本發(fā)明屬于農(nóng)作物病害預(yù)警檢測、鑒定及防治技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種分子快速檢測的方法與應(yīng)用，具體涉及一種檢測惡疫霉菌的特異性引物、PCR檢測方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

惡疫霉(Phytophthora cactorum Schroet)是世界范圍內(nèi)廣泛分布的重要植物病原菌之一，能侵染約60個(gè)科、50個(gè)屬中的200多種植物，所引起的植物病害分布廣泛，是導(dǎo)致多種經(jīng)濟(jì)作物（如草莓、蘋果、梨和人參等）發(fā)生疫病的重要病原菌，如惡疫霉引起的草莓果腐病，是草莓結(jié)果中后期的一種常見病害，果實(shí)受害率一般在5%-15%，嚴(yán)重的甚至達(dá)到30%以上，對(duì)草莓的產(chǎn)量影響很大。惡疫霉菌通常以菌絲體和卵孢子在病殘?bào)w和土壤中越冬，在條件適宜時(shí)菌絲直接侵染寄主，或形成大量游動(dòng)孢子囊傳播到地上部侵染寄主，其侵染引起的植物疫病是一種世界性分布的土傳毀滅性病害。目前對(duì)該病害還沒有快速有效的防治措施，控制該病的最有效途徑就是加強(qiáng)檢疫，防止病原菌的傳播和阻礙其擴(kuò)散方式。所以建立惡疫霉的快速分子檢測技術(shù)對(duì)于其引起疫病的早期控制具有重要意義。

惡疫霉菌的傳統(tǒng)分類鑒定是采用選擇性培養(yǎng)基從土壤、植物組織或水體中分離菌株，再基于形態(tài)學(xué)特征、致病性測定、生理生化特征等對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，來確定是否存在病原菌，或者用肉眼和借助顯微鏡技術(shù)對(duì)發(fā)病癥狀時(shí)行判定。傳統(tǒng)方法在惡疫霉菌檢測中發(fā)揮了重要作用，但傳統(tǒng)分類鑒定方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力、靈敏度低、易受人為及環(huán)境等諸多因素的干擾，而且要求操作者具備專業(yè)的疫霉菌分離、形態(tài)學(xué)鑒定知識(shí)和豐富的經(jīng)驗(yàn)，最重要一點(diǎn)是不能在病害潛伏期和發(fā)病初期做出診斷，很難對(duì)病害發(fā)生進(jìn)行及時(shí)的監(jiān)測和有效控制。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR技術(shù)為植物病原診斷提供了快速、靈敏、準(zhǔn)確的途徑，應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)病原菌進(jìn)行特異、靈敏的快速分子檢測的成功案例已越來越多。目前，國內(nèi)外研究人員主要利用rDNA/ITS基因、elicitin基因、β-tubulin基因、線粒體Cox1和Cox2編碼基因以及可能編碼儲(chǔ)存蛋白的Lpv基因等作為檢測靶標(biāo)序列，根據(jù)基因序列在不同病原菌種之間的差異位點(diǎn)，設(shè)計(jì)檢測對(duì)象（病原菌）的特異性PCR引物來進(jìn)行快速檢測、鑒定。然而疫霉屬卵菌不同種之間在形態(tài)學(xué)和基因序列上相性以很大，有的分子PCR檢測靶標(biāo)基因序列在疫霉屬的近緣種之間變化很小。例如，從ITS序列上設(shè)計(jì)引物很難將兩個(gè)相似高的疫霉種區(qū)分開。因此要對(duì)疫霉屬病原菌進(jìn)行高靈敏性和特異性檢測，首先應(yīng)篩選出在疫霉菌不同種之間序列差異較大的基因作為檢測靶標(biāo)，然后再進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和檢測。

近期已有研究表明，疫霉屬中的Ypt1基因含有多個(gè)外顯子和內(nèi)含子，外顯子具有保守性，而這些內(nèi)含子在不同種之間具有多變性，非常適合于設(shè)計(jì)引物進(jìn)行疫霉屬卵菌近緣種的特異性分子檢測、鑒定，目前尚無針對(duì)該靶標(biāo)基因設(shè)計(jì)的特異性引物PCR檢測惡疫霉菌的報(bào)道。本發(fā)明以Ypt1基因?yàn)閻阂呙咕鷻z測靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異引物并與PCR技術(shù)相結(jié)合，建立特異性強(qiáng)、靈敏度高、耗時(shí)短的檢測方法。該方法在惡疫霉菌的種類鑒定、監(jiān)測和病害及時(shí)防控等方面具有一定的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種檢測惡疫霉菌的特異性引物、PCR檢測方法及其應(yīng)用，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)惡疫霉菌檢測和鑒定主要基于形態(tài)學(xué)特征，方法耗時(shí)長、程序繁瑣、經(jīng)驗(yàn)性強(qiáng)、準(zhǔn)確度低，難以做到對(duì)病害發(fā)生的及時(shí)監(jiān)測和控制病原菌的傳播、流行的問題，以及現(xiàn)有分子檢測中rDNA-ITS序列差異很小，以ITS為靶標(biāo)設(shè)計(jì)的引物難以將一些近緣種的病原菌區(qū)分開的技術(shù)缺欠，提供了一種檢測惡疫霉菌的特異性引物、PCR檢測方法及其應(yīng)用，本發(fā)明可以直接從發(fā)病的植物組織和帶菌土壤中檢測出惡疫霉菌。本發(fā)明所述的惡疫霉菌快速分子檢測方法可用于惡疫霉菌引起病害的早期診斷及病菌的監(jiān)測和鑒定中，本發(fā)明對(duì)惡疫霉菌檢測可達(dá)到準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)、靈敏度高、易于操作、檢測時(shí)間短且結(jié)果可靠的目的。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明采用下列步驟（技術(shù)方案）予以實(shí)現(xiàn)：

1. 通過測定惡疫霉菌（Phytophthora cactorum）和其它疫霉菌（Phytophthora spp）的Ypt1基因序列，對(duì)疫霉屬不同種間Ypt1基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，設(shè)計(jì)出對(duì)惡疫霉菌具有特異性擴(kuò)增作用的1對(duì)引物，即特異PCR檢測引物的序列為：

上游引物PCAF：5'-AGCAGACGTGGCGTGTTT-3'，

下游引物PCAR：5'-TACACACGTTGGACGCACCT-3'；

對(duì)惡疫霉菌特異性擴(kuò)增出211bp的產(chǎn)物。

2. 惡疫霉菌特異PCR檢測方法的建立，包括以下步驟：

（1）提取待測樣品基因組DNA。

用于檢測病原菌純培養(yǎng)物時(shí)，采用CTAB 法進(jìn)行提取基因組DNA，具體方法如下：取少量菌絲粉于1.5 mL離心管中（菌絲粉剛蓋過半圓形底部為宜），加入900 μL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）提取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90 μL SDS（十二烷基苯磺酸鈉）【注：CTAB，SDS需60℃預(yù)熱】，使用振蕩器振蕩混勻，60℃水浴1h（DNA釋放至緩沖液中），12000 r·min^-1離心15 min；取上清液700 μL，加等體積酚、氯仿、異戊醇（25:24:1），輕輕振蕩混勻，12000 r·min^-1離心9 min；取上清液500 μL，加入等體積氯仿再抽提一次，12000 r·min^-1離心5 min；取上清液350 μL，加入1/10體積3 mol·L^-1 NaAc和2倍體積無水乙醇，-20℃沉淀30 min，12000 r·min^-1離心5 min；棄去上清液，加入700μL 冰70%乙醇進(jìn)行洗滌（稍離心；傾掉上清液），在超凈工作臺(tái)上晾干無酒精味，加入30~60 μL TE（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0） 溶液進(jìn)行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度計(jì)檢測 DNA 濃度并稀釋至100ng/μL待用。

用于檢測植物組織中存在惡疫霉菌時(shí)，采用NaOH快速裂解法提取DNA，具體過程如下：向每毫克植物組織中加入10μL 0.5 mol/L NaOH，在研缽中將組織充分磨碎成糊后轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，12,000 rpm離心6 min，取上清液5 μl加入495μL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）混合均勻，取1.0 μL作為PCR模板進(jìn)行擴(kuò)增；

用于檢測土壤樣品中存在惡疫霉菌時(shí)，采用土壤DNA提取試劑盒，提取DNA。

（2）以步驟（1）提取的DNA為模板，利用PCAF/PCAR這一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25 μL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5μL，10 μmol/L的PCAF/PCAR引物各1.0μL，DNA 模板1.0μL，用無菌超純水補(bǔ)足至25 μL；擴(kuò)增參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

（3）取步驟（2）的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5.0 μL用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，4-5V/cm，電泳40min后經(jīng)溴化乙錠染色于紫外燈下觀察，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的有無及其片段大小對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷，如果能特異性地?cái)U(kuò)增出約211bp的單一條帶，即可判斷所述的檢測樣品中存在惡疫霉菌，否則所述的檢測樣品中未存在該菌。

本發(fā)明與現(xiàn)有的惡疫霉菌鑒定方法相比，具有以下的技術(shù)優(yōu)勢和有益效果：

1.特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高：本發(fā)明是根據(jù)疫霉菌Ypt1基因含有多個(gè)外顯子和內(nèi)含子，且其基因序列保守區(qū)和進(jìn)化區(qū)相互間隔的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了對(duì)惡疫霉菌具有特異擴(kuò)增作用的PCR引物，并已經(jīng)對(duì)不同地理來源的惡疫霉菌和攜帶惡疫霉菌的植物組織和土壤進(jìn)行了測試驗(yàn)證，只有惡疫霉菌和攜帶該病菌的樣品能特異性地?cái)U(kuò)增出一條211bp的電泳條帶，說明本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物具有很強(qiáng)的特異性和準(zhǔn)確性。

2.靈敏度高：病原菌傳統(tǒng)的檢測方法是通過分離、純化和形態(tài)學(xué)鑒定等步驟，這種傳統(tǒng)方法的成功需要發(fā)病組織中積累到足夠量的病原體才能成功。而本發(fā)明將設(shè)計(jì)的特異引物與Ypt1基因通用引物聯(lián)合起來進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增后，對(duì)惡疫霉菌的檢測靈敏度在DNA水平上可達(dá)到10fg，比常規(guī)PCR檢測提高了10000倍，確保了樣品中惡疫霉菌的檢出；

3.實(shí)用性好、應(yīng)用范圍廣：惡疫霉菌的快速檢測、鑒定，具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。傳統(tǒng)的惡疫霉菌的檢測方法一般是在病害出現(xiàn)癥狀后，借助其發(fā)病癥狀，對(duì)病原菌進(jìn)行分離、純化、鑒定等一系列繁瑣的過程，所需時(shí)間較長，給快速而精確地檢測病原物增加了難度，傳統(tǒng)的方法由于不能在病害發(fā)病前期及時(shí)進(jìn)行田間的病原菌動(dòng)態(tài)的監(jiān)測和檢測，時(shí)常給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的防治延誤時(shí)機(jī)。本發(fā)明可對(duì)植株組織及土壤中是否攜帶惡疫霉菌進(jìn)行檢測，如果能特異性地?cái)U(kuò)增出211bp的單一電泳條帶，說明樣品中存在惡疫霉菌，因此本發(fā)明可用于惡疫霉菌引起病害顯癥之前的早期監(jiān)測，可為確定病害防治最佳時(shí)期和防治策略的制定提供科學(xué)依據(jù)，因此本發(fā)明具有較好的實(shí)用性。惡疫霉菌是全世界范圍內(nèi)廣泛分布的重要植物病原菌之一，能侵染約60個(gè)科、50個(gè)屬中的200多種植物，所引起的植物病害分布廣泛，是導(dǎo)致多種經(jīng)濟(jì)作物（如草莓、蘋果、梨和人參等）疫病的主要病原菌。本發(fā)明可在惡疫霉菌引起多種植物病害應(yīng)用，具有廣泛的應(yīng)用范圍；

4.操作簡便、快速：應(yīng)用本發(fā)明方法，對(duì)待測樣品基因組DNA進(jìn)行提取、PCR擴(kuò)增和常規(guī)的瓊脂糖電泳后即可判定結(jié)果，整個(gè)檢測過程操作簡單，無需對(duì)病原菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，大大縮短了檢測時(shí)間。

附圖說明

圖1為利用本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果，圖中：泳道M為2000bp Marker，泳道1-4為惡疫霉菌，泳道5-7分別為辣椒疫霉菌、晚疫病菌和豇豆疫霉菌，泳道8為陰性對(duì)照。

圖2為本發(fā)明引物對(duì)惡疫霉菌的靈敏性檢測擴(kuò)增結(jié)果圖，圖2-a為單重PCR對(duì)惡疫霉菌的靈敏性檢測結(jié)果，圖2-b為巢式PCR對(duì)惡疫霉菌的靈敏性檢測結(jié)果，圖中泳道M為2000bp Marker，泳道1為100 ng，泳道2為10 ng，泳道3為1 ng，泳道4為100 pg，泳道5為10 pg，泳道6為1 pg，泳道7為100 fg，泳道8為10 fg，泳道9為1 fg，泳道10為100ag，泳道11為陰性對(duì)照，泳道12為陽性對(duì)照。

圖3為本發(fā)明檢測方法對(duì)蘋果果實(shí)組織和土壤樣品帶菌檢測結(jié)果電泳圖，圖中泳道M為2000bp Marker，泳道1-2為發(fā)病的蘋果果實(shí)，泳道3-4為攜帶惡疫霉菌的土壤，泳道5-8為健康蘋果果實(shí)，泳道9-10為高壓滅菌土壤，泳道11為陰性對(duì)照，泳道12為陽性對(duì)照。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述， 但不用來限制本發(fā)明的范圍。以下實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，或已發(fā)表相關(guān)文獻(xiàn)中所述的操作技術(shù)規(guī)程，或按照廠商所建議的實(shí)驗(yàn)條件。

實(shí)施例 1：惡疫霉菌特異性檢測引物的設(shè)計(jì)及引物對(duì)惡疫霉菌的特異性驗(yàn)證

1.供試菌株基因組DNA的提取

采用CTAB 法提取惡疫霉菌及其它供試菌株的基因組 DNA，具體方法如下：取少量菌絲粉于1.5 mL離心管中（菌絲粉剛蓋過半圓形底部為宜），加入900 μL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）提取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90 μL SDS（十二烷基苯磺酸鈉）【注：CTAB，SDS需60℃預(yù)熱】，使用振蕩器振蕩混勻，60℃水浴1h（DNA釋放至緩沖液中），12000 r·min^-1離心15 min；取上清液700 μL，加等體積酚、氯仿、異戊醇（25:24:1），輕輕振蕩混勻，12000 r·min^-1離心9 min；取上清液500 μL，加入等體積氯仿再抽提一次，12000 r·min^-1離心5 min；取上清液350 μL，加入1/10體積3 mol·L^-1 NaAc和2倍體積無水乙醇，-20℃沉淀30 min，12000 r·min^-1離心5 min；棄去上清液，加入700μL 冰70%乙醇進(jìn)行洗滌（稍離心；傾掉上清液），在超凈工作臺(tái)上晾干無酒精味，加入30~60 μL TE（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0） 溶液進(jìn)行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度計(jì)檢測 DNA 濃度并稀釋至100 ng/μL待用。

2.檢測靶標(biāo)Ypt1基因擴(kuò)增及測序

利用Ypt1基因通用引物（ph1F：5'-CGACC ATTGGCGTGGACTTT-3'和Yph2R：5'-ACGTTCTCGCAGGCGTATCT-3'）對(duì)供試惡疫霉菌的Ypt1基因進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系25 μL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5μL，10 μmol/L的ph1F / Yph2R引物各1.0μL，DNA 模板1.0μL，用無菌超純水補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性1 min、58℃退火30 S、72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

3.惡疫霉菌特異引物的設(shè)計(jì)

將測序得到的惡疫霉菌（P. cactorum）的Ypt1基因序列與GenBank中疫霉屬18個(gè)不同種的Ypt1基因序列進(jìn)行同源性比較分析，根據(jù)惡疫霉菌與其它種間的差異位點(diǎn)（在BioEdit中比對(duì)），用Primer Primer5軟件設(shè)計(jì)了惡疫霉菌（P. cactorum）的特異性引物，上游引物PCAF：5'-AGCAGACGTGGCGTGTTT-3'，下游引物PCAR：PCAR：5'-TACACACGTTGGACGCACCT-3'，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

4.惡疫霉菌PCR檢測方法的建立及引物特異性PCR驗(yàn)證

在已設(shè)計(jì)特異引物的基礎(chǔ)上，通過PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增參數(shù)的優(yōu)化，建立的惡疫霉菌PCR檢測方法，PCR反應(yīng)體系25 μL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5μL，10 μmol/L的PCAF/PCAR引物各1.0μL，DNA 模板1.0μL，用無菌超純水補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性1 min、60℃退火45S、72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。以供試的惡疫霉菌及其它病原菌的基因組DNA為模板，采用已建立好的惡疫霉菌PCR檢測擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序?qū)阂呙咕铮ㄉ嫌我颬CAF：5'-AGCAGACGTGGCGTGTTT-3'，下游引物PCAR：PCAR：5'-TACACACGTTG- GACGCACCT-3'）的特異性進(jìn)行驗(yàn)證。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖電泳檢測，經(jīng)溴化乙錠染色后于紫外燈下觀察，根據(jù)DNA條帶的有無及大小對(duì)惡疫霉菌引物的特異性進(jìn)行驗(yàn)證。

5.引物特異性驗(yàn)證結(jié)果

PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，引物PCAF/PCAR只能特異性地從供試的惡疫霉菌基因組DNA中擴(kuò)增出大小約為211bp的單一條帶（圖1），而其它病原菌及陰性對(duì)照均無擴(kuò)增條帶。說明該對(duì)引物可以將惡疫霉菌與其它病原菌區(qū)分開來，具有種的特異性，可用于惡疫霉菌快速可靠的檢測和鑒定。

實(shí)施例2：特異引物對(duì)惡疫霉菌基因組DNA的靈敏度檢測

1.常規(guī)PCR擴(kuò)增

用無菌超純水對(duì)惡疫霉菌基因組DNA進(jìn)行稀釋，配制成10倍數(shù)量級(jí)的系列濃度備用。使用本發(fā)明所述引物PCAF/PCAR對(duì)不同系列濃度的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，評(píng)估該引物對(duì)惡疫霉菌基因組DNA檢測的靈敏性，擴(kuò)增反應(yīng)體系和反應(yīng)程序如下：PCR反應(yīng)體系25 μL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5μL，10 μmol/L的PCAF/PCAR引物各1.0μL，DNA 模板1.0μL，用無菌超純水補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性1 min、60℃退火45 S、72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

2.巢式PCR擴(kuò)增

用無菌超純水對(duì)惡疫霉菌基因組DNA進(jìn)行稀釋，配制成10倍數(shù)量級(jí)的系列濃度備用。以Ypt1基因通用引物（ph1F：5'-CGACC ATTGGCGTGGACTTT-3'和Yph2R：5'-ACGTTCTCGCAGGCGTATCT-3'）為外引物，本發(fā)明所述的特異引物PCAF/PCAR為內(nèi)引物對(duì)惡疫霉菌不同系列濃度的基因組DNA進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，評(píng)估本發(fā)明所述引物PCAF/PCAR通過巢式PCR對(duì)惡疫霉菌基因組DNA檢測的靈敏性，第一輪PCR擴(kuò)增：以Ypt1基因通用引物（ph1F：5'-CGACC ATTGGCGTGGACTTT-3'和Yph2R：5'-ACGTTCTCGCAGGCGTATCT-3'）作為第一輪反應(yīng)引物對(duì)不同系列濃度的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系和反應(yīng)程序如下：PCR反應(yīng)體系25 μL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5μL，10 μmol/L的ph1F /Yph2R引物各1.0μL，DNA 模板1.0μL，用無菌超純水補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性1 min、58℃退火30 S、72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。第二輪PCR擴(kuò)增：待第一輪PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取1.0μl 第一輪PCR產(chǎn)物為模板與引物PCAF/PCAR組合進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25 μL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5μL，10 μmol/L的PCAF/PCAR引物各1.0μL，第一輪PCR產(chǎn)物1.0μl，用無菌超純水補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性1 min、60℃退火45 S、72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

常規(guī)PCR和巢式PCR靈敏度比較結(jié)果表明，當(dāng)以本發(fā)明所述引物PCAF/PCAR進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)靈敏度可以達(dá)到100pg DNA 25μl^-1反應(yīng)體系（圖2中的a）。進(jìn)一步以Ypt1基因通用引物ph1F /Yph2R進(jìn)行第一輪擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物作為模板，以PCAF/PCAR作為第二輪擴(kuò)增引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，從電泳圖可以看出套式PCR的特異性擴(kuò)增條帶比常規(guī)PCR要亮得多，能夠使原來看不到條帶的的樣品（10pg、1 pg、100fg、10fg/25μl反應(yīng)體系）產(chǎn)生可見條帶(圖2中的b)，靈敏度達(dá)到10fg DNA 25μl^-1反應(yīng)體系，比常規(guī)PCR要提高10000倍左右。

實(shí)施例3：發(fā)病組織中惡疫霉菌的檢測

蘋果果實(shí)人工接種：將蘋果（品種：紅富士）果實(shí)用70%的乙醇表面消毒，果實(shí)表面用無菌打孔器（Φ5mm）打深約5mm的孔，每孔內(nèi)接種一塊直徑5mm、厚約2mm的惡疫霉菌絲塊，用無菌濕棉團(tuán)覆蓋接種處。接種的果實(shí)置于25℃下保濕，待果實(shí)發(fā)病后，取發(fā)病組織備用。

發(fā)病果實(shí)組織基因組DNA的提?。翰捎肗aOH快速裂解法提取DNA，具體過程如下：向每毫克植物組織中加入10μL 0.5 mol/L NaOH，在研缽中將組織充分磨碎成糊后轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，12,000 rpm離心6 min，取上清液5 μl加入495μL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）混合均勻，取1.0 μL作為PCR模板進(jìn)行擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增檢測：利用本發(fā)明所述引物PCAF/PCAR進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25 μL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5μL，10 μmol/L的PCAF/PCAR引物各1.0μL，DNA 模板1.0μL，用無菌超純水補(bǔ)足至25 μL；擴(kuò)增參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

檢測結(jié)果：取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5.0 μL用1.5%瓊脂糖電泳分離，電壓為4-5V/cm，電泳結(jié)束經(jīng)溴化乙錠染色后于紫外燈下觀察，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的有無及其片段大小對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷，如果能特異性地?cái)U(kuò)增出約211bp的產(chǎn)物，即可判斷發(fā)病組織中帶有惡疫霉菌。檢測結(jié)果（圖3）表明，人工接種發(fā)病的果實(shí)中可檢測出惡疫霉菌，而健康組織及陰性對(duì)照則無特異性條帶出現(xiàn)，說明該套技術(shù)能用于植物組織中惡疫霉菌的快速分子檢測。

實(shí)施例4：土壤中惡疫霉菌的檢測

攜帶惡疫霉菌土壤的制備：將供試的惡疫霉菌菌株培養(yǎng)于黑麥培養(yǎng)基平板上，待菌絲長滿平板后，用適量的無菌水將平板中的菌絲及卵孢子洗下，雙層紗布過濾去除菌絲，得到的濾液為惡疫霉菌卵孢子懸浮液，將卵孢子懸浮液與適量土壤混合，混合后的土壤在室溫下風(fēng)干，得到攜帶惡疫霉菌土壤。

帶菌土壤基因組DNA的提?。翰捎肧igma公司的土壤DNA提取試劑盒（Sigma,DNB100,Soil DNA Isolation Kit）提取土壤中的總DNA，取1.0 μL作為PCR模板進(jìn)行擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增檢測：利用本發(fā)明所述引物PCAF/PCAR進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25 μL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5μL，10 μmol/L的PCAF/PCAR引物各1.0μL，DNA 模板1.0μL，用無菌超純水補(bǔ)足至25 μL；擴(kuò)增參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

檢測結(jié)果：取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5.0 μL用1.5%瓊脂糖電泳分離，電壓為4-5V/cm，電泳結(jié)束經(jīng)溴化乙錠染色后于紫外燈下觀察，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的有無及其片段大小對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷，如果能特異性地?cái)U(kuò)增出約211bp的產(chǎn)物，即可判斷土壤樣品中存在惡疫霉菌。檢測結(jié)果（圖3）表明，攜帶惡疫霉菌的土壤中均可檢測出惡疫霉菌，而高壓滅菌的土壤及陰性對(duì)照則無特異性條帶出現(xiàn)，說明該套技術(shù)能用于土壤中惡疫霉菌的快速分子檢測。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所

<120> 檢測惡疫霉菌的特異性引物及PCR檢測方法和應(yīng)用

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

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<212> DNA

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