本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速構(gòu)建大腸桿菌重組質(zhì)粒的方法。

背景技術(shù)：

基因工程中最基本的技術(shù)之一是構(gòu)建重組質(zhì)粒，需要目的基因整合到載體質(zhì)粒。常規(guī)的重組質(zhì)粒的構(gòu)建大概需要五步：1.目的DNA片段的獲得，2.載體及目的DNA片段的雙酶切，3.載體及目的DNA雙酶切片段的體外連接，4.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，5.重組子的篩選，一般需要3-5天，酶切位點(diǎn)依賴、繁瑣的實(shí)驗(yàn)操作、較低的重組效率極大限制了功能基因組研究的發(fā)展。

伴隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，一種基于λ噬菌體Red重組酶的同源重組系統(tǒng)已應(yīng)用于大腸桿菌基因工程研究。Red同源重組系統(tǒng)由λ噬菌體exo、bet、gam三個(gè)基因組成，它們分別編碼Exo、Beta、Gam三種蛋白質(zhì)。Exo蛋白是一種核酸外切酶，單亞基的分子量為24kD，Exo蛋白的活性形式是一種環(huán)狀三聚物分子，中間有一中空的通道，通道的一端可容納雙鏈DNA分子，另一端只可容納單鏈DNA。Exo蛋白可結(jié)合在雙鏈DNA的末端，從DNA雙鏈的5’端向3’端降解DNA，使DNA分子形成3’粘性末端。Beta蛋白在Red同源重組中起著決定性作用，具有介導(dǎo)互補(bǔ)單鏈DNA退火的功能，是一種退火蛋白，單亞基的分子量為25.8kD。在溶液中，Beta蛋白自發(fā)地形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，緊緊地結(jié)合在單鏈DNA的3’突出端，防止DNA被單鏈核酸酶降解，并介導(dǎo)互補(bǔ)單鏈DNA的退火。雙鏈DNA退火完成后，Beta蛋白從DNA雙鏈上解離下來。Gam蛋白為16kD的多肽分子，可與RecBCD核酸外切酶結(jié)合，抑制其對(duì)外源DNA的降解作用，防止外源DNA進(jìn)入細(xì)胞后被宿主降解。當(dāng)前Red同源重組系統(tǒng)中，帶有同源臂的外源DNA分子可以直接通過同源臂找到同源區(qū)域，然后進(jìn)行DNA的重組。Red重組技術(shù)普遍應(yīng)用于對(duì)細(xì)菌基因組的任意位點(diǎn)進(jìn)行基因敲除或替換的遺傳改造研究中，如利用該技術(shù)可使導(dǎo)入線性目標(biāo)DNA片段與基因組的特定序列進(jìn)行同源重組，靶基因被目標(biāo)基因置換下來，使得細(xì)菌的遺傳性狀得到改變。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于常規(guī)重組質(zhì)粒構(gòu)建的繁瑣和重組酶體外反應(yīng)的價(jià)格昂貴，本發(fā)明的目的是提供一種用于重組質(zhì)粒的構(gòu)建快速、便捷、經(jīng)濟(jì)的方法。

本發(fā)明公開一種基于Red同源重組技術(shù)的快速構(gòu)建大腸桿菌中重組質(zhì)粒的方法，它包括如下步驟：

1)設(shè)計(jì)同源重組引物：

(1)根據(jù)所需要的質(zhì)粒載體，以及目的基因待插入質(zhì)粒的位置，選取適當(dāng)?shù)膯我幌拗菩詢?nèi)切酶位點(diǎn)，用相關(guān)限制性內(nèi)切酶對(duì)載體做單酶切；

(2)從線性載體上的兩端選擇適當(dāng)?shù)拇笮〉男蛄性O(shè)計(jì)同源序列，單側(cè)同源臂長(zhǎng)度約20-100bp；

(3)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增目的DNA片段的引物，在其上游與下游引物的5’端分別加上單側(cè)同源臂序列；

2)制備攜帶pKD46質(zhì)粒的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞：

(1)將pKD46質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，獲得含有pKD46質(zhì)粒的大腸桿菌菌株；

(2)利用L-阿拉伯糖誘導(dǎo)其產(chǎn)生Red重組酶，并將其制備成感受態(tài)細(xì)胞；

3)共轉(zhuǎn)化：將帶有與質(zhì)粒同源區(qū)段的外源DNA片段與線性載體按分子數(shù)之比在5:1-10:1范圍內(nèi)混合，加入到已表達(dá)Red重組酶的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，輕輕吹打混勻，冰浴20-30min，42℃熱擊90s，熱擊后迅速放入冰中，冰浴5-10min，加入適量LB或SOB混勻，30℃搖床復(fù)蘇45-60min，離心后，涂布到相應(yīng)抗性的固體LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜；

4)提取重組質(zhì)粒；

5)鑒定:將提取出的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定、酶切鑒定；

6)將含陽性重組質(zhì)粒的菌株保菌，-70℃凍存。

RED重組系統(tǒng)中使用外源DNA片段構(gòu)建重組質(zhì)粒的原理示意圖如圖1。

優(yōu)選的，所述的攜帶pKD46質(zhì)粒的大腸桿菌是BJ5183，XL2-Blue,DH5α。

本發(fā)明利用pKD46質(zhì)粒在L-阿拉伯糖誘導(dǎo)下穩(wěn)定地表達(dá)Red重組酶，構(gòu)建出含有Red重組系統(tǒng)的大腸桿菌菌株，重組酶能促進(jìn)外源DNA片段兩端所攜帶的與質(zhì)粒同源的區(qū)段和線性質(zhì)粒完成重組，首次實(shí)現(xiàn)了利用RED的重組技術(shù)將外源DNA片段插入到載體的單一限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，在37℃培養(yǎng)下可以消除該質(zhì)粒，不會(huì)對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生干擾。大大簡(jiǎn)化了重組質(zhì)粒的構(gòu)建步驟，縮短了時(shí)間，此過程僅需一天，傳統(tǒng)方法需要2-3天。產(chǎn)生的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR與酶切鑒定后陽性克隆效率較高，可以成為一種構(gòu)建重組質(zhì)粒的新手段。

附圖說明

圖1為RED重組系統(tǒng)中使用外源DNA片段構(gòu)建重組質(zhì)粒的原理示意圖。

圖2為實(shí)驗(yàn)組1重組質(zhì)粒PCR鑒定的電泳圖

目的條帶大小約810bp。M為DL2000；1為陽性對(duì)照；2、3、4、5、6為重組質(zhì)粒；7為陰性對(duì)照。

圖3為實(shí)驗(yàn)組2重組質(zhì)粒PCR鑒定的電泳圖

目的條帶大小約800bp。M為DL2000；1為陽性對(duì)照；2、3、4、5、6為重組質(zhì)粒；7為陰性對(duì)照。

圖4為實(shí)驗(yàn)組1重組質(zhì)粒Kpn I&Xho I酶切鑒定的電泳圖

目的條帶大小約770bp，載體大小約5880bp。M為DL2000；1為pET-41a質(zhì)粒酶切產(chǎn)物；2、3、4、5、6為重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物。

圖5為實(shí)驗(yàn)組2重組質(zhì)粒Kpn I&Xho I酶切鑒定的電泳圖

目的條帶大小約770bp,載體大小約5880bp。M為DL2000；1為pET-41a質(zhì)粒酶切產(chǎn)物；2、3、4、5、6為重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物。

圖6為實(shí)驗(yàn)組1重組質(zhì)粒BamH I&Hind III酶切鑒定的電泳圖

目的條帶大小約840bp,載體大小約5810bp。M為DL2000；6為pET-41a質(zhì)粒酶切產(chǎn)物；1、2、3、4、5為重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物。

圖7為實(shí)驗(yàn)組2重組質(zhì)粒BamH I&Hind III酶切鑒定的電泳圖

目的條帶大小約840bp,載體大小約5810bp。M為DL2000；1為pET-41a質(zhì)粒酶切產(chǎn)物；2、3、4、5、6為重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

一、同源重組引物的設(shè)計(jì)

(1)以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因?yàn)樵O(shè)計(jì)對(duì)象；pET-41a為重組載體，將其用EcoR I線性化，設(shè)計(jì)出的單側(cè)同源區(qū)長(zhǎng)度為45bp的上游引物是：

下游引物是：

單側(cè)同源區(qū)長(zhǎng)度為35bp的上游引物是：

下游序列是：

斜體下劃線部分為pET-41a載體上EcoR I位點(diǎn)兩端(包括EcoR I酶切位點(diǎn)序列)的序列(用來與線性的pET-41a進(jìn)行同源重組)，其余為擴(kuò)增EGFP基因的序列。

二、攜帶pKD46質(zhì)粒的BJ5183感受態(tài)細(xì)菌的制備

(1)從平板挑取用普通轉(zhuǎn)化方法獲得的攜帶pKD46質(zhì)粒的BJ5183菌株單菌落接種到4mL含有Amp(終濃度25-50μg/mL)的SOB培養(yǎng)基中，30℃、220rpm，振蕩培養(yǎng)過夜。

(2)取1mL(接種量1％～2％)培養(yǎng)物接種到裝100mL含有Amp(終濃度25-50μg/mL)SOB培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，30℃、220rpm，先振蕩培養(yǎng)1h，然后加入L-阿拉伯糖(終濃度0.2％)誘導(dǎo)培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.4～0.5。

(3)在已滅菌的超凈臺(tái)中將培養(yǎng)好的菌液轉(zhuǎn)移到2個(gè)已滅菌的50mL離心管中，冰浴30min。

(4)2℃、1000g離心5min。在超凈臺(tái)中棄去上清液，倒置在濾紙上使液體盡可能流盡。

(5)先分別用2mL冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液懸浮菌體(菌體朝上用手輕輕拍打混勻至菌液呈云霧狀)，再加CaCl₂溶液至30mL混勻，冰浴20min。

(6)2℃、1000g離心5min。在超凈臺(tái)中棄去上清液，倒置在濾紙上使液體盡可能流盡。

(7)重復(fù)步驟(4)、(5)和(6)三次。

(8)先分別用0.5mL冷的甘油CaCl₂溶液(0.1mol/L CaCl₂+15％甘油)懸浮菌體(菌體朝上用手輕輕拍打混勻至菌液呈云霧狀)，再加甘油CaCl₂溶液至2mL混勻，分裝至已滅菌的1.5mL EP管中(每管100μL)。-70℃條件下可以長(zhǎng)期保存使用。

三、含有EGFP基因重組序列的獲得

以pEGFP-N1為模板；PCR所用的上下游引物有兩組，一組是單側(cè)同源區(qū)長(zhǎng)度為45bp的引物，另一組是單側(cè)同源區(qū)長(zhǎng)度為35bp的引物；PCR所用的酶為TaKaRa公司的Premix LA Taq Version 2.0。

(1)向已滅菌的微量離心管中，依次加如下組分：Premix LA Taq 12.5μL、Sense primer(10μM)1μ、Anti-sense primer(10μM)1μL、pEGFP-N1(100ng/μL)1μL、ddH₂O 9.5μL。

混勻后，在PCR儀上進(jìn)行第一輪擴(kuò)增。反應(yīng)程序：PCR循環(huán)條件如下：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，退火58℃30s，延伸72℃1min，35次循環(huán)，72℃延伸10min。

(2)用DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，得到目的DNA片段。

四、pET-41a載體的線性化

(1)用EcoR I單酶切pET-41a載體，向已滅菌的微量離心管中，依次加如下組分：pET-41a 5-10μg、10×H Buffer 5μL、EcoRI(15U/μL)0.5μL、ddH₂O至50μL。

(2)37℃水浴4小時(shí)。

(3)酶切結(jié)束后，用普通瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，然后切取目標(biāo)條帶使用DNA凝膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物。

五、線性化pET-41a和目的DNA片段共轉(zhuǎn)化

(1)實(shí)驗(yàn)組1為取200ng線性化pET-41a載體和200-300ng同源區(qū)段為45bp目的DNA片段的混合物；實(shí)驗(yàn)組2為取200ng線性化pET-41a載體和200-300ng同源區(qū)段為35bp目的DNA片段的混合物；對(duì)照組為取200ng線性化pET-41a載體，分別轉(zhuǎn)化于100μL上述制備的表達(dá)出Red重組酶的BJ5183感受態(tài)中。冰浴30min。

(2)42℃保溫90s進(jìn)行熱擊。熱擊后迅速放入冰中，冰浴10min。

(3)加入900μL SOB培養(yǎng)基混勻后，30℃振蕩(搖床轉(zhuǎn)速不超過150rpm)培養(yǎng)60min，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素基因。

(4)室溫下5000rpm離心3min。用移液槍小心吸去800μL上清液。

(5)再將剩余菌液混勻后在含Kan(終濃度25μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基的平板上全部涂布，靜置1～2min。在37℃的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜(一般要培養(yǎng)16h)，可以去除pKD46質(zhì)粒。

(6)培養(yǎng)完成，對(duì)照組所在平板不長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組所在平板長(zhǎng)出單菌落，從平板上挑單菌落提質(zhì)粒鑒定。

六、重組質(zhì)粒的提取

(1)隨機(jī)挑取平板上若干個(gè)單菌落接種到5mL含Kan(終濃度25μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。

(2)將搖混濁的菌液在已滅菌的超凈臺(tái)中首先進(jìn)行保菌，取600μL菌液于已滅菌的1.5mL EP管中加入400μL已滅菌的50％甘油，-70℃冰箱凍存，剩余菌液用普通小提質(zhì)粒試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取。

七、PCR鑒定

(1)以pEGFP-N1做模板為陽性對(duì)照，以ddH2O做模板為陰性對(duì)照，引物用擴(kuò)增目的基因的各自引物，將提取出的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定。

向已滅菌的微量離心管中，依次加如下組分：dNTP(2.5mM each)2μL、Sense primer(10μM)0.5μL、Anti-sense primer(10μM)0.5μL、10×PCR Buffer 2.5μL、rTaq(5U/μL)0.2μL、模板1μL、ddH₂O 18.3μL?；靹蚝?，在PCR儀上進(jìn)行第一輪擴(kuò)增。反應(yīng)程序：PCR循環(huán)條件如下：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，退火58℃30s，延伸72℃1min，30次循環(huán)，72℃延伸10min。(2)PCR產(chǎn)物通過普通瓊脂糖凝膠電泳鑒定(如圖2和圖3。圖2為實(shí)驗(yàn)組1，圖3為實(shí)驗(yàn)組2。)。

八、酶切鑒定

(1)將PCR鑒定出的陽性重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中提質(zhì)粒做酶切鑒定。

(2)采用Kpn I&Xho I和BamH I&Hind III分別作為雙酶切鑒定用的限制性內(nèi)切酶，前者在所設(shè)計(jì)的重組序列內(nèi)，即線性pET-41a與目的DNA片段上都有，后者在重組序列外，即僅線性pET-41a上有。以pET-41a為陰性對(duì)照，將提取出的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。

(3)向已經(jīng)滅菌的PCR管①中，依次加入如下組分：重組質(zhì)粒1-3μg、10×M Buffer 2μL、Kpn I(10U/μL)0.2μL、Xho I(10U/μL)0.2μL、ddH₂O至20μL。向已經(jīng)滅菌的PCR管②中，依次加入如下組分：重組質(zhì)粒1-3μg、10×K Buffer 2μL、BamH I(15/μL)0.2μL、Hind III(15U/μL)0.2μL、ddH₂O至20μL。

(4)37℃水浴2小時(shí)。酶切結(jié)束后，用普通瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳(如圖4和圖5為Kpn I&Xho I雙酶切結(jié)果，圖4為實(shí)驗(yàn)組1，圖5為實(shí)驗(yàn)組2。圖6和圖7為BamH I&Hind III雙酶切結(jié)果，圖6為實(shí)驗(yàn)組1，圖7為實(shí)驗(yàn)組2。)。

(5)將含陽性重組質(zhì)粒的菌株保菌，-70℃凍存。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 武漢生物工程學(xué)院

<120> 一種快速構(gòu)建重組質(zhì)粒的方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 67

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> APM1FA(sense)

<400> 1

ccggtgatga cgacgacaag agtcccatgg gatatcgggg atccgaatta tggtgagcaa 60

gggcgag 67

<210> 2

<211> 67

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> APM1FS(antisense)

<400> 2

gcaagcttgt cgacggagct cgcctgcagg cgcgccaagg cctgtacagt tacttgtaca 60

gctcgtc 67

<210> 3

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> BRA2FS(sense)

<400> 3

cgacgacaag agtcccatgg gatatcgggg atccgaatta tggtgagcaa gggcgag 57

<210> 4

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> BRA2FA(antisense)

<400> 4

cgacggagct cgcctgcagg cgcgccaagg cctgtacagt tacttgtaca gctcgtc 57