本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種方格星蟲纖溶酶cDNA基因以及方格星蟲重組纖溶酶及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

血栓栓塞性疾病是一種常見的心腦血管疾病，常表現(xiàn)為心肌梗死、缺血性腦梗死、靜脈血栓栓塞等。隨著人民生活水平的提高和人口老齡化的到來，心腦血管疾病已取代癌癥成為我國(guó)第一大致死病因。目前臨床應(yīng)用溶栓藥物降低血栓病患者的死亡率和致殘率，但現(xiàn)有溶栓藥還存在半衰期短、易出血及再栓塞等缺點(diǎn)。從生物中尋找溶栓藥物的基因，開發(fā)新型的溶栓物質(zhì)來治療血栓性疾病是治療心腦血管疾病的研究方向之一。

方格星蟲(Sipunculus nudus)俗稱沙蟲，隸屬于星蟲動(dòng)物門、星蟲綱、方格星蟲屬。方格星蟲是我國(guó)星蟲中種群數(shù)量較大的一個(gè)種，分布于我國(guó)東南沿海，廣布于廣西、廣東、海南島、福建和浙江，棲息于潮間帶、高潮區(qū)的泥灘內(nèi)，營(yíng)底棲穴居生活。方格星蟲主要供人食用，廣西北海的“沙蟲干”是當(dāng)?shù)赜忻奶禺a(chǎn)，其肉質(zhì)鮮美，國(guó)內(nèi)主要是對(duì)方格星蟲的營(yíng)養(yǎng)成分及增養(yǎng)殖方面進(jìn)行研究。方格星蟲以海洋中微藻和動(dòng)植物碎片為食料，內(nèi)臟存在有多種纖溶酶。

目前，報(bào)道過方格星蟲纖溶酶的相關(guān)專利有以下幾篇：申請(qǐng)?zhí)枺?01010210919.5，方格星蟲纖溶酶及其制備方法，該專利公開的是從方格星蟲提取纖溶酶，分子量在27000～35000之間；申請(qǐng)?zhí)枺?01310142498.0，一種小分子量方格星蟲纖溶酶及其制備方法與應(yīng)用，該專利公開的是從方格星蟲中提取纖溶酶的分子量為24917Da；申請(qǐng)?zhí)枺?01310170384.7，海洋方格星蟲纖溶酶及其制備和應(yīng)用，該專利公開的從方格星蟲消化腺體分離提取分子量15KDa的纖溶酶。上述公開的專利報(bào)道均是從自然界的方格星蟲中提取纖溶酶，因此受到原料供應(yīng)的限制，導(dǎo)致不能大批量生產(chǎn)，制備過程具有局限性。

因此，急需一種通過基因工程的手段將溶血栓基因轉(zhuǎn)入工程菌株中表達(dá)，研發(fā)出效果更好，副作用更低，更安全溶栓藥物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供了一種方格星蟲纖溶酶cDNA基因及重組纖溶酶；通過基因工程方法將纖溶酶基因轉(zhuǎn)入基因工程菌株進(jìn)行表達(dá)，能達(dá)到藥物不受限制的進(jìn)行制備生產(chǎn)。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：提供一種方格星蟲纖溶酶cDNA基因，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，及具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

通過酵母蛋白表達(dá)系統(tǒng)所述方格星蟲纖溶酶基因進(jìn)行重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，得到方格星蟲重組纖溶酶，具體制備過程如下：

(1)方格星蟲纖溶酶cDNA序列的克隆：

根據(jù)絲氨酸胰蛋白酶家族高度保守序列設(shè)計(jì)兼并引物，以海南儋州沿海方格星蟲(S.nudus)消化道m(xù)RNA為模板，利用3’RACE和5’RACE技術(shù)擴(kuò)增出方格星蟲纖溶酶cDNA序列全長(zhǎng)，連接TA克隆載體，轉(zhuǎn)化E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞。

(2)畢赤酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化表達(dá)

構(gòu)建酵母細(xì)胞pGAPZaA表達(dá)載體，選用EcoRI，Xbal內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)連接方格星蟲纖溶酶cDNA基因，T4連接酶連接基因與載體，內(nèi)切酶AvrII將載體線性化后電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行分泌表達(dá)。

(3)方格星蟲重組纖溶酶純化與酶活

用Ni柱純化方格星蟲重組纖溶酶，纖維蛋白平板檢測(cè)重組纖溶酶酶活，與尿激酶相比，方格星蟲重組纖溶酶酶比活力為75083IU/mg蛋白。SDS-PAGE檢測(cè)分子量在29-44kDa之間。

所述方格星蟲重組纖溶酶用于血栓性疾病治療以及制備溶栓藥物。

本發(fā)明根據(jù)NCBI上報(bào)道的多種纖溶酶基因保守位點(diǎn)設(shè)計(jì)兼并引物，從方格星蟲內(nèi)臟mRNA中擴(kuò)增出部分纖溶酶cDNA基因，利用5’RACE和3’RACE技術(shù)獲得該基因全長(zhǎng)，并將該cDNA基因在畢赤酵母中獲得表達(dá)，獲得具有溶栓活性的重組方格星蟲纖溶酶，可作為新型基因工程藥物。

附圖說明

圖1是本發(fā)明中方格星蟲纖溶酶cDNA基因PCR瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖2是本發(fā)明中方格星蟲重組纖溶酶在纖維平板法上纖溶活性示意圖。

圖3是本發(fā)明中方格星蟲重組纖溶酶在熱處理纖維平板法上纖溶活性示意圖。A為85℃熱處理30min滅活纖維蛋白酶原的平板，B為未熱處理平板。

圖4是本發(fā)明中方格星蟲重組纖溶酶SDS-PAGE圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例一

方格星蟲纖溶酶全長(zhǎng)cDNA基因的克隆

實(shí)驗(yàn)材料：方格星蟲，來自海南儋州海邊；

試劑：Trizol試劑(Invtrogen)，RACE 5’/3’Kit，T-Vector pMD19，MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0，MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0，Premix Taq^TM，E.coli DH5a Competent Cells，DL2000Marker(TAKARA)，引物合成及基因測(cè)序(生工生物工程有限公司，深圳華大基因科技服務(wù)有限公司)。

具體的實(shí)施方法如下：

(1)方格星蟲纖溶酶基因中間保守片段核苷酸序列的獲得

通過NCBI查找絲氨酸胰蛋白酶家族纖溶酶基因，查找保守序列設(shè)計(jì)兼并引物。

上游引物ER：'5’-aac agg gtc ctg tgc gcn gcn cay tg 3’，(簡(jiǎn)并度為32，Tm＝60.9)

下游引物BF：'5’-ggg ccg ccg gag tcn ccr ttr ca 3’，(簡(jiǎn)并度為16，Tm＝62.5)

方格星蟲纖溶酶第一條鏈cDNA合成：方格星蟲放入海水中暫養(yǎng)24h，排盡消化道泥沙，解剖蟲體取黃色腸道組織用滅菌濾紙吸去溶液，液氮研磨成粉狀，TRIzol法提取總RNA，-70℃冰箱保存。用RACE 5’/3’Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，冰浴中加入5ul總RNA，1ul 5’/3’CDS Primer A，4ul 5×First-Stand Buffer，0.5uL DTT(100mM)，1.0ul dNTPs(20mM)，0.5ul RNase Inhibitior(40u/ul)，2.0ul SMARTScribe Reverse Transcriptase(100U)，用ddH₂O補(bǔ)至20ul，混勻，短暫離心后將PCR管置于PCR儀中，42℃孵育90min，70℃10min，10uL TE稀釋，獲得5’/3’cDNA第一鏈，-20℃保存。

克隆方格星蟲纖溶酶基因：冰浴中加入12.5ul 2×Premix Taq^TM，引物ER、BF各1ul，1ul 3’RACE cDNA第一鏈產(chǎn)物，ddH₂O 10ul混勻，按以下程序進(jìn)行反應(yīng)：預(yù)變性，94℃，3min，(變性94℃，30S，退火55℃-45℃，30S，延伸72℃，30S)20個(gè)循環(huán)，延伸72℃，7min，4℃終止反應(yīng)，PCR產(chǎn)物1％瓊脂糖凝膠電泳。采用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0進(jìn)行PCR產(chǎn)物凝膠回收。

重組克隆載體轉(zhuǎn)化：取感受態(tài)細(xì)胞DH5a置于冰浴融化，分別向感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入10ul pMD19T重組克隆載體和目的基因PCR產(chǎn)物，混勻，冰浴中靜置30min，42℃熱激90s，迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中靜置2-3min，加入900ul SOC液體培養(yǎng)基，37℃，150rpm振蕩培養(yǎng)45min，吸取菌液100ul到LB(Amp⁺)固體瓊脂培養(yǎng)基平板上，涂板，倒置37℃培養(yǎng)12-16h。在長(zhǎng)滿菌落的平板上隨機(jī)挑取10個(gè)單克隆，分別溶解到10ul ddH₂O中，吸取5ul稀釋菌液至干凈的200ul PCR管中，99℃熱處理5min，冰浴中加入15ul 2×Premix Taq^TM，1ul上游引物ER，1ul下游引物BF，1ul熱處理后的菌液，ddH₂O補(bǔ)至25ul，混勻，短暫離心后按以下程序進(jìn)行PCR反應(yīng)，1％糖凝膠上電泳，將陽性克隆對(duì)應(yīng)的單菌落加入到3ml LB(Amp+)液體培養(yǎng)基中，37℃，振蕩培養(yǎng)過夜，送樣測(cè)序。

(2)方格星蟲纖溶酶cDNA序列3’末端擴(kuò)增

根據(jù)測(cè)序成功的纖溶酶特異性片段序列設(shè)計(jì)引物，如下

引物名稱 引物序列

3’RACE GSP1primer：5’AAGGGTTGGGTTCCGTGTCCGTGCTG3’

PCR：冰浴中加入2.5ul 3’RACE cDNA，5ul 10*UPM，1uL3’RACE GSP1primer，15.5uL ddH₂O，25ul SeqAmp Buffer，1.0uL SeqAmp DNA Polymerase混勻，短暫離心后按以下程序進(jìn)行PCR反應(yīng)：預(yù)變性，(變性94℃,30S，退火72℃3min)5個(gè)循環(huán)，(變性94℃，30s，退火70℃，30S，延伸72℃，3min)5個(gè)循環(huán)，(變性94℃，30s，退火68℃，30S，延伸72℃，3min)25個(gè)循環(huán)，終止4℃。吸取5ul PCR反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，3’RACE產(chǎn)物純化后克隆測(cè)序。

(3)方格星蟲纖溶酶cDNA序列5'端擴(kuò)增

根據(jù)測(cè)序的3’RACE纖溶酶特異性片段序列設(shè)計(jì)引物，如下

引物名稱 引物序列

5’RACE GSP1primer：5’AAATGTAGGCAGTGTTTCCAGCGTAG3’

PCR：冰浴中加入2.5ul 5’RACE cDNA，5ul 10*UPM，1uL 5’RACE GSP1primer，15.5uL ddH₂O，25ul SeqAmp Buffer，1.0uL SeqAmp DNA Polymerase混勻，短暫離心后按以下程序進(jìn)行PCR反應(yīng)：預(yù)變性，(變性94℃，30S，退火72℃，3min)5個(gè)循環(huán)，(變性94℃，30s，退火70℃，30S，延伸72℃，3min)5個(gè)循環(huán)，(變性94℃，30s，退火68℃，30S，延伸72℃，3min)25個(gè)循環(huán)，終止4℃。吸取5ul PCR反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，5’RACE產(chǎn)物純化后克隆測(cè)序。

(4)方格星蟲纖溶酶序列拼接及全長(zhǎng)基因克隆

將方格星蟲纖溶酶基因3’RACE產(chǎn)物、5’RACE產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果拼接得到纖溶酶全長(zhǎng)基因如SEQ ID NO:1所示，根據(jù)拼接全長(zhǎng)基因序列設(shè)計(jì)引物，如下

引物名稱 引物序列

St primer：5’ATGGGGACGTCACACCGGACTCGACC 3’

Ed primer：5’GAAACAGTTTATTGTTAGCAGACCAG 3’

以5’RACE cDNA為模板，PCR擴(kuò)增cDNA全長(zhǎng)。冰浴中加入12.5ul2×Premix Taq^TM，引物St、Ed各1ul，1ul 5’RACE cDNA第一鏈產(chǎn)物，ddH₂O 10ul混勻，按以下程序進(jìn)行反應(yīng)：預(yù)變性，94℃，3min，(變性94℃，30S，退火70℃-62℃，30S，延伸72℃，30S)30個(gè)循環(huán)，延伸72℃，7min，4℃終止反應(yīng)，PCR產(chǎn)物1％瓊脂糖凝膠電泳，如圖1所示凝膠電泳圖。PCR產(chǎn)物膠回收后連接19T載體轉(zhuǎn)入DH5a，測(cè)序驗(yàn)證。

實(shí)施例二

方格星蟲纖溶酶基因真核表達(dá)

實(shí)驗(yàn)材料：pGAPZaA載體，畢赤酵母GS115(Invtrogen)；BTX ECM830Electroporation System；

試劑：ECORI，QuickCut^TMXba I，Premixed Protein Marker Low，DL5000Marker，DL2000Marker(TAKARA)，AvrII(NOVA)，BCA Protein Assay Kit(康為世紀(jì))。

(1)目的片段擴(kuò)增：

根據(jù)pGAPZaA載體圖譜，在目的基因兩端加上ECORI和Xba I的限制酶位點(diǎn)(下劃線)，設(shè)計(jì)引物如下：

引物名稱 引物序列

EC primer：5’CCGGAATTCATGGGGACGTCACACCGGACT 3’

XB primer：5’TGCTCTAGAGTTGGAGTCAATCCAGCTACG 3’

冰浴上依次加cDNA全長(zhǎng)基因片段1ul，EC、XB引物各1uL，2×Premix Taq^TM25uL，滅菌水22uL于PE管中混勻，進(jìn)行PCR反應(yīng)：預(yù)變性，94℃，3min，(變性94℃，30s，退火56℃，30S，延伸72℃，30S)30個(gè)循環(huán)，延伸72℃，7min，終止4℃，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物純化克隆測(cè)序。

(2)基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建：

冰上依次將10×buffer，pGAPZaA載體/目的基因純化片段，雙切酶ECORI，Xbal，去離子水加至PE管中，37℃水浴30分鐘，進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，利用瓊脂糖膠回收試劑盒對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化。雙酶切的pGAPZaA載體和目的基因片段、T4連接酶、buffer、去離子水于管混勻22℃孵育1h，并立即轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，測(cè)序并保存菌種，命名為菌D-GEXB。提取D-GEXB質(zhì)粒，AvrII酶37℃30min酶切質(zhì)粒。

(3)電轉(zhuǎn)畢赤酵母：

將酶切線性化質(zhì)粒與畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞混勻，轉(zhuǎn)至的預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中，1mm電轉(zhuǎn)化杯冰浴，電壓600V，電擊時(shí)間5ms，加入冰預(yù)冷的山梨醇溶液，轉(zhuǎn)至離心管中30℃，培養(yǎng)約待菌體液完全吸收后，將平板在30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，直到有單菌落出現(xiàn)，挑取單菌落，載體引物PCR檢驗(yàn)。

(4)畢赤酵母陽性重組子篩選：

陽性轉(zhuǎn)化子劃于MD平板，30℃培養(yǎng)2d，挑取平板中生長(zhǎng)較好，分別點(diǎn)在含500，1000，2000ug/mLZeocin的YPD固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3d，選取在高濃度Zeocin平板上生長(zhǎng)良好的菌株加入YPD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。

實(shí)施例三

方格星蟲重組纖溶酶純化及活性初步鑒定

試劑：牛纖維蛋白原，凝血酶，尿激酶(Sigma分裝)，Zeocin(Invtrogen)，咪唑，Ni-NTA-Agarose(QIAGEN)，考馬斯亮藍(lán)R-250，SDS，YPD，BMMY，BMGY，冰醋酸為國(guó)產(chǎn)分析純。

(1)方格星蟲重組纖溶酶利用纖維平板法進(jìn)行纖溶活性實(shí)驗(yàn)

分別在0，24h，48h，72h，96h，120h提取BMMY液體培養(yǎng)基的重組工程菌發(fā)酵菌液上清，等體積丙酮沉淀蛋白后以滅菌水溶解，進(jìn)行纖維蛋白平板活性測(cè)試。從纖維蛋白平板活性結(jié)果判定目的蛋白的表達(dá)量在48h達(dá)到高峰。以1000U尿激酶為對(duì)照，重組蛋白的比活性為75083IU/mg蛋白。在85℃處理30min的纖維蛋白平板上，方格星蟲重組纖溶酶仍然有溶解纖維蛋白的作用，尿激酶則無效，表明方格星蟲重組纖溶酶具有直接溶解纖維蛋白的能力，如圖2所示為方格星蟲重組纖溶酶在纖維平板法上纖溶活性示意圖。如圖3所示為方格星蟲重組纖溶酶在熱處理纖維平板法上纖溶活性示意圖。A為85℃熱處理30min滅活纖維蛋白酶原的平板，B為未熱處理平板。

(2)SDS-PAGE電泳檢測(cè)

配制12％分離膠和5％濃縮膠，取不同時(shí)間的重組工程菌發(fā)酵菌液蛋白10uL，加入6×SDS-PAGE loading buffer，100℃沸水煮5min，冷卻后上樣，電壓80V樣品進(jìn)入濃縮膠與分離膠的界面，電壓升高至100V，待溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部，關(guān)閉電源，考馬斯亮藍(lán)R-250染色，脫色搖床上脫色30min，取出后檢測(cè)拍照。所述方格星蟲重組纖溶酶SDS-PAGE電泳圖譜相對(duì)分子質(zhì)量為29kDa-44kDa之間。如圖4所示為方格星蟲重組纖溶酶SDS-PAGE圖。

(3)方格星蟲重組纖溶酶純化

經(jīng)Ni-NTA-Agarose純化重組纖溶酶，緩沖液平衡鎳柱后將20ml蛋白上樣，再用緩沖液洗柱后，分別用20mM、50mM、100mM、200mM和400mM咪唑緩沖液進(jìn)行階段洗脫，收集各階段洗脫峰，纖維蛋白平板檢測(cè)峰活性，活性峰主要分布在50-100mM洗脫階段。

(4)方格星蟲纖溶酶溶血塊實(shí)驗(yàn)

將方格星蟲重組纖溶酶用生理鹽水配制成1000ug/mL，取200uL作用在1.00g小鼠全血凝血塊，24h溶解率達(dá)84.12％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明方格星蟲重組纖溶酶具有直接溶解血塊中纖維蛋白的能力。

以上所揭露的僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，當(dāng)然不能以此來限定本發(fā)明之權(quán)利范圍，因此依本發(fā)明權(quán)利要求所作的等同變化，仍屬于本發(fā)明所涵蓋的范圍。

序列表

<110> 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯?shí)驗(yàn)站

<120> 一種方格星蟲纖溶酶cDNA基因、重組纖溶酶及其應(yīng)用

<130> 2016

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 834

<212> DNA

<213> 方格星蟲（Sipunculus nudus）

<400> 1

atggggacgt cacaccggac tcgacctgct agaaacatgt ggacgatact ggctctctgc 60

gtcttggctg tcgttgaagc acgccctcgc gctgagttct acgcgagctt tagctttcca 120

aagattgttg ggggctctcc tgcttcaaaa ggtgacttcc cgcaccagtt gtcgctccag 180

catgatagtg gaggatggta ccacacctgc ggcgccagcc ttctcagctc caggaaagct 240

ctcacagccg ctcattgtac gcagggaaga tttggtttcc gtgtgcgtgc tggagccact 300

aggctgagtc catctgatca cgagggggag gcaatggtgg gcgggatagt tgagcatcca 360

ggttacgact caggggcgtc aggcatcccc aatgacgtcg ccactcttca tctttcttca 420

tcaatcaatt caggaggagc cattggttac gcatccttgc catcctctag cgccggaagt 480

ttcgctggaa atgctgtcta tatttccggt tggggtaaaa cagacggatc ggctgacggc 540

ggctcgaatg tgttgaacca agtacggaca actgttatct ctgagagtga ctgcaggaac 600

agaatgcctg gaaccctcgg cagtggtatc tctgctatgc atatctgtat tttctccgga 660

aacagcggct cctgtcaggg tgactctggt ggcccgatga cccatgcctc caacggattg 720

atgatcggtg tgacctcctg gggtgttgga aacattttcg tcagctgttt gacagaatac 780

ccctctgtat acgctcgtgt cagttacttc cgtagctgga ttgactccaa ctaa 834

<210> 2

<211> 277

<212> PRT

<213> 方格星蟲（Sipunculus nudus）

<400> 2

Met Gly Thr Ser His Arg Thr Arg Pro Ala Arg Asn Met Trp Thr Ile

1 5 10 15

Leu Ala Leu Cys Val Leu Ala Val Val Glu Ala Arg Pro Arg Ala Glu

20 25 30

Phe Tyr Ala Ser Phe Ser Phe Pro Lys Ile Val Gly Gly Ser Pro Ala

35 40 45

Ser Lys Gly Asp Phe Pro His Gln Leu Ser Leu Gln His Asp Ser Gly

50 55 60

Gly Trp Tyr His Thr Cys Gly Ala Ser Leu Leu Ser Ser Arg Lys Ala

65 70 75 80

Leu Thr Ala Ala His Cys Thr Gln Gly Arg Phe Gly Phe Arg Val Arg

85 90 95

Ala Gly Ala Thr Arg Leu Ser Pro Ser Asp His Glu Gly Glu Ala Met

100 105 110

Val Gly Gly Ile Val Glu His Pro Gly Tyr Asp Ser Gly Ala Ser Gly

115 120 125

Ile Pro Asn Asp Val Ala Thr Leu His Leu Ser Ser Ser Ile Asn Ser

130 135 140

Gly Gly Ala Ile Gly Tyr Ala Ser Leu Pro Ser Ser Ser Ala Gly Ser

145 150 155 160

Phe Ala Gly Asn Ala Val Tyr Ile Ser Gly Trp Gly Lys Thr Asp Gly

165 170 175

Ser Ala Asp Gly Gly Ser Asn Val Leu Asn Gln Val Arg Thr Thr Val

180 185 190

Ile Ser Glu Ser Asp Cys Arg Asn Arg Met Pro Gly Thr Leu Gly Ser

195 200 205

Gly Ile Ser Ala Met His Ile Cys Ile Phe Ser Gly Asn Ser Gly Ser

210 215 220

Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Met Thr His Ala Ser Asn Gly Leu

225 230 235 240

Met Ile Gly Val Thr Ser Trp Gly Val Gly Asn Ile Phe Val Ser Cys

245 250 255

Leu Thr Glu Tyr Pro Ser Val Tyr Ala Arg Val Ser Tyr Phe Arg Ser

260 265 270

Trp Ile Asp Ser Asn

275