本發(fā)明涉及動(dòng)物病毒抗體檢測(cè)方法領(lǐng)域，本發(fā)明提供了一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體檢測(cè)方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

豬繁殖與呼吸綜合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,prrs)是由prrs病毒(prrsv)引起的一種急性傳染病，是一種以引起母豬繁殖障礙和各日齡豬呼吸疾病為特征的高度接觸性傳染病，主要特征表現(xiàn)為懷孕母豬食欲不振、持續(xù)性發(fā)熱、流產(chǎn)、早產(chǎn)、木乃伊胎及弱仔等癥狀以及哺乳仔豬和育成豬的高死亡率和呼吸系統(tǒng)疾病等，此外，通常還表現(xiàn)為部分發(fā)病的愈后母豬屢配不孕、發(fā)情不典型等癥狀。目前該病已成為危害世界養(yǎng)豬業(yè)的首要傳染病之一。該病不但缺乏治療的有效藥物，而且現(xiàn)有的疫苗也不能有效控制prrsv感染，致使prrs不斷暴發(fā)流行。

酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,elisa)是一種廣泛應(yīng)用在測(cè)定液體樣本中的蛋白、抗體或激素的免疫分析技術(shù)，具有靈敏、特異、簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定及易于自動(dòng)化操作等特點(diǎn)。適用于量大臨床標(biāo)本的同時(shí)檢測(cè)。elisa是對(duì)prrsv疫苗免疫后機(jī)體抗體效價(jià)評(píng)價(jià)的主要方法，也是對(duì)prrsv感染情況進(jìn)行監(jiān)控的最常用的方法之一。目前所建立的elisa檢測(cè)方法大多采用prrsv全病毒或表達(dá)的核衣殼(n)蛋白作為抗原，最常用的為商品化美國(guó)idexx試劑盒。但我們?cè)趹?yīng)用idexx試劑盒對(duì)臨床血清樣品檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，個(gè)別豬只即使免疫過prrsv弱毒疫苗3周后仍然檢測(cè)不到抗體，發(fā)明人分析出現(xiàn)這種原因有以下2個(gè)方面，一個(gè)是機(jī)體不產(chǎn)生prrsv的抗體，二是現(xiàn)有的檢測(cè)方法不能檢測(cè)到，這就導(dǎo)致了檢測(cè)的準(zhǔn)確率大大下降。有抗體檢測(cè)不到，無法監(jiān)控其體內(nèi)的抗體產(chǎn)生情況，容易造成假陰性而在此免疫，造成誤判，制定不合理免疫程序，造成疫病發(fā)生，從而帶來經(jīng)濟(jì)損失。因此如何克服現(xiàn)有檢測(cè)方法存在的上述缺陷成為急需解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述情況，本發(fā)明提供了一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體檢測(cè)方法及其應(yīng)用，首先將hp-prrsvhun4疫苗毒株的非結(jié)構(gòu)蛋白nsp4克隆入pet-28a(+)原核表達(dá)載體中進(jìn)行低溫誘導(dǎo)呈可溶性表達(dá)，利用his標(biāo)簽進(jìn)行純化，純化后的蛋白作為包被抗原，優(yōu)化建立間接elisa方法；并確定臨界值為0.406，利用優(yōu)化建立的elisa方法檢測(cè)1274份臨床豬血清，陽(yáng)性率為71.59％，同時(shí)與美國(guó)idexx試劑盒檢測(cè)結(jié)果比較，陽(yáng)性率符合率達(dá)到92％，其中4％的血清(50/1274)用idexx試劑盒檢測(cè)為陰性而用本發(fā)明中的技術(shù)則檢測(cè)為陽(yáng)性，說明本發(fā)明所提供的檢測(cè)方法準(zhǔn)確率高，可用于臨床血清樣品的常規(guī)檢測(cè)。

發(fā)明人針對(duì)背景技術(shù)中存在的問題，最終決定利用更換包被抗原的方式來嘗試解決，發(fā)明人應(yīng)用多個(gè)prrsv的病毒蛋白作為包被抗原建立elisa方法，最終經(jīng)過多次驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，非結(jié)構(gòu)蛋白nsp4作為包被抗原時(shí)能檢測(cè)到現(xiàn)有技術(shù)中n蛋白檢測(cè)不到的prrsv抗體，因此本發(fā)明提供的方法彌補(bǔ)了現(xiàn)有的國(guó)內(nèi)外檢測(cè)方法的不足，將更有利于prrsv抗體檢測(cè)及prrsv流行的監(jiān)控。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案是：

1.根據(jù)genbank(登陸號(hào)：ef635006)收錄的hp-prrsvhun4疫苗毒株全基因組核苷酸序列，設(shè)計(jì)并合成了一對(duì)用于擴(kuò)增hp-prrsvhun4疫苗毒株nsp4基因的引物，引物如下：

f-5’-cccgctagcggtatttcagactca-3，其核苷酸序列如seqidno.1所示；其中引入了nhei酶切位點(diǎn)；

r-5’-ccctcgagttccgttgggtttggc-3’，其核苷酸序列如seqidno.2所示；引入了xhoi酶切位點(diǎn)；

擴(kuò)增片段經(jīng)膠回收純化后，其核苷酸序列如seqidno.3所示，其編碼的氨基酸序列如seqidno.4所示；

2.目的蛋白的純化

將合成的基因片段用限制性內(nèi)切酶nhei和xhoi雙酶切后連接入pet-28a(+)載體，轉(zhuǎn)化至dh5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，加入1mmiptg，30℃誘導(dǎo)5h，收集菌體，用sds-page檢測(cè)表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在該條件下，表達(dá)的nsp4蛋白出現(xiàn)在裂解上清中，呈可溶性表達(dá)。而可溶性表達(dá)更能模擬蛋白自然特性，省去了蛋白復(fù)性的繁瑣過程。用南京金斯瑞生物科技有限公司的鎳柱純化試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行純化。

3.elisa條件優(yōu)化

對(duì)elisa過程中的每一步驟進(jìn)行優(yōu)化，其優(yōu)化的結(jié)果為：

抗原包被量：200ng，包被緩沖液為ph＝7.2的磷酸鹽緩沖液其1l溶液中含0.356gnah2po4，2.772gna2hpo4·12h2o，8.5gnacl，包被過夜；

洗滌：含有體積濃度為0.5‰的吐溫-20的ph7.2的磷酸鹽緩沖液(pbs’t)，輕微振蕩1min后棄去，重復(fù)5次；

封閉：用含有體積濃度為2.5％脫脂奶粉的ph為7.2的pbs’t緩沖液的封閉液封閉，37℃孵育1h；

洗滌：含有體積濃度為0.5‰的吐溫-20的ph7.2的磷酸鹽緩沖液(pbs’t)，輕微振蕩1min后棄去，重復(fù)5次；

血清樣品稀釋：用ph為7.2的pbs’t+體積濃度為2.5％脫脂奶粉按1:40稀釋，加入100μl；

洗滌：含有體積濃度為0.5‰的吐溫-20的ph7.2的磷酸鹽緩沖液(pbs’t)，輕微振蕩1min后棄去，重復(fù)5次；

酶標(biāo)抗體：辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗豬的抗體，用ph7.2的磷酸鹽緩沖液(pbs’t)1:2000稀釋(購(gòu)自美國(guó)jacksonimmunoresearch公司)，加入100μl，37℃孵育60min；

洗滌：含有體積濃度為0.5‰的吐溫-20的ph7.2的磷酸鹽緩沖液(pbs’t)，輕微振蕩1min后棄去，重復(fù)5次；

顯色：每孔加入底物tmb100μl，37℃避光顯色15min；

終止：每孔加3mol/l的硫酸50μl，終止反應(yīng)；

讀數(shù)：酶標(biāo)儀od450nm讀取。

4.臨界值的確定

實(shí)驗(yàn)室保存的豬的prrsv抗體陽(yáng)性血清樣品70份，這些血清來自hp-prrsvhun4疫苗(購(gòu)買自哈爾濱維科生物技術(shù)公司)免疫過的豬場(chǎng)，用westernblot和idexx試劑盒檢測(cè)均為陽(yáng)性；陰性血清樣品80份(取自prrsv陰性豬場(chǎng))，用上述條件進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果用tg-roc軟件分析od值其cut-off值為0.406。

采用本發(fā)明上述公開的檢測(cè)方法，具有如下有益效果：

本發(fā)明中建立的是以prrsv非結(jié)構(gòu)蛋白nsp4作為包被抗原建立的elisa方法。在低溫誘導(dǎo)下獲得可溶性的nsp4，更能模擬蛋白自然特性，保存有更多nsp4上的b細(xì)胞表位區(qū)域，與抗體結(jié)合更特異有效，也省去了蛋白復(fù)性的繁瑣過程。建立的以nsp4為包被抗原的elisa與idexx試劑盒的符合率能達(dá)到92％，更為重要的是該方法能檢測(cè)到idexx試劑盒無法檢測(cè)到的prrsv抗體陽(yáng)性血清樣品，可彌補(bǔ)經(jīng)典prrsv抗體檢測(cè)elisa中的不足和缺陷，可用于臨床血清的檢測(cè)，對(duì)prrsv疫苗抗體和感染情況進(jìn)行監(jiān)控。

附圖說明

圖1為prrsvnsp4蛋白的重組蛋白westernblot電泳圖，

圖中m為1為空載體轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，2為純化的重組蛋白，3未純化重組蛋白，從圖中可以顯現(xiàn)出空載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌1未誘導(dǎo)蛋白因此沒有目的蛋白，誘導(dǎo)純化蛋白2有較純的目的蛋白；未純化重組蛋白3有目的蛋白也有其他細(xì)菌蛋白。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。在實(shí)施例中涉及的所有培養(yǎng)基和分子生物學(xué)等技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。

實(shí)施例中所用的試劑均采用現(xiàn)有技術(shù)中已知的產(chǎn)品。

實(shí)施例1nsp4基因獲得的獲得

a.rna提取：將hp-prrsvhun4疫苗(購(gòu)買自哈爾濱維科生物技術(shù)公司)200μl，加入相同體積的trizol，按照說明書提取prrsvrna，測(cè)定rna濃度，放-80℃冰箱備用。

b.反轉(zhuǎn)錄：將提取的rna進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系為20μl包括：5×反轉(zhuǎn)錄酶buffer2μl，10mmdntpmix4μl，rna酶抑制劑1ul，oligo(dt)18primer1μl，amv反轉(zhuǎn)錄酶1μl，rnase-freewater1μl，模板rna1μg；反應(yīng)條件為42℃，60min；70℃，5min。

c.pcr擴(kuò)增目的片段：以反轉(zhuǎn)錄合成的cdna為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50μl:上下游引物各1μl，takarapremixtaq25μl，cdna2μl，補(bǔ)水至50μl。反應(yīng)條件:94℃，5min；94℃，30s；62℃，30s；72℃，45s；72℃延伸10min，4℃終止,31個(gè)循環(huán)。pcr產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收、純化。

其中所采用的引物如下：

f-5’-cccgctagcggtatttcagactca-3，其核苷酸序列如seqidno.1所示；其中引入了nhei酶切位點(diǎn)；

r-5’-ccctcgagttccgttgggtttggc-3’，其核苷酸序列如seqidno.2所示；引入了xhoi酶切位點(diǎn)；

擴(kuò)增片段經(jīng)膠回收純化后，其核苷酸序列如seqidno.3所示，其編碼的氨基酸序列如seqidno.4所示；

d.表達(dá)載體的克?。簩U(kuò)增的片段(seqidno.3)進(jìn)行膠回收純化，用限制性內(nèi)切酶nhei和xhoi雙酶切后連接入pet-28a(+)載體，轉(zhuǎn)化至dh5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，用卡那霉素抗性篩選重組轉(zhuǎn)化子,挑取單個(gè)菌落、提取質(zhì)粒，并對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切鑒定正確的質(zhì)粒送至上海生物工程股份有限公司測(cè)序。

實(shí)施例2nsp4表達(dá)純化

a.nsp4蛋白的表達(dá)鑒定：將重組表達(dá)質(zhì)粒pet28a-nsp4轉(zhuǎn)化表達(dá)菌trasseta(de3)感受態(tài)細(xì)胞，利用卡那抗性篩選重組轉(zhuǎn)化子，挑取單菌落于lb培養(yǎng)基中活化過夜，按體積比1％比例轉(zhuǎn)接到新鮮含有卡那抗性的lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)至od600約為0.8時(shí)加入終濃度為1mm的iptg，225rpm，30℃震蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)5h。4℃10000g離心10min收集菌體，用pbs重懸，超聲破碎，12000rpm4℃離心15min，收集上清和沉淀，進(jìn)行sds-page鑒定。結(jié)果表明目的蛋白獲得了高效表達(dá)，大小約為26kda，大部分目的蛋白位于裂解上清中。

b.nsp4蛋白的純化：將轉(zhuǎn)化有pet28a-nsp4的表達(dá)菌trasseta(de3)大量培養(yǎng)后，超聲波破碎后，離心取上清。用南京金斯瑞生物科技有限公司的鎳柱純化試劑盒在非變性條件下對(duì)蛋白進(jìn)行純化。

c.純化蛋白的鑒定：將純化的nsp4蛋白進(jìn)行sds-page電泳，轉(zhuǎn)印至pvdf膜上，以his標(biāo)簽鼠抗體為一抗，hrp標(biāo)記的羊抗鼠igg抗體為二抗，ecl顯色進(jìn)行檢測(cè)，在26kda處出現(xiàn)了一條特異性的條帶。鑒定該蛋白氨基酸序列如seqidno.4所示。

實(shí)施例3elisa條件優(yōu)化

對(duì)elisa過程中的每一步驟進(jìn)行優(yōu)化，其優(yōu)化的結(jié)果為：

a.抗原包被量：用50-1000ng的純化nsp4為包被蛋白，發(fā)現(xiàn)包被200ng時(shí)p/n值最高；

b.包被條件：對(duì)不同的包被緩沖液和作用時(shí)間檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)包被緩沖液為ph＝7.2的磷酸鹽緩沖液其1l溶液中含0.356gnah2po4，2.772gna2hpo4·12h2o，8.5gnacl，包被過夜時(shí)p/n值最高；

c.封閉條件：用含有2.5％脫脂奶粉的ph為7.2的pbs’t緩沖液的封閉液封閉，37℃孵育1h時(shí)p/n值最高；

d.血清樣品稀釋：用ph為7.2的pbs’t+體積濃度為2.5％脫脂奶粉按1:40稀釋，加入100μl時(shí)p/n值最高；

e.酶標(biāo)抗體：辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗豬的抗體1:2000倍用ph7.2的磷酸鹽緩沖液(pbs’t)稀釋(購(gòu)自美國(guó)jacksonimmunoresearch公司)100μl，37℃孵育60min時(shí)p/n值最高；

f.洗滌條件：含有體積濃度為0.5‰的吐溫-20的ph7.2的磷酸鹽緩沖液(pbs’t)，輕微振蕩1min后棄去，重復(fù)5次時(shí)p/n值最高；

g.其他條件：顯色：每孔加入底物tmb100μl，37℃避光顯色15min；

h.終止：每孔加3mol/l的硫酸50μl，終止反應(yīng)；

i.讀數(shù)：酶標(biāo)儀od450nm讀取。

實(shí)施例4臨界值的確定

為了確定建立的elisa的臨界值，用prrsv抗體陽(yáng)性血清樣品70份，這些血清來自hp-prrsvhun4疫苗(購(gòu)買自哈爾濱維科生物技術(shù)公司)免疫豬場(chǎng)，用westernblot和idexx試劑盒檢測(cè)均為陽(yáng)性；陰性血清樣品80份(取自prrsv陰性豬場(chǎng))，用上述優(yōu)化的條件進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果用tg-roc軟件分析。經(jīng)分析在特異性和敏感性均為100％時(shí)，確定了cut-off值為0.406。

實(shí)施例5建立elisa方法的應(yīng)用

利用本發(fā)明所述的檢測(cè)方法對(duì)來自各地養(yǎng)殖場(chǎng)收集的豬血清1274份進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟如下：

1.樣品處理：將采集的豬的血樣放置于1.5ml離心管中，以8000rpm/min的轉(zhuǎn)速，離心5分鐘，除去紅細(xì)胞和雜質(zhì)，收集上清用于檢測(cè)；

2.加樣：將純化的nsp4蛋白包被過夜后，封閉。酶標(biāo)板分別設(shè)置2個(gè)陰陽(yáng)對(duì)照孔，其余孔為待測(cè)樣品孔；待測(cè)樣品先用稀釋液(ph為7.2的pbs’t+體積濃度比為2.5％脫脂奶粉)把步驟1中離心后的血清按1:40稀釋好，然后把稀釋好的混合液逐滴加入包被好的酶標(biāo)板中；加樣時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，用封板膜封板后置37℃溫育1h；

3、洗滌：棄去酶標(biāo)板中的液體，甩干，每孔加滿洗滌液(洗滌液為ph為7.2的pbs+0.5‰吐溫-20)，輕微振蕩1min后棄去，重復(fù)5次，拍干，此步驟的目的是為了洗去板孔中沒有與包被的蛋白結(jié)合的物質(zhì)；

4、加酶標(biāo)抗體：每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗豬的抗體100μl(1:1000倍稀釋)，用封板膜封板后置37℃孵育1h，此步驟中酶標(biāo)抗體與結(jié)合在固相蛋白上的nsp4抗體結(jié)合；

5、洗滌：操作同步驟4，此步驟是為了洗去板孔中未結(jié)合的酶標(biāo)抗體；

6、顯色：每孔加入顯色劑(底物tmb)100μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15min，此步驟中顯色劑與辣根過氧化物酶反應(yīng)顯藍(lán)色；

7、終止：每孔加終止液(3mol/l的硫酸)50μl，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立即變?yōu)辄S色)；

8、測(cè)定：用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔的吸光度(od值)。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15min以內(nèi)進(jìn)行。

結(jié)果判定：根據(jù)樣品的od值于臨界值比較，當(dāng)試劑盒所測(cè)樣品的od值大于cut-off為陽(yáng)性，所測(cè)樣品的od值小于cut-off值為陰性。

在1274份血清中，nsp4蛋白包被的elisa檢測(cè)陽(yáng)性樣品為912份，占71.59％；陰性樣品362份，占28.41％。idexx試劑盒檢測(cè)結(jié)果的陽(yáng)性樣品為989份，占77.63％；陰性樣品285份，占22.37％。對(duì)其中檢測(cè)結(jié)果不同的分析發(fā)現(xiàn)，50份血清中用idexx試劑盒檢測(cè)為陰性，但是用我們建立的nsp4包被的elisa全為陽(yáng)性，經(jīng)westernblot驗(yàn)證，有49份能與nsp4蛋白結(jié)合，本發(fā)明中建立的elisa方法可彌補(bǔ)iedxx試劑盒的補(bǔ)足，可用于臨床常規(guī)檢測(cè)使用。

<110>山東農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體檢測(cè)方法及其應(yīng)用

<160>4

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

cccgctagcggtatttcagactca24

<210>2

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ccctcgagttccgttgggtttggc24

<210>3

<211>612

<212>dna

<213>豬繁殖與呼吸綜合征病毒prrsv

<400>3

ggtgctttcagaactcaaaagccctcactgaacaccgtcaatgtggtcgggtcctccatg60

ggctctggcggagtgttcactattgacgggaaaatcaagtgcgtgactgccgcacatgtc120

cttacgggtaactcagctagggtttccggggtcggtttcaatcaaatgcttgactttgat180

gtaaaaggggacttcgccatagctgattgcccgaattggcaaggggttgctcccaaggcc240

cagttctgcgaggatgggtggactggtcgcgcctattggctgacatcctctggcgttgaa300

cccggtgttattgggaatgggttcgccttttgcttcaccgcgtgtggcgattctggatcc360

ccagtgattaccgaagccggtgagcttgtcggcgttcacacaggatcaaacaaacaagga420

ggaggcattgtcacgcgcccctcaggccagttttgtaatgtgaagcccatcaagctgagc480

gagttgagtgaattcttcgctggacctaaggttccgctcggtgatgtgaaaattggcagt540

cacataattaaagacgcatgcgaggtgccttcagatctttgtgccctgcttgctgccaaa600

cccgaactggaa612

<210>4

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<213>豬繁殖與呼吸綜合征病毒prrsv

<400>4

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151015

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202530

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354045

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808590

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110115120

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125130135

serasnlysglnglyglyglyilevalthrargproserglygln

140145150

phecysasnvallysproilelysleusergluleusergluphe

155160165

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170175180

hisileilelysaspalacysgluvalproseraspleucysala

185190195

leuleualaalalysprogluleuglu

200204