本發(fā)明屬于植物病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測黃瓜花葉病毒的lamp引物組、試劑盒及檢測方法。

背景技術(shù)：

黃瓜花葉病毒(cucumbermosaicvirus，cmv)是雀麥花葉病毒科(bromoviridae)、黃瓜花葉病毒屬(cucumovirus)的典型成員，在世界范圍內(nèi)均有分布。其寄主范圍廣泛，可侵染52科174屬的775種植物。自然侵染寄主有黃瓜、煙草、心葉煙、菜豆、莧色藜、昆諾藜和豇豆等，可通過種子、鱗莖、塊莖及苗木等無性繁殖材料實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)距離傳播。但是，從百合植株上獲得的cmv株系均不能通過汁液摩擦接種侵染昆諾藜、莧色藜、普通煙、心葉煙等6科10種指示植物。

目前cmv傳統(tǒng)的診斷方法主要有：病毒分離及用免疫學(xué)方法診斷抗原。包括常規(guī)的rt-pcr、elisa技術(shù)和基因芯片技術(shù)。

但是，在pcr檢測中有一些關(guān)鍵性限制因素，易導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果出現(xiàn)；elisa檢測是由于抗原抗體反應(yīng)的專一性使其具有有限性；目前普遍看好的基因芯片技術(shù)因其需要昂貴的芯片制作系統(tǒng)，操作復(fù)雜、費(fèi)時，對操作人員的專業(yè)素質(zhì)要求比較高而難以推廣應(yīng)用。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)是一種核酸擴(kuò)增技術(shù)，由notomi在2000年提出。它是由于4種引物與靶基因上的6個不同部位完全匹配，才能進(jìn)行擴(kuò)增因此能獲得比pcr更高的特異性；lamp一般能檢測到比pcr至少低10倍的拷貝數(shù)，尤其是對于低濃度的病毒數(shù)量或無癥狀的病毒攜帶者的檢測比pcr的效果更好；lamp是恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)比pcr反應(yīng)速度更快，而且成本低，易推廣。它只需一個簡單的恒溫器，不需要昂貴的pcr儀，對操作人員的分子生物學(xué)技能要求不高。產(chǎn)物檢測便捷：lamp反應(yīng)可合成10⁹數(shù)量級的dna，同時產(chǎn)生大量的焦磷酸根離子，它們能與鎂離子結(jié)合生成白色的焦磷酸鎂沉淀，可根據(jù)反應(yīng)體系中是否形成白色沉淀來可視化定性判斷l(xiāng)amp反應(yīng)結(jié)果。此外，還可進(jìn)行凝膠電泳，濁度儀根據(jù)產(chǎn)物渾濁度的不同對原始核酸分子進(jìn)行實(shí)時定量分析，還可以直接肉眼檢測或者在反應(yīng)體系中加入熒光染料，觀察變色情況。

該方法成本低廉，操作簡單，只需臺水浴鍋、pcr儀就可在基層推廣，lamp技術(shù)因其快速、高效、特異性好、靈敏度高和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于病原菌、寄生蟲、病毒、疾病和轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測領(lǐng)域，具有廣闊的發(fā)展應(yīng)用空間。

然而，黃瓜花葉病毒是rna單鏈病毒，容易發(fā)生變異，而且不同變異株之間會有許多突變位點(diǎn)，因此，利用lamp技術(shù)檢測浸染百合的黃瓜花葉病毒的難點(diǎn)在于保守序列的選擇和引物的設(shè)計(jì)，方法靈敏度較高，還需要嚴(yán)格的防污染措施來避免假陽性結(jié)果。

目前，lamp技術(shù)還未被應(yīng)用于侵染百合的黃瓜花葉病毒的檢測。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種檢測黃瓜花葉病毒的lamp引物、試劑盒及檢測方法，該引物特異性強(qiáng)，與常見侵染百合的其它7種病毒無交叉，靈敏度高，可在模板純度只有10¹拷貝數(shù)下進(jìn)行擴(kuò)增，建立的黃瓜花葉病毒的lamp診斷方法，具有反應(yīng)條件簡單、操作簡便快速、結(jié)果判定方便、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

一種用于檢測黃瓜花葉病毒的lamp引物組，其包括外引物f3和b3，內(nèi)引物fip和bip，從5’端到3’端，具體序列如下：

f3:5'-ccacccaacctttgtagg-3'；

b3:5'-cggcaaaggattaactcga-3'；

fip:5'-gtctatttttggtggctttagggtttttgagtgaacgctgtaaacct-3'；

bip:5'-cgtgggtcttattatggtaaaaggtttttatttgaatgcgcgaaaca-3'。

本發(fā)明提供一種包含所述lamp引物組的黃瓜花葉病毒的lamp檢測試劑盒。

進(jìn)一步，所述lamp檢測試劑盒包含lamp反應(yīng)體系，該lamp反應(yīng)體系包括：內(nèi)引物fip、內(nèi)引物bip、外引物f3、外引物b3、10×buffer、mg²⁺、dntps、甜菜堿和bstdna聚合酶，其中，內(nèi)引物與外引物的濃度之比的范圍為8-16：1。

進(jìn)一步，所述的lamp反應(yīng)體系中，各成分的終濃度為：內(nèi)引物fip0.8-1.6μm，內(nèi)引物bip0.8-1.6μm，外引物f30.1-0.2μm，外引物b30.1-0.2μm，mg²⁺1.0-2.0mm，dntps0.2-0.3mm，甜菜堿0.6-1m，bstdna聚合酶0.26-0.38u/μl，其中，內(nèi)引物與外引物的濃度比為8-16：1。

優(yōu)選地，所述lamp反應(yīng)體系中，各成分的終濃度為：內(nèi)引物fip1.2-1.6μm，內(nèi)引物bip1.2-1.6μm，外引物f30.12-0.2μm，外引物b30.12-0.2μm，mg²⁺1.3-1.7mm，dntps0.25-0.3mm，甜菜堿0.6-0.8m，bstdna聚合酶0.32-0.38u/μl，其中，內(nèi)引物與外引物的濃度比為8-16：1。

更優(yōu)選地，所述lamp反應(yīng)體系中，各成分的終濃度為：fip1.6μm，bip1.6μm，f30.2μm，b30.2μm，10×buffer2.5μl，mg²⁺1.5mm，dntps0.3mm，甜菜堿0.6m，bst酶0.38u/μl。

一種黃瓜花葉病毒的lamp快速檢測方法，包括以下步驟：

1)提取待測樣品rna，將總rna的50ng-5μg用全式基因逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cdna；

2)配制lamp反應(yīng)體系；

以ddh2o為陰性對照，以包含黃瓜花葉病毒目的序列的質(zhì)粒為陽性對照，配制lamp反應(yīng)體系；

所述lamp反應(yīng)體系中，各成分的終濃度為：內(nèi)引物fip0.8-1.6μm，內(nèi)引物bip0.8-1.6μm，外引物f30.1-0.2μm，外引物b30.1-0.2μm，10×buffer，mg²⁺1.0-2.0mm，dntps0.2-0.3mm，甜菜堿0.6-1m，bstdna聚合酶0.26-0.38u/μl，其中，內(nèi)引物與外引物的濃度比為8-16：1；

3)進(jìn)行l(wèi)amp擴(kuò)增反應(yīng)

lamp擴(kuò)增反應(yīng)的程序?yàn)椋?5-63℃30-60min，80-85℃3-5min；

4)鑒定擴(kuò)增結(jié)果

步驟3)lamp擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，向擴(kuò)增產(chǎn)物中加入sybrgreeni染料，觀察顏色變化：顯色為綠色的樣品為陽性，含有黃瓜花葉病毒；顯色為橘色的樣品為陰性，不含黃瓜花葉病毒。

進(jìn)一步，在所述的lamp反應(yīng)體系中，各成分的終濃度為：內(nèi)引物fip1.2-1.6μm，內(nèi)引物bip1.2-1.6μm，外引物f30.12-0.2μm，外引物b30.12-0.2μm，mg²⁺1.3-1.7mm，dntps0.25-0.3mm，甜菜堿0.6-0.8m，bstdna聚合酶0.32-0.38u/μl，其中，內(nèi)引物與外引物的濃度比為8-16：1。

將本發(fā)明所述的lamp引物用于黃瓜花葉病毒的rt-lamp檢測中。

進(jìn)一步，所述rt-lamp檢測的反應(yīng)體系中，以黃瓜花葉病毒rna為模板，反應(yīng)體系中各成分的終濃度為：內(nèi)引物fip1.3-1.7μm，內(nèi)引物bip1.3-1.7μm，外引物f30.1-0.3μm，外引物b30.1-0.3μm，10×buffer，mg²⁺1.3-1.7mm，dntps0.2-0.3mm，甜菜堿0.4-0.6m，bst酶0.6-0.8u/μl，dtt0.15-0.2mm，逆轉(zhuǎn)錄酶3-4u/μl，待測樣品rna20ng-5μg，反應(yīng)程序?yàn)椋?0-65℃30-60min，80-85℃3-5min。

本發(fā)明的lamp或rt-lamp反應(yīng)體系中，10×buffer的添加遵循本領(lǐng)域中的常規(guī)添加原則，通常為反應(yīng)總體積的十分之一。

本發(fā)明根據(jù)黃瓜花葉病毒(cmv)cp基因序列(genbank登錄號為aj006988.1)，在選擇保守區(qū)域時避開所有的突變位點(diǎn)，使引物具有高特異性，設(shè)計(jì)篩選出2對引物，其為內(nèi)引物fip、bip和外引物f3、b3。

利用本發(fā)明的fip、bip、f3和b3引物，在恒溫條件下，經(jīng)過高活性鏈置換酶bst酶的作用，dna不斷循環(huán)擴(kuò)增，主要可分2個階段，啟動階段和循環(huán)擴(kuò)增階段，lamp擴(kuò)增原理參見圖1和圖2。

在啟動階段，引物向雙鏈dna的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基配對延伸時，另一條鏈就會解離，釋放單鏈。如圖1所示，雙鏈dna模板在等溫(60-65℃)的條件下，內(nèi)部引物fip退火，fip中的f2序列跟模板鏈上flc位點(diǎn)結(jié)合，在具有鏈置換活性的dna聚合酶作用下啟動核酸的合成。外部引物f3與模板f3c區(qū)域結(jié)合并延伸，置換出完整的fip連接的互補(bǔ)單鏈，并置換釋放一條單鏈dna；單鏈dna一端自動形成環(huán)的結(jié)構(gòu)，可作為bip引物的模板，bip啟動鏈的合成，隨后b3引物退火，同模板鏈雜交，引導(dǎo)鏈置換反應(yīng)產(chǎn)生一條雙鏈dna和一條兩端成環(huán)的單鏈dna，形成一個啞鈴環(huán)的結(jié)構(gòu)；此后，3’端自動引導(dǎo)dna的合成，快速形成一種莖環(huán)的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)作為lamp反應(yīng)中循環(huán)反應(yīng)的起始結(jié)構(gòu)，進(jìn)入lamp反應(yīng)的循環(huán)擴(kuò)增階段。

第2階段是擴(kuò)增循環(huán)階段，主要由內(nèi)部引物fip和bip作用，如圖2所示：以莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)為模板，引物fip退火，與莖環(huán)的f2c區(qū)結(jié)合，開始鏈置換合成，解離出的單鏈核酸上也會形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，迅速以3’末端的b1區(qū)段為起點(diǎn)，以自身為模板，進(jìn)行dna合成延伸以及鏈置換，形成長短不一的2條新莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的dna，bip引物上的b2區(qū)域與其雜交，啟動新一輪擴(kuò)增，且產(chǎn)物dna長度增加一倍。擴(kuò)增的最后產(chǎn)物是具有不同個數(shù)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)、不同莖長度的莖結(jié)構(gòu)dna和帶有許多環(huán)的類似花椰菜結(jié)構(gòu)dna的混合物，且產(chǎn)物dna為擴(kuò)增靶序列的交替反向重復(fù)序列，因此lamp電泳條帶為一系列不同大小的梯狀條帶。

本發(fā)明對lamp反應(yīng)溫度和體系進(jìn)行了詳盡、可靠的研究。由于反應(yīng)中bstdna聚合酶的最佳反應(yīng)溫度為60℃左右，溫度過高或過低都會對酶的活性產(chǎn)生較大影響，本發(fā)明對黃瓜花葉病毒的lamp反應(yīng)溫度在55℃-65℃之間進(jìn)行了篩選，確定合適的退火溫度范圍為：55-63℃，在該溫度范圍內(nèi)，lamp反應(yīng)效率和產(chǎn)物產(chǎn)量較高。

本發(fā)明對lamp反應(yīng)體系中的引物和dntps，甜菜堿(betaine)，bst酶，模板的量分別進(jìn)行了優(yōu)化篩選，不同的引物比例的擴(kuò)增效率不同，本發(fā)明最終確定的內(nèi)引物與外引物比例范圍為8-16：1，在該引物比例范圍內(nèi)，可以使用凝膠電泳法檢測出明顯的陽性梯狀條帶。根據(jù)四因素三水平優(yōu)化方案對dntps、betaine、bst酶，模板四個因素的添加量進(jìn)行優(yōu)化，最終確定各物質(zhì)的終濃度范圍為：dntps0.25-0.3mm，甜菜堿0.6-0.8m，bstdna聚合酶0.32-0.38u/μl，在該濃度范圍內(nèi)，能獲得良好的反應(yīng)效率和產(chǎn)物產(chǎn)量。

利用本發(fā)明的lamp引物組，可以直接采用樣品中提取的總rna進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫實(shí)驗(yàn)rt-lamp，利用逆轉(zhuǎn)錄酶revertraace(toyobo)和bst酶，將lamp和逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，極大地縮短了反應(yīng)時間，以rna作為模板，減少了將rna逆轉(zhuǎn)錄成cdna的步驟，既減少了逆轉(zhuǎn)錄的中間過程和人為操作帶來的誤差，又克服了以往lamp易出現(xiàn)的假陽性結(jié)果。

與現(xiàn)有技術(shù)對比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明的黃瓜花葉病毒lamp引物特異性強(qiáng)，與常見侵染百合的7種病毒，具體包括百合無癥病毒樣品、蠶豆萎蔫病毒樣品、百合x病毒樣品、百合斑駁病毒樣品、南芥菜花葉病毒樣品、蘋果莖溝病毒樣品、水仙花葉病毒樣品，經(jīng)過測試，不會產(chǎn)生交叉感染。

本發(fā)明的lamp檢測方法特異性好，靈敏度高，在黃瓜花葉病毒的診斷中，可在模板純度只有10¹拷貝數(shù)下進(jìn)行擴(kuò)增，具有反應(yīng)條件簡單、操作簡便快速、結(jié)果判定方便、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

將本發(fā)明的lamp引物組和反應(yīng)體系制成lamp試劑盒，在試劑盒中設(shè)置陰性對照以證明反應(yīng)體系未被黃瓜花葉病毒目的序列污染，設(shè)置陽性對照以對比測定結(jié)果的正確性，進(jìn)行cmv的lamp可視化快速檢測，操作簡捷，向產(chǎn)物中加入熒光染料，依據(jù)顏色變化進(jìn)行結(jié)果判定，實(shí)現(xiàn)反應(yīng)結(jié)果的可視化、易判定、易于推廣應(yīng)用。

本發(fā)明可用于環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增(rt-lamp)，直接檢驗(yàn)百合樣品總rna，減少實(shí)驗(yàn)假陰性或假陽性實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)生，在保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的同時，更加經(jīng)濟(jì)節(jié)約，高效，非常易于臨床推廣。

附圖說明

圖1為本發(fā)明中l(wèi)amp擴(kuò)增中第1擴(kuò)增階段示意圖。

圖2為本發(fā)明中l(wèi)amp擴(kuò)增中第2擴(kuò)增階段示意圖。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中l(wèi)amp擴(kuò)增結(jié)果可視化結(jié)果示意圖。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例2中l(wèi)amp擴(kuò)增結(jié)果電泳檢測示意圖。

圖5為對比例的lamp擴(kuò)增示意圖。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例4中l(wèi)amp靈敏度電泳結(jié)果示意圖。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例4中pcr靈敏度電泳結(jié)果示意圖。

圖8為本發(fā)明實(shí)施例4中l(wèi)amp靈敏度可視化結(jié)果示意圖。

圖9為本發(fā)明實(shí)施例5中l(wèi)amp特異性電泳示意圖。

圖10為本發(fā)明實(shí)施例5中l(wèi)amp特異性可視化結(jié)果示意圖。

圖11為本發(fā)明實(shí)施例6中rt-lamp電泳結(jié)果示意圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1一種用于檢測百合中黃瓜花葉病毒的lamp引物組的獲得

根據(jù)genbank中查找到cmv的coatproteingene(cp)序列(genbank登錄號為aj006988.1)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)原理如下：

由于lamp主要依靠鏈置換而成，所以靶序列長度應(yīng)小于300bp，若大于500bp將很難擴(kuò)增，本發(fā)明根據(jù)靶基因的6個區(qū)域3’端的f3c、f2c、f1c以及5’端的b1、b2、b3，設(shè)計(jì)了4條特異性引物fip、bip、f3和b3。

fip引物為上游內(nèi)部引物(forwardinnerprimer)，由tttt序列鏈接f2區(qū)和f1c區(qū)域組成，f2區(qū)與靶基因3’端的f2c區(qū)域互補(bǔ)，f1c區(qū)與靶基因5’端的flc區(qū)域序列相同。bip引物為下游內(nèi)部引物(backwardinnerprimer)，由tttt序列連接b1c和b2區(qū)域組成，b2區(qū)與靶基因3’端的b2c區(qū)域互補(bǔ)，blc域與靶基因5’端的blc區(qū)域序列相同f3引物為上游外部引物(forwardouterprimer)，由f3區(qū)組成，并與靶基因的f3c區(qū)域互補(bǔ)。b3引物為下游外部引物(backwardouterprimer)，由b3區(qū)域組成，和靶基因的b3c區(qū)域互補(bǔ)。

具體序列如下：

f3:5'-ccacccaacctttgtagg-3'；

b3:5'-cggcaaaggattaactcga-3'；

fip:5'-gtctatttttggtggctttagggtttttgagtgaacgctgtaaacct-3'；

bip:5'-cgtgggtcttattatggtaaaaggtttttatttgaatgcgcgaaaca-3'。

實(shí)施例2黃瓜花葉病毒的lamp檢測方法

1)使用總rna提取試劑盒(上海博滿生物科技有限公司)，并參照試劑盒說明書，提取感染黃瓜花葉病毒的百合植株樣品總rna。

2)將提取的50ng-5μg的總rna使用全式基因逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，進(jìn)行

逆轉(zhuǎn)錄，獲得cdna；

3)配制lamp反應(yīng)體系

設(shè)置陰性對照(ddh2o)體系和陽性對照(包含黃瓜花葉病毒目的序列的質(zhì)粒)體系，設(shè)置陰性對照以證明反應(yīng)體系未被黃瓜花葉病毒目的序列污染，設(shè)置陽性對照以對比測定結(jié)果的正確性。

為防止實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)假陽性結(jié)果，配制lamp反應(yīng)體系和兩個對照體系時，進(jìn)行分區(qū)操作。

配制反應(yīng)體系時，不添加模板，先將ddh2o、dntps、10×buffer、fip、bip、f3、b3和甜菜堿配制好，分成三組，分別加入陰性對照(ddh2o)、待測樣品cdna模板和陽性對照(包含黃瓜花葉病毒目的序列的質(zhì)粒)，加入陰性對照的成為陰性對照體系，加入待測樣品的成為反應(yīng)體系，加入陽性對照的成為陽性對照體系，將各體系的混合物渦旋混勻、瞬離，在95℃水浴鍋中加熱5min，再冰浴5min后，再加入bst酶，其中，bst酶需與dna模板和陽性對照質(zhì)粒隔離放置。

25μl的lamp反應(yīng)體系中包括：ddh2o5.1μl，濃度2.5mm的1×dntps3.0μl，10×buffer(含mg²⁺)2.5μl，濃度10μm的fip3.5μl，濃度10μm的引物bip3.5μl，濃度10μm的引物f30.3μl，濃度10μm的引物b30.3μl，濃度5m的甜菜堿5μl，逆轉(zhuǎn)錄所得cdna1μl，8u/μl的bst酶0.8μl。

4)進(jìn)行l(wèi)amp擴(kuò)增反應(yīng)

配制好反應(yīng)體系后進(jìn)行l(wèi)amp擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃59min，80℃3min；

5)鑒定擴(kuò)增結(jié)果

步驟3)lamp擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，向擴(kuò)增產(chǎn)物中加入2μlsybrgreeni染料，觀察顏色變化：顯色綠色的樣品為陽性，含有黃瓜花葉病毒；顯色橘色的樣品為陰性，不含黃瓜花葉病毒，結(jié)果參見圖3。

或者取lamp擴(kuò)增產(chǎn)物5μl在goldview染色的2％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，然后在凝膠成像儀器的紫外光下顯影觀察，出現(xiàn)特征性梯狀條帶的樣品為陽性，含有黃瓜花葉病毒；無條帶出現(xiàn)的樣品為陰性，不含黃瓜花葉病毒，結(jié)果參見圖4。

由圖3-4可以看出，電泳結(jié)果和顯色結(jié)果表明黃瓜花葉病毒(cmv)和陽性對照質(zhì)粒(p)均顯示為陽性結(jié)果，陰性對照(n)均表現(xiàn)為陰性結(jié)果。而且黃瓜花葉病毒的lamp可視化快速檢測與電泳結(jié)果一致。

對比例

除lamp反應(yīng)體系與本實(shí)施例不同外，其余操作及反應(yīng)條件與實(shí)施例2相同。

其中，所用的lamp反應(yīng)體系為：ddh2o1.3μl，濃度2.5mm的1×dntps4.0μl，10×buffer(含mg²⁺)2.5μl，濃度10μm的fip1.0μl，濃度10μm的引物bip1.0μl，濃度10μm的引物f34μl，濃度10μm的引物b34μl，濃度5m的甜菜堿5μl，逆轉(zhuǎn)錄所得cdna模板1μl，8u/μl的bst酶1.2μl。

所擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果參見圖5，其中，泳道cmv為使用本對比例反應(yīng)體系來檢測黃瓜花葉病毒。

結(jié)果表明，利用對比例的反應(yīng)體系，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，梯狀條帶在紫外光下幾乎不能識別，反應(yīng)效率很低。

實(shí)施例3黃瓜花葉病毒的lamp檢測試劑盒組裝

1、包裝規(guī)格：200次

2、試劑盒成分如表1：

表1

*：內(nèi)含buffer、dntpsmix和甜菜堿。

3、運(yùn)輸及保存方法：

低溫運(yùn)輸，避光保存。短期使用放至4℃避光保存，長期保存請置于-20℃或-80℃冰箱避光保存。

4、使用注意事項(xiàng)：

1)全部的物品，凡是接觸過病毒材料的，為不將實(shí)驗(yàn)室污染和對檢測人員造成影響都需要被合理處理。

2)把整個實(shí)驗(yàn)分區(qū)進(jìn)行操作，嚴(yán)禁器材和試劑倒流，以免污染。

3)顯色劑低毒，應(yīng)于室溫條件避光保存，操作時應(yīng)戴上手套。

4)注意不要讓試劑盒中的各個成分受到污染，可進(jìn)行分裝使用。

5)操作過程中，移液、取樣，定時等全部過程必須精確。嚴(yán)格遵守操作說明可以獲得最好的結(jié)果。

實(shí)施例4靈敏度驗(yàn)證

本實(shí)施例將經(jīng)測序驗(yàn)證過cmv的質(zhì)粒，按照拷貝數(shù)進(jìn)行稀釋實(shí)驗(yàn)，按照cmv質(zhì)粒10⁷拷貝、10⁶拷貝、10⁵拷貝、10⁴拷貝、10³拷貝、10²拷貝、10¹拷貝分別進(jìn)行l(wèi)amp和pcr檢測。

lamp反應(yīng)體系：ddh2o5.3μl，濃度2.5mm的1×dntps3.0μl，10×buffer(含mg²⁺)2.5μl，濃度10μm的fip4.0μl，濃度10μm的引物bip4.0μl，濃度10μm的引物f30.5μl，濃度10μm的引物b30.5μl，濃度5m的甜菜堿3μl，8u/μl的bst酶1.2μl，逆轉(zhuǎn)錄所得cdna模板1μl。

pcr反應(yīng)體系：ddh2o17μl，濃度2.5mm的1×dntps2.0μl，10×buffer(含mg²⁺)2.5μl，濃度10μm的引物f31.0μl，濃度10μm的引物b31.0μl，濃度逆轉(zhuǎn)錄所得cdna1μl，5u/μl的taqdna聚合酶0.5μl。

pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10min，進(jìn)入pcr反應(yīng)循環(huán)：95℃變性60s，51℃退火40s，72℃延伸35s，共進(jìn)行35個循環(huán)，72℃總延伸7min。

lamp反應(yīng)程序和結(jié)果顯示方法參見實(shí)施例2，pcr結(jié)果采用瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行檢測，目的片段長為183bp，檢測結(jié)果如圖6-8所示，其中，1為cmv質(zhì)粒10⁷拷貝，2為cmv質(zhì)粒10⁶拷貝，3為cmv質(zhì)粒10⁵拷貝，4為cmv質(zhì)粒10⁴拷貝，5為cmv質(zhì)粒10³拷貝，6為cmv質(zhì)粒10²拷貝，7為cmv質(zhì)粒10¹拷貝，n為陰性對照。

圖6-7結(jié)果表明，本發(fā)明的lamp可以檢驗(yàn)出10¹而pcr只能檢驗(yàn)出10³拷貝，說明本發(fā)明lamp檢測法能夠檢測出的最低濃度比pcr檢測低2個數(shù)量級，這證明本發(fā)明中l(wèi)amp方法具有極高的靈敏度。

由于使用lamp技術(shù)檢測黃瓜花葉病毒的靈敏度較高，采用良好的防污染措施可避免假陽性結(jié)果。

同時，由圖8可以看出，黃瓜花葉病毒的lamp可視化快速檢測與電泳結(jié)果一致，且呈一定的梯度變化。

實(shí)施例5特異性驗(yàn)證

百合在田間栽培過程中，常因病毒侵染，導(dǎo)致百合葉片過早脫落花芽和花早衰，壽命縮短等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因素。在侵染百合的病毒中，除黃瓜花葉病毒外，還有百合斑駁病毒(lilymottlevirus，lmov)、百合無癥病毒(lilysymptomlessvirus，lsv)等。據(jù)沈淑琳統(tǒng)計(jì)，侵染百合的病毒種類有14種，王繼華統(tǒng)計(jì)有16種。本次為驗(yàn)證該試劑盒的特異性，專門選取常見侵染百合的病毒除黃瓜花葉病毒質(zhì)粒和黃瓜花葉病毒cdna外，共7種病毒進(jìn)行測試，具體包括百合無癥病毒樣品、蠶豆萎蔫病毒樣品、百合x病毒樣品、百合斑駁病毒樣品、南芥菜花葉病毒樣品、蘋果莖溝病毒樣品和水仙花葉病毒樣品。

本實(shí)施例采用含lamp引物的試劑盒進(jìn)行，反應(yīng)體系為：ddh2o7μl，濃度2.5mm的1×dntps3.0μl，10×buffer(含mg²⁺)2.5μl，濃度10μm的fip3.0μl，濃度10μm的引物bip3.0μl，濃度10μm的引物f30.25μl，濃度10μm的引物b30.25μl，濃度5m的甜菜堿4μl，8u/μl的bst酶1μl，逆轉(zhuǎn)錄所得cdna模板1μl。

結(jié)果判定方法參見實(shí)施例2，電泳結(jié)果圖9，顯色結(jié)果圖10，其中，c為cmvcdna，p為cmv質(zhì)粒，n為陰性對照，1為百合無癥病毒樣品、2為蠶豆萎蔫病毒樣品、3為百合x病毒樣品、4為百合斑駁病毒樣品、5為南芥菜花葉病毒樣品、6為蘋果莖溝病毒樣品、7為水仙花葉病毒樣品。

電泳結(jié)果圖9和顯色結(jié)果圖10表明，黃瓜花葉病毒(cmv)和陽性對照質(zhì)粒(p)均顯示為陽性結(jié)果，陰性對照(n)和其他感染百合的病毒樣品均表現(xiàn)為陰性結(jié)果。而且黃瓜花葉病毒的lamp可視化快速檢測與電泳結(jié)果一致。因此本發(fā)明黃瓜花葉病毒的lamp可視化快速檢測試劑盒的特異性好，不會與其他病毒產(chǎn)生交叉感染。同時說明加入熒光染料后，可視化結(jié)果與電泳結(jié)果一致。

實(shí)施例6利用cmv的lamp檢測試劑盒進(jìn)行rt-lamp檢測

黃瓜花葉病毒cmv為rna病毒，在現(xiàn)有技術(shù)中進(jìn)行常規(guī)pcr檢測時，需要先提取總rna，再進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cdna進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

本發(fā)明直接采用樣品中提取的總rna，進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫實(shí)驗(yàn)rt-lamp，將lamp和逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，具體步驟如下：

全部反應(yīng)體系共26.9μl包括：ddh2o0μl，濃度2.5mm的1×dntps3.0μl，10×buffer(含mg²⁺)2.5μl，濃度10μm的fip4.0μl，濃度10μm的引物bip4.0μl，濃度10μm的引物f30.5μl，濃度10μm的引物b30.5μl，濃度5m的甜菜堿3μl，8u/μl的bst酶2.4μl，5mm的dtt1μl，待測樣品rna50ng，濃度為100u/μl的revertraace(toyobo)1μl。

將所有反應(yīng)體系于冰上加入pcr管后，渦旋，混勻，然后立即放入pcr儀。

rt-lamp反應(yīng)程序：65℃59min，80℃3min。

產(chǎn)物用2％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測，觀察是否出現(xiàn)梯狀條帶，若是出現(xiàn)梯狀條帶則證明rt-lamp實(shí)驗(yàn)成功，結(jié)果參見圖11，其中，rna表示黃瓜花葉病毒cmvrna經(jīng)過rt-lamp所得產(chǎn)物，n為陰性對照。

由圖11可見，黃瓜花葉病毒cmv的rna經(jīng)過rt-lamp反應(yīng)后顯示為陽性。由此說明本發(fā)明中rt-lamp方法檢測黃瓜花葉病毒特異性良好。

由于黃瓜花葉病毒本身屬于易降解的rna病毒，易受到空氣或者是實(shí)驗(yàn)器具上rna酶的作用，所以在提取和逆轉(zhuǎn)錄過程中要時時刻刻小心rna酶的污染，給實(shí)驗(yàn)增加了很多繁瑣的步驟，如使用的移液器等器具需用depc-h2o處理，槍頭要多次滅菌等等，即使再小心，也易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

而本發(fā)明則可極大的減輕這些繁瑣的步驟，直接采用樣品中提取的總rna進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫實(shí)驗(yàn)rt-lamp，將lamp和逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，利用逆轉(zhuǎn)錄酶revertraace(toyobo)和bst酶，極大地縮短了反應(yīng)時間，以rna作為模板，既減少了逆轉(zhuǎn)錄的中間過程和人為操作帶來的誤差，又克服了以往lamp易出現(xiàn)的假陽性結(jié)果。