本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于CD86的膜固定蛋白、其制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腫瘤的過繼性細(xì)胞免疫治療(Adoptive cellular immunotherapy，ACI或AIT)是指向腫瘤患者轉(zhuǎn)輸具有抗腫瘤活性的免疫細(xì)胞(特異性的和相對特異性的)直接殺傷腫瘤或激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)殺傷腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療腫瘤的目的。該細(xì)胞免疫治療是腫瘤康復(fù)醫(yī)學(xué)一種新興的、具有顯著療效的全新的抗腫瘤治療方法，被稱為二十一世紀(jì)腫瘤綜合治療模式中最活躍、最有發(fā)展前途的一種治療手段。

目前免疫細(xì)胞治療存在的問題是獲得具有一定純度和數(shù)量的某一免疫細(xì)胞亞群，通常采用的是各種細(xì)胞因子組合及磁珠分選等方法，此方法需要從病人采集大量的外周血且擴(kuò)增程度有限。而采用飼養(yǎng)細(xì)胞的方法直接從外周血中擴(kuò)增免疫細(xì)胞操作簡單且獲得細(xì)胞純度高、數(shù)量多，具有很好的臨床價值。

有效地細(xì)胞免疫治療就離不開在體外大量培養(yǎng)、擴(kuò)增和活化免疫細(xì)胞。適宜免疫細(xì)胞生長的培養(yǎng)基為細(xì)胞提供了適宜的基礎(chǔ)環(huán)境如營養(yǎng)物質(zhì)、滲透壓、PH值等，并且細(xì)胞將代謝的產(chǎn)物排放至培養(yǎng)基中。市面現(xiàn)有培養(yǎng)基并非針對免疫細(xì)胞培養(yǎng)所需條件進(jìn)行配制，導(dǎo)致細(xì)胞增殖效率及生物學(xué)效力不佳，而且很多培養(yǎng)基添加了人或動物血清及組分來補(bǔ)充完全。但人血清昂貴，不適宜大規(guī)模擴(kuò)增，且由于供體的相異性，導(dǎo)致血清質(zhì)量每批間存在差異，尤其是被肝炎病毒或HIV污染的危險。添加有人血白蛋白、人轉(zhuǎn)鐵蛋白、人胰島素等人源性組分的無血清培養(yǎng)基，雖經(jīng)過病源檢測及消毒，但仍避免不了由于供體的不同每批間存在差異，不利于質(zhì)量的控制。動物血清如胎牛血清、新生牛血清等來自牛材料的血清組分，雖然有足夠的量供應(yīng)，價格便宜，但存在傳播傳染病的風(fēng)險，如支原體、病毒(如BSE病源因子)污染的危險。

CN 104450614 A公開了一種無動物蛋白源的免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基中包括如下組分，氨基酸為1400-1500mg，維生素為70-75mg，鹽類為9800-10000mg，有機(jī)質(zhì)為9500-9700mg，蛋白質(zhì)為76-80mg。其需要不斷的額外添加各種組分來維持細(xì)胞的生長，尋找一種快速便捷的培養(yǎng)方式，能夠直接進(jìn)行大量培養(yǎng)免疫細(xì)胞也就十分有必要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足及實(shí)際的需求，本發(fā)明提供一種基于CD86的膜固定蛋白、其制備方法及應(yīng)用，本發(fā)明中的膜固定蛋白能夠長期穩(wěn)定的表達(dá)，宿主廣泛，能用于細(xì)胞的培養(yǎng)。

為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一方面，本發(fā)明提供一種基于CD86的膜固定蛋白，所述CD86包括信號肽編碼基因、胞外區(qū)編碼基因、跨膜區(qū)編碼基因和胞內(nèi)區(qū)編碼基因，所述膜固定蛋白為將CD86的胞外區(qū)編碼基因替換為可表達(dá)的外源基因。

優(yōu)選地，所述可表達(dá)的外源基因?yàn)镃D64的胞外區(qū)編碼基因、CD19的胞外區(qū)編碼基因、CD137L的胞外區(qū)編碼基因、CD86的胞外區(qū)編碼基因、分泌蛋白IL-15、分泌蛋白IL-21、CD1d的胞外區(qū)編碼基因、CD80的胞外區(qū)編碼基因、CD83的胞外區(qū)編碼基因、HLA I、HLA II或CD32的胞外區(qū)編碼基因中的其中一種或至少兩種的組合，優(yōu)選為CD64的胞外區(qū)編碼基因。

本發(fā)明中，所述可表達(dá)的外源基因?yàn)镃D64的胞外區(qū)編碼基因，CD19的胞外區(qū)編碼基因，CD137L的胞外區(qū)編碼基因，CD86的胞外區(qū)編碼基因，膜固定IL-15，膜固定IL-21，CD1d的胞外區(qū)編碼基因，CD80的胞外區(qū)編碼基因，CD83的胞外區(qū)編碼基因，HLA-I，CD32的胞外區(qū)編碼基因，CD137L的胞外區(qū)編碼基因和膜固定IL-15的組合，CD64的胞外區(qū)編碼基因和CD86的胞外區(qū)編碼基因的組合，CD1d的胞外區(qū)編碼基因、CD80的胞外區(qū)編碼基因和CD83的胞外區(qū)編碼基因的組合的組合，HLA1、CD80的胞外區(qū)編碼基因和CD83的胞外區(qū)編碼基因的組合，CD32的胞外區(qū)編碼基因、CD64的胞外區(qū)編碼基因和CD137L的胞外區(qū)編碼基因的組合，CD64的胞外區(qū)編碼基因、CD86的胞外區(qū)編碼基因、CD137L的胞外區(qū)編碼基因、CD19的胞外區(qū)編碼基因和膜固定IL-15的組合。

優(yōu)選地，所述膜固定蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述SEQ ID NO.1的核苷酸序列如下：

Atggacccccagtgcactatgggactgagtaacattctctttgtgatggccttcctgctctctggtgctgctcctctgaagattcaagctcaagtggacaccacaaaggcagtgatcactttgcagcctccatgggtcagcgtgttccaagaggaaaccgtaaccttgcattgtgaggtgctccatctgcctgggagcagctctacacagtggtttctcaatggcacagccactcagacctcgacccccagctacagaatcacctctgccagtgtcaatgacagtggtgaatacaggtgccagagaggtctctcagggcgaagtgaccccatacagctggaaatccacagaggctggctactactgcaggtctccagcagagtcttcacggaaggagaacctctggccttgaggtgtcatgcgtggaaggataagctggtgtacaatgtgctttactatcgaaatggcaaagcctttaagtttttccactggaattctaacctcaccattctgaaaaccaacataagtcacaatggcacctaccattgctcaggcatgggaaagcatcgctacacatcagcaggaatatctgtcactgtgaaagagctatttccagctccagtgctgaatgcatctgtgacatccccactcctggaggggaatctggtcaccctgagctgtgaaacaaagttgctcttgcagaggcctggtttgcagctttacttctccttctacatgggcagcaagaccctgcgaggcaggaacacatcctctgaataccaaatactaactgctagaagagaagactctgggttatactggtgcgaggctgccacagaggatggaaatgtccttaagcgcagccctgagttggagcttcaagtgcttggcctccagttaccaactcctgtctggtttcattggattacagctgtacttccaacagttattatatgtgtgatggttttctgtctaattctatggaaatggaagaagaagaagcggcctcgcaactcttataaatgtggaaccaacacaatggagagggaagagagtgaacagaccaagaaaagagaaaaaatccatatacctgaaagatctgatgaagcccagcgtgtttttaaaagttcgaagacatcttcatgcgacaaaagtgatacatgtttttaa.

第二方面，本發(fā)明提供一種重組慢病毒，如第一方面所述的膜固定蛋白與pCDH表達(dá)載體及包裝質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染哺乳細(xì)胞得到的重組慢病毒。

本發(fā)明中，所述慢病毒將重組基因整合到細(xì)胞基因組中，進(jìn)而使細(xì)胞表達(dá)膜固定蛋白。

第三方面，本發(fā)明提供一種宿主細(xì)胞，包括如第一方面所述的膜固定蛋白或如第二方面所述的重組慢病毒。

優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞為K562、293T、293FT或293LTV中的任意一種或至少兩種的組合，優(yōu)選為K562細(xì)胞。

本發(fā)明構(gòu)建的將慢病毒侵染K562細(xì)胞得到的宿主細(xì)胞為K562-SP86CD64。

第四方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的膜固定蛋白的制備方法，包括如下步驟：

(1)全基因合成膜固定蛋白的基因序列，連接到pUC57載體上，根據(jù)序列設(shè)計引物，以連接上目的基因的pUC57載體為模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到具有膜固定蛋白的基因片段；

(2)將步驟(1)擴(kuò)增得到的基因片段連接到pCDH表達(dá)載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒；

(3)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆，得到帶有膜固定蛋白的工程菌。

本發(fā)明構(gòu)建的將目的基因連接到pCDH表達(dá)載體上的重組載體為pCDH-SP86CD64。

優(yōu)選地，步驟(1)所述引物為SEQ ID NO.2-3所示的序列。

所述上游引物所示的序列為：5’-GCGGATCCATGGACCCCCAGT-3’，(SEQ ID NO.2)；

所述下游引物所示的序列為：5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTAAAAACATGT-3’，(SEQ ID NO.3)。

優(yōu)選地，步驟(2)所述將擴(kuò)增得到的基因片段連接到pUC57載體的BamHI和NotI克隆位點(diǎn)。

第五方面，本發(fā)明提供一種如第三方面所述的宿主細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟：

1)將如第一方面所述的膜固定蛋白經(jīng)過包裝后得到重組慢病毒，將所得重組慢病毒侵染目的細(xì)胞，然后篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，得到所述宿主細(xì)胞；或

2)將如第二方面所述的重組慢病毒侵染目的細(xì)胞，然后篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，得到所述宿主細(xì)胞。

第六方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的膜固定蛋白、如第二方面所述的重組慢病毒或如第三方面所述的宿主細(xì)胞用于培養(yǎng)細(xì)胞。

優(yōu)選地，所述細(xì)胞為NK細(xì)胞、臍血Treg細(xì)胞、CAR-T細(xì)胞、iNKT細(xì)胞、CD8⁺T細(xì)胞、CD4⁺T細(xì)胞或CD3⁺T細(xì)胞中的任意一種或至少兩種的組合。

基于K562的工程化細(xì)胞可用于多種免疫細(xì)胞亞群的擴(kuò)增，如轉(zhuǎn)導(dǎo)CD137L、膜固定IL-15可用于NK擴(kuò)增，CD137L、膜固定IL-21可用于NK擴(kuò)增，轉(zhuǎn)導(dǎo)CD64、CD86可用于臍血Treg細(xì)胞的擴(kuò)增，轉(zhuǎn)導(dǎo)CD64、CD86、CD137L、CD19、分泌蛋白IL-15的K562可用于針對CD19的CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增，轉(zhuǎn)導(dǎo)CD1d、CD80、CD83的K562可用于iNKT細(xì)胞的擴(kuò)增，轉(zhuǎn)導(dǎo)HLAI、CD80、CD83的K562可用于CD8⁺細(xì)胞的擴(kuò)增，轉(zhuǎn)導(dǎo)CD32、CD64、CD137L的K562可用于CD3⁺細(xì)胞的擴(kuò)增。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明制備的膜固定蛋白表達(dá)量高，制備的慢病毒侵染細(xì)胞后，Lent-SP86CD64病毒滴度可達(dá)2.98×10⁸U/mL以上；

(2)本發(fā)明中的包含慢病毒的宿主細(xì)胞可用于培養(yǎng)細(xì)胞，源源不斷的給細(xì)胞供給營養(yǎng)物質(zhì)，無需額外添加，方便快捷。

附圖說明

圖1是本發(fā)明重組載體pCDH-SP86CD64酶切電泳結(jié)果；

圖2是本發(fā)明重組載體pCDH-SP86CD64測序結(jié)果；

圖3是本發(fā)明LV5-EGFP包裝病毒22h后熒光表達(dá)情況，其中，圖3(A)-(B)為4×物鏡下觀察，圖3(C)-(D)為10×物鏡下觀察；

圖4是本發(fā)明Lent-EGFP侵染293T細(xì)胞48h后4×物鏡下觀察的熒光表達(dá)情況，其中，圖4(A)病毒液用量為1μL，圖4(B)病毒液用量為5μL，圖4(C)病毒液用量為10μL，圖4(D)病毒液用量為15μL；

圖5是本發(fā)明LV5-EGFP病毒侵染K562細(xì)胞10×物鏡下觀察的熒光表達(dá)情況，其中，圖5(A)為熒光下圖片，圖5(B)為明場圖片；

圖6是本發(fā)明K562-SP86CD64流式檢測的結(jié)果圖；

圖7是本發(fā)明293T-SP86IL21IL-21基因的電泳圖；

圖8是本發(fā)明293T-SP86IL21中流式檢測的結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明所采取的技術(shù)手段及其效果，以下結(jié)合附圖并通過具體實(shí)施方式來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明并非局限在實(shí)施例范圍內(nèi)。

實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件，或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可通過正規(guī)渠道商購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

瓊脂糖凝膠試劑盒 TaKaRa；

質(zhì)粒小提試劑盒 TaKaRa；

質(zhì)粒大提試劑盒 OMEGA。

實(shí)施例1：慢病毒表達(dá)載體pCDH-SP86CD64的構(gòu)建

SP86CD64目的基因通過吉滿生物科技有限公司合成，序列如SEQ ID NO.1所示，連接在pUC57載體上；

(1)根據(jù)已知pUC57-SP86CD64序列設(shè)計引物如下：

上游引物：5’-GCGGATCCATGGACCCCCAGT-3’(SEQ ID NO.2)；

下游引物：5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTAAAAACATGT-3’(SEQ ID NO.3)；

以pUC57-SP86CD64載體為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：

其中，以水為樣本作為陰性對照。

反應(yīng)條件如下：

所獲得PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到的電泳檢測結(jié)果如圖1所示，可見SP86CD64為1170bp，已連接到pCDH載體上。

(2)步驟(1)得到的SP86CD64的PCR產(chǎn)物用Takara瓊脂糖凝膠試劑盒回收，用BamHI和NotI雙酶切純化產(chǎn)物，同時用BamHI和NotI雙酶切pCDH，反應(yīng)體系如下：

37℃下反應(yīng)2h，將酶切后的基因與酶切后的載體進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)體系如下：

22℃孵育30min，采用熱擊法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α中，然后每管中加入SOC液體培養(yǎng)液1mL，37℃條件下復(fù)蘇60min，將復(fù)蘇過的菌液涂布平板上，37℃培養(yǎng)16-18小時，從轉(zhuǎn)化平板挑取4-8個單克隆，接種于5mL LB培養(yǎng)基中、37℃、220r/min培養(yǎng)12-16h。

(3)采用質(zhì)粒小提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒小提，按上述方法進(jìn)行酶切及核酸電泳鑒定。同時送測序公司(上海生工生物工程有限公司)進(jìn)行測序，測序結(jié)果如圖2所示，得到了pCDH-SP86CD64慢病毒表達(dá)載體。

實(shí)施例2：質(zhì)粒大提

對現(xiàn)有的對照載體LV5-EGFP、目的基因表達(dá)載體pCDH-SP86CD64、包裝質(zhì)粒工程菌進(jìn)行菌體培養(yǎng)，然后大提，需要大提的質(zhì)粒為：對照載體LV5-EGFP，目的基因表達(dá)載體pCDH-SP86CD64，包裝質(zhì)粒PSPAX2和PMD2G。

大提利用SDS堿裂解法，結(jié)合硅膠模濾膜，從LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)的菌液中純化得到高純度且無內(nèi)毒素的質(zhì)粒DNA溶液，質(zhì)粒溶解于Tris Buffer中，得到的質(zhì)粒可直接用于轉(zhuǎn)化、測序、轉(zhuǎn)錄以及酶切等反應(yīng)。具體步驟為：從-80℃取出相應(yīng)的菌株，進(jìn)行平板劃線，培養(yǎng)過夜12-24h；次日挑取單克隆2-4個，進(jìn)行小體積5mL搖菌6-8h；從小搖的體系中取菌液，按體積比1:100轉(zhuǎn)大搖。用大提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒大提，隨后根據(jù)上述方法進(jìn)行核酸濃度測定及核酸電泳鑒定。

實(shí)施例3：碳酸鈣病毒包裝

用構(gòu)建的慢病毒表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝病毒，病毒液收集和濃縮，儲存和稀釋，并進(jìn)行滴度檢測和MOI值的測定。

本實(shí)驗(yàn)方法采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。采用離心超濾超濾方式進(jìn)行病毒的收集與濃縮。對病毒滴度的測定采用不飽和侵染流式法，具體步驟為：

接種293T細(xì)胞與六孔板數(shù)孔，使貼壁后融合度達(dá)到70％，并對接種細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)為N；細(xì)胞貼壁后6-8h，梯度加入病毒液V(如10、7.5、5、2.5μl)，流式檢測各梯度的侵染百分率，選擇接近50％的侵染組，設(shè)侵染率為M；按照公式T＝N×M/V×1000(TU/mL)進(jìn)行病毒滴度計算。

LV5-EGFP包裝病毒22h后的熒光表達(dá)情況如圖3所示，Lent-EGFP侵染293T細(xì)胞48h后的熒光表達(dá)情況如圖4所示，可以看出，病毒包裝系統(tǒng)沒有問題。

流式細(xì)胞儀檢測各梯度的侵染結(jié)果如下表1，Lent-EGFP、Lent-SP86CD64侵染293T細(xì)胞(4×10⁵個)，48h后流式檢測目的蛋白表達(dá)情況，通過不飽和侵染計算病毒滴度，Lent-EGFP：0.72×10⁸U/mL，Lent-SP86CD64≥2.98×10⁸U/mL。

表1

實(shí)施例4：K562-SP86CD64細(xì)胞株的構(gòu)建

在60mm培養(yǎng)皿內(nèi)種植細(xì)胞，細(xì)胞密度為能使第二天細(xì)胞融合能達(dá)到70％-80％的密度，CO₂孵箱過夜培養(yǎng)。第二天準(zhǔn)備3mL無抗生素?zé)o血清培養(yǎng)基，加入Polybrene使其終濃度為8μg/mL。

將已經(jīng)制備的病毒顆粒0.5mL加至上述培養(yǎng)基，輕吹混勻。去除60mm培養(yǎng)皿內(nèi)的舊的培養(yǎng)基，加入含病毒培養(yǎng)基。病毒感染后24小時，可以換用含最優(yōu)濃度嘌呤霉素的培養(yǎng)基。以后每隔一天換用新鮮含嘌呤霉素的無抗生素?zé)o血清培養(yǎng)基，以替換含大量死細(xì)胞的培養(yǎng)基。

一般在篩選后10到12天，抗性群落能被識別出，LV5-EGFP病毒侵染K562細(xì)胞熒光表達(dá)情況如圖5所示，可見，外源基因?qū)氲剿拗骷?xì)胞基因組中，并能正確翻譯、表達(dá)蛋白。

待抗性細(xì)胞長滿以后，細(xì)胞轉(zhuǎn)入10cm培養(yǎng)皿，同時，留一部分細(xì)胞在原來的60mm平皿內(nèi)。60mm平皿內(nèi)細(xì)胞長滿后，收獲細(xì)胞，在蛋白或mRNA水平鑒定基因敲低效率。10cm培養(yǎng)皿內(nèi)的細(xì)胞待長滿后傳代，首先每種穩(wěn)定細(xì)胞系凍存4-5支細(xì)胞，待基因敲低鑒定清楚后，解凍凍存細(xì)胞，進(jìn)行表型觀察分析。通常情況下，由于慢病毒為復(fù)制缺陷型病毒，受感染的細(xì)胞不能產(chǎn)生新的病毒，因此從加入病毒顆粒開始，經(jīng)過5-6次換液后，培養(yǎng)基內(nèi)已不存在病毒顆粒，可以移至普通細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)研究。

有限稀釋法篩選單克隆細(xì)胞。首先制備細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為得到80,000個細(xì)胞數(shù)/mL，取25μl(內(nèi)含2000個細(xì)胞)，稀釋并調(diào)整至2000個/mL。再稀釋成10mL培養(yǎng)液。取1mL第1個稀釋度的細(xì)胞懸液加9mL培養(yǎng)基。取3mL第二稀釋度的cell懸液加7mL培養(yǎng)基，將第三個稀釋度的細(xì)胞鋪1塊96孔板。每孔加0.1mL，共加96孔。細(xì)胞擴(kuò)增到一定數(shù)目后進(jìn)行流式檢測。

流式結(jié)果見表2和圖6，從表2和圖6可以看出，獲得了高純度的穩(wěn)定表達(dá)CD64的K562細(xì)胞。

表2

實(shí)施例5：慢病毒表達(dá)載體pCDH-SP86IL-21的構(gòu)建

將CD86的胞外區(qū)編碼序列替換為IL-21胞外區(qū)編碼基因，其制備方法同實(shí)施例1-3，其構(gòu)建的慢病毒表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，包裝病毒，得到SP86IL-21病毒。

將病毒侵染293T細(xì)胞，2天后取部分細(xì)胞進(jìn)行RNA的提取，合成CDNA，PCR擴(kuò)增IL21目的片段，瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖7所示，可見，目的條帶大小為1515bp，外源基因IL21成功的導(dǎo)入受體細(xì)胞293T基因組中。

同時，取部分細(xì)胞進(jìn)行流式檢測，檢測結(jié)果如圖8所示，可見可溶性蛋白IL21成功的在293T細(xì)胞膜上表達(dá)。

實(shí)施例6：慢病毒表達(dá)載體pCDH-SP86CD137L的構(gòu)建

將CD86的胞外區(qū)編碼序列替換為CD137L胞外區(qū)編碼基因，其制備方法同實(shí)施例1-4，其構(gòu)建的慢病毒和pCDH-SP86CD64有類似的效果。

實(shí)施例7：慢病毒表達(dá)載體pCDH-SP86CD19的構(gòu)建

將CD86的胞外區(qū)編碼序列替換為CD19胞外區(qū)編碼基因，其制備方法同實(shí)施例1-4，其構(gòu)建的慢病毒和pCDH-SP86CD64有類似的效果。

實(shí)施例8：慢病毒表達(dá)載體pCDH-SP86IL-15的構(gòu)建

將CD86的胞外區(qū)編碼序列替換為IL-15胞外區(qū)編碼基因，其制備方法同實(shí)施例1-4，其構(gòu)建的慢病毒和pCDH-SP86CD64有類似的效果。

實(shí)施例9：慢病毒表達(dá)載體pCDH-SP86CD1d的構(gòu)建

將CD86的胞外區(qū)編碼序列替換為CD1d胞外區(qū)編碼基因，其制備方法同實(shí)施例1-4，其構(gòu)建的慢病毒和pCDH-SP86CD64有類似的效果。

實(shí)施例10：慢病毒表達(dá)載體pCDH-SP86CD80的構(gòu)建

將CD86的胞外區(qū)編碼序列替換為CD80胞外區(qū)編碼基因，其制備方法同實(shí)施例1-4，其構(gòu)建的慢病毒和pCDH-SP86CD64有類似的效果。

實(shí)施例11：慢病毒表達(dá)載體pCDH-SP86CD83的構(gòu)建

將CD86的胞外區(qū)編碼序列替換為CD83胞外區(qū)編碼基因，其制備方法同實(shí)施例1-4，其構(gòu)建的慢病毒和pCDH-SP86CD64有類似的效果。

實(shí)施例12：慢病毒表達(dá)載體pCDH-SP86CD32的構(gòu)建

將CD86的胞外區(qū)編碼序列替換為CD32胞外區(qū)編碼基因，其制備方法同實(shí)施例1-4，其構(gòu)建的慢病毒和pCDH-SP86CD64有類似的效果。

實(shí)施例13：慢病毒表達(dá)載體pCDH-SP86HLA1的構(gòu)建

將CD86的胞外區(qū)編碼序列替換為HLA1基因，其制備方法同實(shí)施例1-4，其構(gòu)建的慢病毒和pCDH-SP86CD64有類似的效果。

實(shí)施例14：慢病毒表達(dá)載體pCDH-SP86CD64CD137L的構(gòu)建

將CD86的胞外區(qū)編碼序列替換為CD64胞外區(qū)編碼基因和CD137L胞外區(qū)編碼基因的組合，其制備方法同實(shí)施例1-4，其構(gòu)建的慢病毒和pCDH-SP86CD64有類似的效果。

申請人聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來說明本發(fā)明的詳細(xì)方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)方法才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進(jìn)，對本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省華隆生物技術(shù)有限公司

<120> 一種基于CD86的膜固定蛋白、其制備方法及應(yīng)用

<130> 2016

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1170

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 1

atggaccccc agtgcactat gggactgagt aacattctct ttgtgatggc cttcctgctc 60

tctggtgctg ctcctctgaa gattcaagct caagtggaca ccacaaaggc agtgatcact 120

ttgcagcctc catgggtcag cgtgttccaa gaggaaaccg taaccttgca ttgtgaggtg 180

ctccatctgc ctgggagcag ctctacacag tggtttctca atggcacagc cactcagacc 240

tcgaccccca gctacagaat cacctctgcc agtgtcaatg acagtggtga atacaggtgc 300

cagagaggtc tctcagggcg aagtgacccc atacagctgg aaatccacag aggctggcta 360

ctactgcagg tctccagcag agtcttcacg gaaggagaac ctctggcctt gaggtgtcat 420

gcgtggaagg ataagctggt gtacaatgtg ctttactatc gaaatggcaa agcctttaag 480

tttttccact ggaattctaa cctcaccatt ctgaaaacca acataagtca caatggcacc 540

taccattgct caggcatggg aaagcatcgc tacacatcag caggaatatc tgtcactgtg 600

aaagagctat ttccagctcc agtgctgaat gcatctgtga catccccact cctggagggg 660

aatctggtca ccctgagctg tgaaacaaag ttgctcttgc agaggcctgg tttgcagctt 720

tacttctcct tctacatggg cagcaagacc ctgcgaggca ggaacacatc ctctgaatac 780

caaatactaa ctgctagaag agaagactct gggttatact ggtgcgaggc tgccacagag 840

gatggaaatg tccttaagcg cagccctgag ttggagcttc aagtgcttgg cctccagtta 900

ccaactcctg tctggtttca ttggattaca gctgtacttc caacagttat tatatgtgtg 960

atggttttct gtctaattct atggaaatgg aagaagaaga agcggcctcg caactcttat 1020

aaatgtggaa ccaacacaat ggagagggaa gagagtgaac agaccaagaa aagagaaaaa 1080

atccatatac ctgaaagatc tgatgaagcc cagcgtgttt ttaaaagttc gaagacatct 1140

tcatgcgaca aaagtgatac atgtttttaa 1170

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 2

gcggatccat ggacccccag t 21

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 3

ataagaatgc ggccgcttaa aaacatgt 28