幾十年全球登革熱發(fā)病率大幅度增長(zhǎng)。據(jù)預(yù)測(cè)，全球50-60％的人口可能會(huì)面臨威脅，登革病毒感染已成為一個(gè)世界性的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問(wèn)題，是世界衛(wèi)生組織呼吁全球預(yù)警和應(yīng)對(duì)(globalalertandresponse，gar)的疾病之一。

在我國(guó)，登革病毒的感染也較為嚴(yán)重，廣東、廣西、海南、福建等東南沿海地區(qū)是高發(fā)地區(qū)。尤其2014年，在廣東等東南沿海地區(qū)出現(xiàn)歷史上最為嚴(yán)重的登革熱疫情，是近年來(lái)十分罕見(jiàn)的，約有3萬(wàn)多人顯性感染，發(fā)病人數(shù)是常年的10倍以上，嚴(yán)重威脅著廣東、乃至深圳廣大居民的健康。由于目前尚無(wú)特效治療手段，同時(shí)疫苗研制尚未成功，所以，在我國(guó)登革熱也是一個(gè)非常嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。

登革病毒以伊蚊為傳播媒介，共有四種不同的病毒毒株。目前認(rèn)為：病毒的傳播途徑是由雌蚊叮咬帶有病毒血癥的登革熱患者或靈長(zhǎng)類，病毒在蚊蟲(chóng)體內(nèi)增殖，經(jīng)8-10天的潛伏期，再將病毒傳播給健康人，伊蚊感染后無(wú)癥狀，但可終身攜帶和傳播病毒，并可經(jīng)卵傳遞給后代。由此可見(jiàn)：伊蚊在登革病毒的自然循環(huán)中處于中心的位置。所以，針對(duì)伊蚊感染登革病毒進(jìn)行檢測(cè)將在極早期獲得疾病傳播的信息，將成為控制登革病毒在人群中傳播的極早期監(jiān)控手段。

長(zhǎng)期以來(lái)，登革病毒傳播的極早期方法非常欠缺，對(duì)登革病毒的檢測(cè)常常是疫情發(fā)生之后，即出現(xiàn)人群感染病例以后的檢測(cè)，使得對(duì)登革病毒的檢測(cè)常常處于被動(dòng)和滯后的狀態(tài)，常用的檢測(cè)方法為：elisa方法檢測(cè)病人血清中特異性的登革病毒抗體和登革病毒抗原；pcr方法檢測(cè)登革病毒的基因序列。而對(duì)于蚊蟲(chóng)感染登革病毒的檢測(cè)方法則相對(duì)欠缺，僅僅在人感染的流行區(qū)域?qū)ξ孟x(chóng)進(jìn)行登革病毒基因進(jìn)行pcr檢測(cè)，檢測(cè)基因針對(duì)登革病毒的結(jié)構(gòu)基因e基因。所以，針對(duì)蚊蟲(chóng)感染登革病毒的檢測(cè)方法尚未建立，而極早期檢測(cè)方法更是未見(jiàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于：蚊蟲(chóng)感染登革病毒的極早期檢測(cè)技術(shù)。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案為提供一種登革病毒的pcr檢測(cè)方法，包括如下步驟：

s1、登革病毒rna的提取純化：勻漿破碎蚊蟲(chóng)蟲(chóng)體和/或孑孓蟲(chóng)體和/或蟲(chóng)卵，提取全部rna分子，采取負(fù)向選擇的方法去除宿主mrna，純化得到登革病毒rna；

s2、登革病毒rna分子的逆轉(zhuǎn)錄：根據(jù)登革病毒不同毒株之間的共有序列，設(shè)計(jì)特異性逆轉(zhuǎn)錄pcr的莖環(huán)狀引物，逆轉(zhuǎn)錄所述登革病毒rna得到登革病毒的cdna；

s3、實(shí)時(shí)熒光定量pcr：根據(jù)所述共有序列和所述莖環(huán)狀引物，設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量pcr引物，利用實(shí)時(shí)熒光定量pcr的方法定量檢測(cè)登革病毒的濃度。

在本發(fā)明提供的登革病毒的pcr檢測(cè)方法中，所述步驟s1中，基于蚊蟲(chóng)mrna具有3’-polya、而登革病毒rna的3’末端沒(méi)有多聚polya的特征，利用寡dt纖維素-核酸純化柱吸附除去宿主mrna分子，保留沒(méi)有3’-polya的rna，利用負(fù)向選擇純化登革病毒rna。

在本發(fā)明提供的登革病毒的pcr檢測(cè)方法中，所述步驟s2中，所述共有序列為5’-ttttwawtagagagcagatctctg-3’，其中w為a或t；所述莖環(huán)狀引物為：

5’-cagagatctgctcttawtwaaaagtcgtatccagtgcgtgtcgtggagtcggcaattgcactggatacgacttttwaw-3’。

在本發(fā)明提供的登革病毒的pcr檢測(cè)方法中，針對(duì)登革病毒不同毒株基因組中5’-utr的特征性一致序列，采用簡(jiǎn)并密碼獲得所述共有序列。

在本發(fā)明提供的登革病毒的pcr檢測(cè)方法中，所述步驟s3中，設(shè)計(jì)一對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量pcr引物，引物序列如下：

正向引物：5’-ttttawwtagagagcagatctctg-3’

反向引物：5’-gtcacgcacagcacctca-3’

以所述登革病毒的cdna為模板，使用所述實(shí)時(shí)熒光定量pcr引物定量檢測(cè)登革病毒的濃度。

實(shí)施本發(fā)明，具有如下有益效果：本發(fā)明的檢測(cè)方法工藝簡(jiǎn)單高效、切實(shí)可行；設(shè)計(jì)的逆轉(zhuǎn)錄pcr引物、實(shí)時(shí)熒光定量pcr引物以及擴(kuò)增條件具有高特異性、高靈敏度，可以在蚊蟲(chóng)感染登革病毒及越冬蚊蟲(chóng)蟲(chóng)卵、孑孓時(shí)期進(jìn)行極早期檢測(cè)，提供人群感染登革病毒危險(xiǎn)性評(píng)估和極早期預(yù)警。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案，對(duì)實(shí)施例描述中所使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。附圖中：

圖1為登革病毒四種毒株對(duì)比及共有序列；

圖2為逆轉(zhuǎn)錄pcr的特異性莖環(huán)狀引物5’-utrslprimer。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行具體描述。

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于蚊蟲(chóng)感染登革病毒的極早期檢測(cè)技術(shù)：目前常用的檢測(cè)方法是在疫情發(fā)生之后利用elisa技術(shù)檢測(cè)病人血清中特異性的登革病毒抗體、登革病毒抗原和pcr方法檢測(cè)登革病毒的基因序列。而對(duì)于蚊蟲(chóng)感染登革病毒的檢測(cè)方法則相對(duì)欠缺，僅僅在人感染登革病毒的流行疫區(qū)對(duì)蚊蟲(chóng)中登革病毒結(jié)構(gòu)基因e基因進(jìn)行pcr檢測(cè)，特異性、靈敏度均不理想。而且上述方法具有明顯的滯后性，檢測(cè)的對(duì)象均為疫情發(fā)生后的人群和蚊蟲(chóng)群體，無(wú)法在疫情發(fā)生極早期、蚊蟲(chóng)感染時(shí)期進(jìn)行監(jiān)控，而蚊蟲(chóng)感染登革病毒是登革熱疫情發(fā)生的源頭事件。所以，針對(duì)蚊蟲(chóng)感染登革病毒的極早期檢測(cè)方法的建立將在疫情發(fā)生的源頭提出預(yù)警，可以有效避免人群的大規(guī)模感染，控制疫情的發(fā)生發(fā)展。

在蚊蟲(chóng)感染登革病毒的極早期，病毒的滴度非常低，需要靈敏度高、特異性強(qiáng)的檢測(cè)方法。目前常用的檢測(cè)方法是針對(duì)蚊蟲(chóng)感染登革病毒后，登革病毒結(jié)構(gòu)基因e基因進(jìn)行pcr檢測(cè)，該方法的靈敏度不高，且特異性不強(qiáng)，也無(wú)法確保四種登革病毒毒株均被有效檢出。

本發(fā)明要解決的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題是在蚊蟲(chóng)感染登革病毒的極早期，即病毒滴度很低的情況下，建立靈敏度高、特異性強(qiáng)的檢測(cè)方法。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)：針對(duì)4種登革病毒毒株保守的5’utr序列及基于保守序列的5’-utrslprimer的設(shè)計(jì)，5’-utr即5’-非翻譯區(qū)(5’-untranslatedregions)，以此特異性5′-utrslprimer進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄pcr，并對(duì)逆轉(zhuǎn)錄pcr擴(kuò)增條件的設(shè)立優(yōu)化，獲得4種病毒毒株特異性cdna片段；基于上述特異性引物的實(shí)時(shí)熒光定量pcr引物的設(shè)計(jì)，并以登革病毒特異性cdna片段為模板，建立靈敏度高、特異性強(qiáng)的熒光定量pcr方法為登革病毒極早期檢測(cè)方法。本發(fā)明的檢測(cè)方法中設(shè)計(jì)的逆轉(zhuǎn)錄pcr引物和實(shí)時(shí)熒光定量pcr引物以及擴(kuò)增條件具有高度特異性和靈敏度，可以在蚊蟲(chóng)感染登革病毒及越冬蚊蟲(chóng)蟲(chóng)卵、孑孓時(shí)期進(jìn)行極早期檢測(cè)，提供人群感染登革病毒危險(xiǎn)性評(píng)估和極早期預(yù)警。

實(shí)施例1

1.登革病毒rna的提取純化：

a、勻漿破碎蚊蟲(chóng)蟲(chóng)體、孑孓蟲(chóng)體、蟲(chóng)卵，利用trizol試劑提取全部rna分子，其中包括蚊蟲(chóng)rna和登革病毒rna；

b、基于蚊蟲(chóng)mrna具有3’-polya、而登革病毒rna3’末端沒(méi)有多聚polya的特征，polya即多聚腺苷酸，利用寡dt纖維素(oligot纖維素)和核酸純化柱(spincolumn柱)吸附除去宿主rna中大量的mrna分子，保留沒(méi)有polya的rna，利用負(fù)向選擇(negativeselection)純化登革病毒rna；

c、獲得的登革病毒rna分子經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)和紫外分光光度計(jì)od260/od280檢測(cè)rna的純度；凝膠電泳為特異性譜帶，od260/od280≥2.0。

2.登革病毒rna分子的逆轉(zhuǎn)錄：

針對(duì)登革病毒四種毒株設(shè)計(jì)逆轉(zhuǎn)錄pcr的特異性莖環(huán)狀引物，用于全部四種類型的登革病毒rna分子的逆轉(zhuǎn)錄pcr，具體步驟如下：

a、針對(duì)登革病毒四種毒株特定的一致性序列，進(jìn)行生物信息學(xué)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)四種登革病毒毒株的差異性較大，僅僅在5’-utr具有顯著的共有序列，具體比對(duì)結(jié)果如圖1中所示。

基于上述分析結(jié)果，5’-utr的共有序列為5’-ttttwawtagagagcagatctctg-3’，其中w為a或t；下劃線部分為末端特異序列，此共有序列命名為5′-utrcprimer。

b、基于上述共有序列可知，其互補(bǔ)序列為5’-cagagatctgctcttawtwaaaa-3’，設(shè)計(jì)特異性逆轉(zhuǎn)錄pcr的莖環(huán)狀引物(命名為5′-utrslprimer)，其具體結(jié)構(gòu)如圖2所示，該莖環(huán)狀引物的具體序列為：

5’-cagagatctgctcttawtwaaaagtcgtatccagtgcgtgtcgtggagtcggcaattgcactggatacgacttttwaw-3’；

其中下劃線部分與上述共有序列的3’末端序列互補(bǔ)。

c、逆轉(zhuǎn)錄獲得登革病毒的cdna。

根據(jù)iscript^tmcdnasynthesiskit和上述特異性引物(5′-utrslprimer)，以步驟1中獲得的純化rna為模板逆轉(zhuǎn)錄成cdna，即登革病毒特異性cdna片段，所有操作均在冰上進(jìn)行。具體操作如下：取rna樣品1ug，5′-utrslprimer1ul加適量depc水至總體積12ul；將上述混合物置于pcr儀上，65℃反應(yīng)5min，置于冰上2-3min；向上述混合物中分別加入10mmdntpmix2ul，ribolockrnaseinhibitor1ul，5×reactionbuffer4ul，revertaidtmm-mulvreversetranscriptase1ul，總體系20ul，充分混勻；上述反應(yīng)體系置于pcr儀上反應(yīng)42℃，60min，然后70℃溫育5min，即獲得包含登革病毒四種毒株的特特異性cdna片段。

3.實(shí)時(shí)熒光定量pcr：

設(shè)計(jì)針對(duì)上述共有序列和莖環(huán)狀引物的實(shí)時(shí)熒光定量pcr引物，利用實(shí)時(shí)熒光定量pcr的方法定量檢測(cè)登革病毒的濃度。具體操作步驟如下：

a、針對(duì)登革病毒四種毒株的共有序列5′-utrslprimer和莖環(huán)結(jié)構(gòu)特異引物5′-utrslprimer，設(shè)計(jì)一對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量pcr引物，引物序列如下：

正向引物：5’-ttttawwtagagagcagatctctg-3’

反向引物：5’-gtcacgcacagcacctca-3’

正向引物為登革病毒特異性序列，反向引物為莖環(huán)結(jié)構(gòu)通用引物。

b、實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)體系及程序

反應(yīng)體系：realmastermix(2x)，10ul；正向引物，0.4ul；反向引物，0.4ul；cdna，1ul；h2o，8.2ul；總體積，20ul。

反應(yīng)循環(huán)程序：95℃預(yù)變性2min；95℃變性15s；50℃退火/延伸40s；共40個(gè)循環(huán)。

c、實(shí)時(shí)熒光定量pcr測(cè)定

以18s為內(nèi)參基因，利用上述體系和反應(yīng)程序，對(duì)登革病毒特征性cdna片段進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，并利用系統(tǒng)所帶軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，定量測(cè)定登革病毒的濃度。

上面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了描述，但是本發(fā)明并不局限于上述的具體實(shí)施方式，上述的具體實(shí)施方式僅僅是示意性的，而不是限制性的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的啟示下，在不脫離本發(fā)明宗旨和權(quán)利要求所保護(hù)的范圍情況下，還可做出很多形式，這些均屬于本發(fā)明的保護(hù)之內(nèi)。