專(zhuān)利名稱(chēng)：：通過(guò)膜聯(lián)蛋白a3對(duì)前列腺癌癥的自身免疫調(diào)節(jié)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及診斷前列腺癌的方法，所述方法包括用特定試劑測(cè)定膜聯(lián)蛋白(annexin)A3(ANXA3)和/或針對(duì)ANXA3的自身抗體。本發(fā)明允許對(duì)良性、癌前和惡性病況加以區(qū)分。此外，所述方法具有預(yù)后相關(guān)性。
背景技術(shù)：
：在以前的區(qū)分性定量蛋白表達(dá)研究中顯示，ANXA3與前列腺癌癥顯著相關(guān)U)。但是，對(duì)于ANXA3在人前列腺中的作用和生物學(xué)卻所知甚少。目前顯示，ANXA3是所謂的外來(lái)體(多種上皮細(xì)胞釋放的小嚢泡)的一部分(2)，這些外來(lái)體在對(duì)先天免疫系統(tǒng)的調(diào)控中的作用也極少為人所知(3)，它們的抗腫瘤活性非常近來(lái)才被發(fā)現(xiàn)(4)。近來(lái)的報(bào)道顯示前列腺癌癥患者中有針對(duì)所謂前列腺小體(其是來(lái)自前列腺的外來(lái)體)的自身免疫性(5)。用于治療或診斷前列腺癌癥和泌尿生殖道的其它上皮癌癥的蛋白生物標(biāo)記物被描述于US2005130876、W003086461、WO2005078124、EP05Oil042.8和EP05026092.6中。這些文獻(xiàn)的內(nèi)容都通過(guò)引用并入本文。US60/812，089和US60/859，489公開(kāi)了一種癌癥診斷方法，其中，用高度特異性的單克隆抗體針對(duì)膜聯(lián)蛋白A3的存在和/或含量來(lái)分析樣品。這些文獻(xiàn)的內(nèi)容都通過(guò)引用并入本文。雖然ANXA3已知是前列腺癌癥的標(biāo)記物，但仍需要改進(jìn)的方法用于對(duì)良性、癌前和惡性病況加以區(qū)分性診斷。
發(fā)明內(nèi)容本研究的目的之一是調(diào)查ANXA3在良性前列腺上皮、高度前列腺上皮內(nèi)瘤(HGPIN)和前列腺癌癥的上皮組分中的表達(dá)和定位，以及理解前列腺轉(zhuǎn)化進(jìn)程中的定位改變和區(qū)別。根據(jù)本發(fā)明，我們發(fā)現(xiàn)，良性前列腺組織中抗ANXA3染色強(qiáng)且在尖部(apical)，而在癌癥中其較弱并且處于更基底處。用超過(guò)1900個(gè)病例進(jìn)行的組織陣列研究顯示，ANXA3表達(dá)在良性、癌前和惡性前列腺組織沖的不同模式具有預(yù)后相關(guān)性并且提供了機(jī)制性的理解。在進(jìn)展期癌癥中，觀察到ANXA3在非上皮散布Unterspresed)細(xì)胞中的存在，其通過(guò)針對(duì)調(diào)控性T-細(xì)胞(Tregs)的復(fù)染色而局部化(colocalize)。此外，可在癌癥患者中檢測(cè)到針對(duì)ANXA3的自身抗體的存在。這些針對(duì)ANXA3的自身抗體可能是在癌癥細(xì)胞的氧化應(yīng)激下被誘導(dǎo)出來(lái)的。這證明經(jīng)由外來(lái)體的ANXA3釋放構(gòu)成了一種保護(hù)性機(jī)制，在前列腺癌癥患者中，癌癥細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)針對(duì)含ANXA3的前列腺小體的自身免疫試圖復(fù)原。因此，可通過(guò)ANXA3外來(lái)體和/或癌癥細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)Tregs的信號(hào)化。此外，可通過(guò)ANXA3陽(yáng)性T細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)/調(diào)控針對(duì)前列腺小體/外來(lái)體的自身免疫抗體。綜合考慮，強(qiáng)烈表明良性前列腺增生(BPH)期間ANXA3向前列腺細(xì)胞外區(qū)室中的釋放構(gòu)成針對(duì)癌癥的防御機(jī)制，癌組織通過(guò)誘導(dǎo)針對(duì)ANXA3的自身免疫抗體以及通過(guò)涉及到調(diào)控性T-細(xì)胞(Tregs)的機(jī)制，最終使得這種釋放停止。不同的ANXA3染色模式也首次提供了在通過(guò)Gleason分?jǐn)?shù)、pT-分期和PSA劃分的中等風(fēng)險(xiǎn)組中預(yù)測(cè)PSA無(wú)進(jìn)展存活的可能性。在笫一個(gè)方面，本發(fā)明涉及診斷癌癥(優(yōu)選地，前列腺癌癥)的下述方法，其中針對(duì)膜聯(lián)蛋白A3的細(xì)胞內(nèi)分布來(lái)分析組織樣品。在另一方面，本發(fā)明涉及診斷癌癥(優(yōu)選地，前列腺癌癥)的下述方法，其中，針對(duì)膜聯(lián)蛋白A3的細(xì)胞內(nèi)分布和/或含量以及針對(duì)對(duì)膜聯(lián)蛋白A3的自身免疫應(yīng)答，對(duì)樣品(例如組織樣品或體液樣品)加以分析，其中，優(yōu)選通過(guò)針對(duì)膜聯(lián)蛋白A3的自身抗體的存在和/或通過(guò)調(diào)控性T-細(xì)胞的存在，來(lái)表征自身免疫應(yīng)答。本發(fā)明的另一方面涉及診斷癌癥(優(yōu)選地，前列腺癌癥)的下述方法，其中，針對(duì)針對(duì)膜聯(lián)蛋白A3的自身抗體的存在和/或含量以及分析。本發(fā)明的還一方面涉及對(duì)已被歸類(lèi)為具有發(fā)展性前列腺癌癥中等風(fēng)險(xiǎn)的受試者進(jìn)行程度劃分的方法，其中，針對(duì)膜聯(lián)蛋白A3的存在、定位和/或含量對(duì)來(lái)自所述受試者的樣品加以分析。本發(fā)明的還一方面是用于診斷癌癥(優(yōu)選地，前列腺癌癥)的測(cè)試試劑，其包含(i)用于測(cè)定膜聯(lián)蛋白A3的試劑和(ii)用于測(cè)定針對(duì)膜聯(lián)蛋白A3的自身抗體的試劑和/或用于測(cè)定調(diào)控性T-細(xì)胞的試劑。本發(fā)明的還一方面是用于診斷前列腺癌癥的測(cè)試試劑，其包含用于測(cè)定針對(duì)膜聯(lián)蛋白A3的自身抗體的試劑。可根據(jù)本發(fā)明診斷的癌癥優(yōu)選是泌尿生殖和/或胃腸道的癌癥，例如前列腺、膀胱、腎、尿道、卵巢、子宮或結(jié)腸的癌癥。特別地，癌癥是上皮癌。在一種尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，癌癥是前列腺癌癥。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明包括對(duì)疾病階段的區(qū)分性診斷和/或預(yù)后評(píng)價(jià)。例如，本發(fā)明允許對(duì)選自下述的疾病階段進(jìn)行區(qū)分性診斷(i)良性病況，特別地，良性前列腺病況，例如，良性前列腺增生(BPH)、纖維化和慢性前列腺炎，(ii)癌前病況，例如，多種階段(PIN-l-3)的前列腺上皮內(nèi)瘤，包括高度上皮內(nèi)瘤(HGPIN)1，和/或(iii)惡性病況，例如，前列腺癌，特別是通過(guò)Gleason分?jǐn)?shù)和pT-分期指示的處于進(jìn)展期(progressed)狀態(tài)的進(jìn)展期(advanced)前列腺癌。更優(yōu)選地，本發(fā)明允許一方面在良性和癌前病況之間進(jìn)行區(qū)分性診斷，另一方面對(duì)惡性病況進(jìn)行區(qū)分性診斷。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，在樣品中測(cè)定ANXA3的存在、含量和/或分布，所述樣品可以是體液或組織樣品。更優(yōu)選地，樣品是組織樣品，例如，來(lái)自前列腺組織的組織切片或活檢樣品。在另一實(shí)施方式中，可在樣品中測(cè)定ANXA3的細(xì)胞內(nèi)分布/定位，其中所述樣品是組織樣品，優(yōu)選是組織切片或活檢樣品，例如來(lái)自前列腺組織的。優(yōu)選地，在上皮細(xì)胞中測(cè)定ANXA3的細(xì)胞內(nèi)定位，特別是在前列腺上皮細(xì)胞中測(cè)定。應(yīng)當(dāng)注意，可在單種組織樣品或不同樣品(例如，來(lái)自同一受試者的體液樣品和組織樣品)上測(cè)定存在、含量和細(xì)胞內(nèi)定位。樣品中高含量的ANXA3(例如，對(duì)應(yīng)于組織樣品的強(qiáng)染色)基本上指示良性病況。中等/低含量的ANXA3(例如，對(duì)應(yīng)于組織樣品的弱/中等染色)指示癌前病況或者早期/早-中期惡性病況。樣品中不存在ANXA3指示惡性病況，基本上是處于進(jìn)展期狀態(tài)的惡性病況，例如，在中期或晚期。此外，樣品中不存在ANXA3指示前列腺癌證的侵略性亞組，特別是具有手術(shù)(根治性前列腺切除術(shù))后進(jìn)展的高風(fēng)險(xiǎn)。ANXA3的尖部細(xì)胞內(nèi)定位，特別是ANXA3在尖部定位的嚢泡(例如外來(lái)體和前列腺小體)中的存在，基本上指示良性或癌前病況。ANXA3的擴(kuò)散性細(xì)胞內(nèi)定位，特別是組合不存在尖部定位的嚢泡的情況時(shí)，指示惡性病況。針對(duì)ANXA3的自身免疫應(yīng)答的存在，例如，針對(duì)ANXA3的自身抗體的存在，和/或強(qiáng)ANXA3-陽(yáng)性(但是是細(xì)胞內(nèi)的，非尖部的)調(diào)控T-細(xì)胞的存在，基本上指示惡性病況，特別是處于進(jìn)展期狀態(tài)的惡性病況。本發(fā)明包括對(duì)樣品中多肽或細(xì)胞的測(cè)定。優(yōu)選地，這種測(cè)定包括免疫學(xué)方法，其中，使用免疫測(cè)試試劑來(lái)測(cè)定組分的存在、含量和/或定位。用于測(cè)定樣品中ANXA3的試劑優(yōu)選是特異于ANXA3的抗體，例如，多克隆抗體或單克隆抗體。尤其優(yōu)選的是高特異性單克隆抗體，如us60/812,089和US60/859,489(它們通過(guò)引用并入本文)所述。用于測(cè)定樣品中ANXA3自身抗體的試劑優(yōu)選是ANXA3多肽或其包含可被自身抗體識(shí)別的表位的片段。更優(yōu)選地，ANXA3多肽是重組ANXA3多肽。用于測(cè)定樣品中調(diào)控性T-細(xì)胞的試劑優(yōu)選是針對(duì)調(diào)控性T-細(xì)胞7的標(biāo)記物(例如，CD25或Foxp3或其它此類(lèi)標(biāo)記物)的抗體。本發(fā)明的方法可在適于免疫測(cè)定的任何測(cè)試形式中進(jìn)行，包括適于自動(dòng)設(shè)備的測(cè)試形式。在一些測(cè)試形式中，可優(yōu)選使用帶有標(biāo)記基團(tuán)(例如可視標(biāo)記物，例如，膠乳或金粒、焚光標(biāo)記物基團(tuán)、酶標(biāo)記物基團(tuán)等)的試劑。可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)生產(chǎn)試劑和標(biāo)記基團(tuán)的綴合物，例如通過(guò)將試劑的反應(yīng)活性氨基酸側(cè)基團(tuán)(例如羧基、氨基和/或疏醇基)與標(biāo)記基團(tuán)共價(jià)偶聯(lián)，例如通過(guò)雙功能間隔(spacer)分子。優(yōu)選地，從人類(lèi)受試者獲得樣品。在一些實(shí)施方式中，所述方法是非侵入性的診斷流程，其中，樣品可以是尿樣，特別是exprimate尿樣或糞便樣品。如果需要的話(huà)，可對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理流程，例如凝膠過(guò)濾。在另一些實(shí)施方式中，所述方法可以是組織化學(xué)流程，其中樣品可以是組織樣品，特別是活檢樣品，例如，鉆取(punch)或穿刺(lance)活檢樣品或來(lái)自TUR-P(經(jīng)尿道前列腺電切術(shù))的樣品。在組織化學(xué)流程中，可通過(guò)測(cè)定ANXA3在樣品中的定位來(lái)對(duì)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的ANXA3進(jìn)行選擇性測(cè)定。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明包括對(duì)ANXA3的半定量或定量測(cè)定。這種半定量或定量測(cè)定可包括基于預(yù)先確定的分離點(diǎn)值(cut-offvalue)來(lái)評(píng)估測(cè)試結(jié)果以及將評(píng)估結(jié)果與疾病階段關(guān)聯(lián)起來(lái)?？赏ㄟ^(guò)根據(jù)已知方法，在來(lái)自健康人和/或具有預(yù)先確定的疾病階段的人的樣品中測(cè)定ANXA3來(lái)確定分離點(diǎn)值。此外，還可通過(guò)評(píng)估經(jīng)染色的組織樣品以及將評(píng)估結(jié)果與疾病階段關(guān)聯(lián)起來(lái)，來(lái)測(cè)定ANXA3在樣品中的量。本發(fā)明還涉及對(duì)自身抗體針對(duì)ANXA3的自身免疫應(yīng)答的測(cè)定和/或?qū)φ{(diào)控性T-細(xì)胞存在的測(cè)定。這種測(cè)定可單獨(dú)進(jìn)行或可與對(duì)ANXA3的測(cè)定組合進(jìn)行。自身抗體的存在指示惡性病況，特別是處于進(jìn)展期階段的惡性病況。對(duì)自身抗體的測(cè)定任選與對(duì)調(diào)控性T-細(xì)胞的測(cè)定相組合。調(diào)控性T-細(xì)胞的存在指示惡性病況，特別是處于進(jìn)展期階段的惡性病況?？蓪?duì)樣品進(jìn)行分級(jí)分離流程，這允許對(duì)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外ANXA3進(jìn)行分別的測(cè)定。例如，可對(duì)樣品加以離心，以獲得細(xì)胞沉淀團(tuán)和上清液，其中，在細(xì)胞沉淀團(tuán)中測(cè)定細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3，在上清液中測(cè)定細(xì)胞外膜聯(lián)蛋白A3。在一種尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法包括對(duì)細(xì)胞外ANXA3進(jìn)行選擇性測(cè)定。在另一種尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法包括對(duì)細(xì)胞內(nèi)ANXA3進(jìn)行選擇性測(cè)定。本發(fā)明的方法還可包括對(duì)其它癌癥標(biāo)記物(例如，癌癥標(biāo)記物)加以測(cè)定。對(duì)其它癌癥標(biāo)記物的測(cè)定可以在其中測(cè)定ANXA3的相同樣品中進(jìn)行，或者可在不同樣品中進(jìn)行，例如，血、血清和/或血漿樣品。尤其優(yōu)選的是對(duì)血、血清或血漿標(biāo)記物的測(cè)定，特別是對(duì)激肽釋放酶(kallikrein)蛋白酶家族中至少一種成員(例如前列腺特異性抗原(PSA))和/或至少一種上皮細(xì)胞標(biāo)記物(特別是前列腺特異性膜抗原(PSMA))的測(cè)定。本發(fā)明可以是下述篩選流程，其中，針對(duì)癌癥，特別是前列腺癌癥，對(duì)個(gè)體或個(gè)體的組加以測(cè)試。另一方面，所述方法還可包含預(yù)后評(píng)估或治療后續(xù)測(cè)試，其中，對(duì)已經(jīng)診斷為癌癥(特別是前列腺癌癥或其之前階段)陽(yáng)性的個(gè)體進(jìn)行預(yù)后評(píng)估和/或治療控制監(jiān)測(cè)。在一種尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及對(duì)疾病進(jìn)展的預(yù)后評(píng)估，這在任何診斷評(píng)價(jià)(特別是針對(duì)治療控制)中都是有用的工具。預(yù)后評(píng)估可基于僅對(duì)ANXA3的測(cè)定或者基于與其它標(biāo)記物(例如PSA)的組合。例如，通過(guò)組織學(xué)評(píng)估和/或通過(guò)測(cè)量PSA或其它癌癥標(biāo)記物的水平，可將患者分為低風(fēng)險(xiǎn)組(例如PSA水平<10ng/ffll)、中等風(fēng)險(xiǎn)組(例如PSA水平>10但<20ng/ml)和高風(fēng)險(xiǎn)組(例如PSA水平>20ng/ml)。在這些組中測(cè)定ANXA3可產(chǎn)生更多的有用信息，特別是在被分類(lèi)為中等風(fēng)險(xiǎn)組的患者中。如果這些中等風(fēng)險(xiǎn)患者是ANXA3陽(yáng)性的，那么無(wú)PSA存活的百分比將顯著高于被測(cè)定為ANXA3陰性的患者。因此。本發(fā)明允許對(duì)個(gè)體患者組進(jìn)行進(jìn)一步的風(fēng)險(xiǎn)劃分。優(yōu)選地，可基于ANXA3測(cè)定結(jié)果對(duì)本來(lái)被分類(lèi)為中等風(fēng)險(xiǎn)組的患者重新分類(lèi)。ANXA3陽(yáng)性的患者可被重新分類(lèi)進(jìn)低風(fēng)險(xiǎn)阻，而ANXA3陰性(以及任選地，具有針對(duì)ANXA3的自身免疫應(yīng)答)的患者被分進(jìn)高風(fēng)險(xiǎn)組。進(jìn)一步地，通過(guò)下述附圖和實(shí)施例更詳細(xì)地解釋本發(fā)明。附圖描述圖1顯示了良性前列腺增生樣品(1A)、來(lái)自具有中等Gleason分?jǐn)?shù)的前列腺癌癥組織的樣品(1B)和具有ANXA3陽(yáng)性散布細(xì)胞的進(jìn)展期癌癥組織切片(1C)中ANXA3染色強(qiáng)度和定位的區(qū)別。這種類(lèi)型的細(xì)胞還對(duì)CD3(—般性的T-細(xì)胞標(biāo)記物)染色陽(yáng)性(1D);以及對(duì)CD25陽(yáng)性(針對(duì)調(diào)控性T-細(xì)胞(Tregs)的特異性標(biāo)記物)(1E)以及對(duì)Foxp3(另一種針對(duì)Tregs的特異性標(biāo)記物)陽(yáng)性(1F)。圖2顯示了ANX染色結(jié)果(陰性、弱、中等、強(qiáng))的總結(jié)，這取決于分別的病況(良性病況、癌前病況PIN和惡性病況)，即，；f艮據(jù)Gleason(GS)分?jǐn)?shù)分類(lèi)的癌癥在良性上皮中發(fā)現(xiàn)了最高的染色強(qiáng)度。(a)染色強(qiáng)度在PIN和具有增加的去分化的癌中減少。(b)尖部ANXA3染色與增加的癌癥嚴(yán)重性負(fù)相關(guān)。兩種參數(shù)與前列腺轉(zhuǎn)化的多個(gè)階段的關(guān)聯(lián)性是高度顯著的(p值<0.001)。ANXA3:膜聯(lián)蛋白A3;PIN1:前列腺上皮內(nèi)瘤。圖3顯示了不同患者組中ANXA3染色與無(wú)PSA存活時(shí)間的關(guān)系。(a)關(guān)于染色模式(尖部對(duì)比擴(kuò)散)，對(duì)ANXA3陽(yáng)性腫瘤的亞分析，使得可以分類(lèi)為預(yù)后相關(guān)的亞組(b)根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)組分類(lèi)，無(wú)PSA進(jìn)展存活的概率(c)通過(guò)ANXA3狀態(tài)(陽(yáng)性對(duì)陰性)進(jìn)行亞劃分，使得可將代表最大群體的中等風(fēng)險(xiǎn)組(n=969)分入高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)亞組(p=0.0001)。AMA3:膜聯(lián)蛋白A3;PSA:前列腺特異性抗原。圖4顯示了無(wú)PSA存活時(shí)間與ANXA3狀態(tài)之間的關(guān)系。陰性AMA3染色狀態(tài)與無(wú)PSA存活顯著相關(guān)。根據(jù)(b)Gleason級(jí)別、(c)pT分期和(d)外科手術(shù)前PSA(以ng/inl計(jì))的無(wú)PSA存活概率。ANXA3:膜聯(lián)蛋白A3;PSA:前列腺特異性抗原。圖5顯示了自身抗體在來(lái)自前列腺癌癥患者中的存在。實(shí)施例I.材料和方法1.1抗體下述抗體用于本研究克隆tgc7ProVII5C5(DSMACC2780)，單克隆，2.4mg/ml;針對(duì)靼標(biāo)蛋白ANXA3。1.2組織分析了含有>3000份組織樣品的已有的前列腺癌癥TMA。在結(jié)果部分提供了對(duì)組成的詳細(xì)描述。1.3免疫組織化學(xué)(IHC)開(kāi)發(fā)了適于在經(jīng)福爾馬林固定的組織中進(jìn)行膜聯(lián)蛋白A3檢測(cè)的IHC方案。詳細(xì)方案在下文中給出。ANXA3免疫染色(IHC)方案載片制備參對(duì)TMAs在二甲苯中脫蠟至少1小時(shí)，GFS2x5分鐘二曱苯。*在遞減的乙醇系列直到蒸餾水中進(jìn)行再水化*在PBS緩沖液中漂洗5分鐘預(yù)處理(表位恢復(fù))參在乙酸pH2中對(duì)載片進(jìn)行5分鐘高壓滅菌*在PBS緩沖液中漂洗5分鐘過(guò)氧化物酶封閉*在1%仏02/甲醇中孵育10分鐘參在PBS緩沖液中潤(rùn)洗2x5分鐘。抗體孵育參在pbs中以1:8100(0.3jjg/ml)稀釋一抗(anxa3)*用100-200m1經(jīng)稀釋的抗體覆蓋組織/tma切片*在潮濕腔中于30。C孵育2小時(shí)參在TRIS-PBS緩沖液(1:10)中漂洗2x5分鐘在30°C應(yīng)用經(jīng)HRP綴合的二抗(EnVisionDAK0K4003，抗兔)30分鐘*在TRIS-PBS緩沖液中漂洗2x5分鐘發(fā)色團(tuán)*用DAB-發(fā)色團(tuán)(LiquidDABDAKOCodeNo.:K3467)在室溫下覆蓋載片10分鐘*在PBS緩沖液中徹底清洗栽片參用蘇木精(HarrisHematoxylinHTX31000，MediteGmbH)復(fù)染色1minsec攀用水漂洗參在水遞減的乙醇系列中，在HCl-乙醇藍(lán)中區(qū)分5分鐘攀覆蓋二甲笨。1.4IHC計(jì)分一位病理學(xué)家對(duì)所有染色加以評(píng)估。版本a)，對(duì)于每份組織樣品和抗體而言，通過(guò)目測(cè)以四級(jí)計(jì)分(O、1、2、3)來(lái)估計(jì)膜染色強(qiáng)度。除此之外，以4級(jí)計(jì)分來(lái)估計(jì)染色陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞的比例(<20%、>=20<40%、>=40-<90°/。、>90%)。從這兩個(gè)參數(shù)建立最終的IHC分?jǐn)?shù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>對(duì)于某些統(tǒng)計(jì)分析而言，可將癌癥分為陰性組(陰性)或陽(yáng)性組(弱、中等、強(qiáng))1.5數(shù)據(jù)文件描述本研究中產(chǎn)生的所有數(shù)據(jù)都被概括于數(shù)據(jù)文件中，其中主題描述3cr下所示<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)用齊平方檢驗(yàn)來(lái)計(jì)算不同腫瘤亞組中ANXA3表達(dá)差異的概率。用Kaplan-Meier繪圖進(jìn)行計(jì)算，以展現(xiàn)AMA1表達(dá)對(duì)患者診斷的影響。進(jìn)行Cox回歸分析來(lái)進(jìn)行多元分析。2.結(jié)果基于對(duì)含有1679份來(lái)自根治性前列腺切除術(shù)的標(biāo)本的癌癥核心的組織微陣列的分析，來(lái)自用針對(duì)ANXA3的特異性抗體進(jìn)行的免疫細(xì)胞化學(xué)的代表性圖像(圖l)顯示了良性前列腺增生(1A)、具有中等Gleason分?jǐn)?shù)的前列腺癌癥組織(1B)和進(jìn)展期癌癥(1C)的典型標(biāo)本中ANXA3染色強(qiáng)度和定位的差異。此外，分析了135個(gè)良性和125個(gè)瘤前(高度PIN)傷口的組。通常，ANXA3染色主要是胞質(zhì)性的，其顯示了有胞質(zhì)和膜結(jié)合/嚢泡模式的細(xì)胞內(nèi)差異。在良性腺體上皮中，看到顯著的細(xì)胞和核ANXA3染色。此外，在細(xì)胞頂點(diǎn)集中的小胞質(zhì)嚢泡中發(fā)現(xiàn)了染色，這導(dǎo)致了尖部著重的胞質(zhì)染色模式。在細(xì)胞頂點(diǎn)，頻繁觀察到ANXA3陽(yáng)性嚢泡的形成，這對(duì)應(yīng)于進(jìn)入腺體小管的泌離分離過(guò)程。良性分泌細(xì)胞和HGPIN傷口被均勻陽(yáng)性染色，主要是尖部著重的胞質(zhì)染色。但是，在HGPIN中，染色強(qiáng)度顯著減少(p<.0001)。在癌癥中，染色強(qiáng)度進(jìn)一步顯著減少(包括27%的陰性染色，p〈.00t)1)，并且觀察到明顯從尖部著重的胞質(zhì)染色模式轉(zhuǎn)變?yōu)閿U(kuò)散胞質(zhì)染色(p<.0001)。圖2中提供了對(duì)這些結(jié)果的概括。陰性ANXA3染色與pT-分期和Gleason分?jǐn)?shù)相關(guān)(p〈.0001)，但與PSA無(wú)關(guān)(p=0.29)。Kaplan-Meier分析揭示了顯著降低的無(wú)PSA進(jìn)展存活(P<.0001;對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn))，在多元分析中，陰性ANXA3染色顯示是獨(dú)立的預(yù)后預(yù)測(cè)因素(HR1.20,p-.002)。表1和2中提供了細(xì)節(jié)。通過(guò)抗體染色對(duì)進(jìn)展期癌癥中散布的單細(xì)胞的進(jìn)一步分析顯示，這些細(xì)胞主要是T-細(xì)胞(1D)，更具體地，調(diào)控性T-細(xì)胞(Tregs)，因?yàn)樗鼈儽磉_(dá)CD25(1E)和Foxp3(1F)(6)。Tregs近來(lái)已被報(bào)導(dǎo)稱(chēng)作用于腫瘤特異性的耐受性(7)。關(guān)于對(duì)ANXA3陽(yáng)性癌癥的分析，針對(duì)Gleason分?jǐn)?shù)有相關(guān)性(p-0.04)，但是，與預(yù)期相反，高級(jí)別的癌癥顯示最大比例的強(qiáng)染色癌癥(35.6%),而弱染色的癌癥在低級(jí)別和高級(jí)別的癌癥中幾乎相等14(35.6對(duì)36.3%)。染色強(qiáng)度還與PSA水平相關(guān)(p=0.0029)。ANXA3強(qiáng)染色的癌癥在PSA>20ng/ml的類(lèi)別中最常見(jiàn)(41.1%)，而ANXA3弱染色在低于20ng/ml的PSA類(lèi)別中最常見(jiàn)。對(duì)于局部進(jìn)展期的癌癥而言，有染色強(qiáng)度降低的趨勢(shì)，但是這并沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯著性的要求(p-O.0630)。在1317名患者中可觀察到PSA后續(xù)。生物化學(xué)上的復(fù)發(fā)被定義為在兩次連續(xù)測(cè)量中PSA>-0.1ng/ml。354名患者發(fā)展出了PSA復(fù)發(fā)。所有后續(xù)上的中位數(shù)為33個(gè)月，而無(wú)復(fù)發(fā)患者的后續(xù)中位數(shù)為39個(gè)月。進(jìn)行ANXA3-—元分析，我們顯示，較之ANXA3陽(yáng)性腫瘤而言，ANXA3染色陰性與顯著降低的無(wú)PSA存活時(shí)間相關(guān)(p<0.0001)。在關(guān)于染色模式方面對(duì)ANXA3陽(yáng)性腫瘤的亞分析能進(jìn)一步將該組患者分入兩個(gè)預(yù)后相關(guān)亞組。較之尖部染色而言，在具有擴(kuò)散上皮染色的ANXA3陽(yáng)性腫瘤中，預(yù)后顯著更糟(對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)p-O.0013，圖3A)。除了組合使用良好建立的經(jīng)典預(yù)后參數(shù)PSA、Gleason級(jí)別和pT-分期之外，為進(jìn)一步研究ANXA3狀態(tài)是否有預(yù)后相關(guān)性，我們將我們的群體分入3個(gè)風(fēng)險(xiǎn)組。根據(jù)PSA1級(jí)別和分期，患者被分類(lèi)為進(jìn)展低風(fēng)險(xiǎn)、中等風(fēng)險(xiǎn)和高風(fēng)險(xiǎn)。在進(jìn)展低風(fēng)險(xiǎn)的那些人群中，外科手術(shù)前PSA為10ng/ml或更低，前列腺切除術(shù)標(biāo)本的Gleason分?jǐn)?shù)為6或更小，癌癥為器官局限性的。在進(jìn)展高風(fēng)險(xiǎn)的人群中，外科手術(shù)前PSA超過(guò)20ng/ml，前列腺切除術(shù)的Gleason分?jǐn)?shù)為7或更高，腫瘤分期為>pT3。不處于低風(fēng)險(xiǎn)或高風(fēng)險(xiǎn)的那些被分入中等風(fēng)險(xiǎn)組。如圖3B所示，風(fēng)險(xiǎn)類(lèi)別顯示了進(jìn)展的顯著不同風(fēng)險(xiǎn)(p".0001)。通過(guò)ANXA3狀態(tài)(陽(yáng)性對(duì)陰性)進(jìn)行的化學(xué)能將中等風(fēng)險(xiǎn)組(代表了最大的群體(n-922))分為高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)亞組(P-0.0001)。在低風(fēng)險(xiǎn)或高風(fēng)險(xiǎn)組中不能定義亞組(表3)。對(duì)中等風(fēng)險(xiǎn)的Kaplan-Meier分析還顯示ANA3陰性患者的PSAPFS顯著降低(圖3C)。較之ANXA3陽(yáng)性胂瘤而言，ANXA3染色陰性與顯著降低的無(wú)PSA存活時(shí)間相關(guān)(p<0.0001，圖4A)。然而，針對(duì)染色分?jǐn)?shù)(弱對(duì)中等對(duì)強(qiáng))對(duì)ANXA3陽(yáng)性癌癥的劃分沒(méi)能顯示預(yù)后相關(guān)亞組(對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)，p-0.642，數(shù)據(jù)未示出)。除ANXA3染色(陰性對(duì)陽(yáng)性)之外，一元分析還顯示了針對(duì)已經(jīng)建立的預(yù)后因子(Gleason分?jǐn)?shù)、pT分期和外科手術(shù)前的PSA血清水平)的預(yù)后顯著性(p<0.0001，圖4B-D)。我們繼續(xù)測(cè)試了癌癥患者中抗ANXA3自身免疫性的可能性，這通過(guò)在夾心ELISA中針對(duì)針對(duì)重組ANXA3的免疫反應(yīng)活性篩選患者血清來(lái)進(jìn)行。對(duì)照包括ANXA5、MCV1Ana,有及沒(méi)有磷酸絲氨酸包覆。事實(shí)上，我們?cè)谝恍┣傲邢侔┌Y患者中發(fā)現(xiàn)了非常高且特異性的抗ANXA3效價(jià)。如圖4所示，這些患者之一的多克隆血清對(duì)重組ANXA3，來(lái)自前列腺癌癥細(xì)胞系(PC3細(xì)胞)的天然ANXA3染色(較之用相應(yīng)的單克隆抗ANXA3抗體染色而言)。從該患者的全血分離B細(xì)胞，使用我們的特異性單克隆抗體，重組ANXA3和PC3細(xì)胞提取物作為陽(yáng)性對(duì)照，我們能分離和培養(yǎng)相應(yīng)的生產(chǎn)抗ANXA3抗體的B-細(xì)胞克隆，并由此繼續(xù)分離和培養(yǎng)人單克隆抗ANXA3抗體。圖5顯示了相應(yīng)的Western印跡雜交。3.討論ANXA3在從良性到惡性前列腺上皮轉(zhuǎn)變期間的定位和細(xì)胞內(nèi)分布的持續(xù)改變及其預(yù)后顯著性表明了ANXA3在前列腺組織生物學(xué)中的重要地位。分泌的ANXA3在前列腺的細(xì)胞外區(qū)室中的存在(符合報(bào)導(dǎo)的蛋白在外來(lái)體/前列腺小體中的存在(2)和提出的這些嚢泡的抗癌癥作用(4))讓我們測(cè)試了ANXA3是否可被前列腺癌癥患者的PC3細(xì)胞提取物或尿中的抗體所獲取。FACS分析確實(shí)顯示，ANXA3是潛在的抗原性表面蛋白(數(shù)據(jù)未示出)。篩選來(lái)自癌癥和BPH患者的血清(來(lái)自大規(guī)模的臨床研究，以評(píng)價(jià)ANXA3的診斷價(jià)值)，我們?cè)谝恍〗M癌癥患者中發(fā)現(xiàn)了自身抗體，并分離出了產(chǎn)生抗ANXA3抗體的B細(xì)胞的相應(yīng)克隆。在目前針對(duì)早期前列腺癌癥檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)生物標(biāo)記物(PSA)的缺陷的背景上(8、9)，考慮到使用活檢或完全前列腺切除術(shù)后的標(biāo)本進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的困難決定性(10、11)，ANXA3提供了綜合診斷蛋白生物標(biāo)記的潛力。ANXA3的關(guān)鍵特征之一是細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外分布和定位使得不僅能在體液中進(jìn)行穩(wěn)定的、非侵入性的檢測(cè)以用于前列腺癌癥的早期檢測(cè)，并且還可反映DM/RM分析物(基本上僅可檢測(cè)總ANXA3的替代物)所無(wú)法反映出的腫瘤生物學(xué)的重要方面。我們的結(jié)果與BPH1的前列腺上皮分泌的ANXA3(可能在外來(lái)體/前列腺小體中)的抗癌和保護(hù)性作用一致，ANXA3在BPH經(jīng)過(guò)PIN到Gleason分?jǐn)?shù)更高的前列腺癌癥的前列腺轉(zhuǎn)化期間逐漸丟失。外來(lái)體ANXA3的降低是由于調(diào)控性T-細(xì)胞在進(jìn)展期癌癥中誘發(fā)的自身免疫機(jī)制(針對(duì)細(xì)胞外前列腺小體的表面抗體)導(dǎo)致的。中等風(fēng)險(xiǎn)組的大群患者首次得以被進(jìn)一步分類(lèi)，未來(lái)繼續(xù)基于ANXA3的前列腺癌癥進(jìn)展預(yù)測(cè)是人們很有興趣的。鑒于ANXA3在前列腺癌癥中的這種分子背景(7)，又暗示了其在向癌性階段的前列腺轉(zhuǎn)化的免疫調(diào)控中的作用，以及ANXA3在膜轉(zhuǎn)運(yùn)(membranetrafficking)、淋巴細(xì)胞移動(dòng)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用(12)，其在外來(lái)體(2)和前列腺小體(3)中的存在是特別有興趣的。前列腺小體被認(rèn)為能調(diào)控先天的免疫系統(tǒng)(14,15)，并且近來(lái)還與前列腺癌癥的不同階段相關(guān)聯(lián)(l5，16)。將組織和尿AMA3關(guān)聯(lián)起來(lái)還可進(jìn)一步協(xié)助理解癌癥相關(guān)的ANXA3定位和釋放的動(dòng)力學(xué)。有這種可能性本文所述的對(duì)作為針對(duì)前列腺癌癥標(biāo)記物的ANXA3進(jìn)行的研究具有更普遍的牽連，因?yàn)橛袃善浅＝鼇?lái)的報(bào)道發(fā)現(xiàn)ANXA3是針對(duì)卵巢透明細(xì)胞腺癌(17)和結(jié)直腸癌(18、19)的負(fù)相關(guān)標(biāo)記物，類(lèi)似于我們的研究。因此，ANXA3釋放針對(duì)上皮腺癌起到普遍性的癌癥相關(guān)作用這一假設(shè)值得更多的注意力。ANXA3染色陰性在前列腺癌癥中作為獨(dú)立預(yù)后因子代表了我們的研究得最為重要的發(fā)現(xiàn)。AMA3染色陰性揭示了在根治性前列腺切除術(shù)后進(jìn)展高風(fēng)險(xiǎn)的前列腺癌癥的生物攻擊性亞組。總之，ANXA3代表了有前途的候選組織標(biāo)記物，當(dāng)與標(biāo)準(zhǔn)預(yù)后參數(shù)組合時(shí)，其能在個(gè)體患者中提供更為精確的預(yù)后預(yù)測(cè)，因此有助于未來(lái)患者管理。表<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表2:AMA3染色與pT-分期、Gleason分?jǐn)?shù)(GS)和PSA的關(guān)聯(lián)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表3:根據(jù)ANXA3的狀態(tài)，風(fēng)險(xiǎn)劃分，將患者分為進(jìn)展低風(fēng)險(xiǎn)、中等風(fēng)險(xiǎn)和高風(fēng)險(xiǎn)，示出了生物化學(xué)復(fù)發(fā)速率參考文獻(xiàn)1-W.Woznyetal.，Proteomics.7,313(2007).2.T.Pisitkun，R.F.Shen，M.A.Knepper，ProcNatlAcadSciUSA101，13368(2004).3.S.Keller,M.P.Sanderson,A.Stoeck，P.Altevogt，Immunol.Lett.107，102(2006).4，Y.Yangetal.，JCancerRes.Clin.Oncol.(2007).5.M.Schostak，A.Schrattenholz，submitted(2007).6.A.Larssonetal，Urol.Oncol.24，195(2006).7.M.Miyara,S.Sakaguchi，TrendsMol.Med.(2007).8.G.Zhou，H.I.Levitsky，JImmunol.178，2155(2007).9.A.W.Roddametal.，Eur.Urol.48，386(2005).10.A.Stameyetal.，JUrol.172，1297(2004).11.M.Aminetal.，Scand.JUrol.Nephrol.Suppl20(2005).12.J.I.Epsteinetal.，Scand.JUrol.Nephrol.SupplZA(2005).13.V.Gerke，C.E.Creutz，S.E.Moss,Nat.Rev.Mol.CellBiol.6，449(2005).14.F.G.Kravetsetal.，Prostate43，169(2000).15.J.Radons,G.Multhoff,Exerc.Immunol.Rev.11，17(2005).16.N.E.Schartz,N.Chaput，F(xiàn).Andre,L.Zitvogel,Curr.Opin.Mol.Ther.4,372(2002).17.A.J.Abusamraetal，BloodCellsMol.Dis.35，169(2005).18.A.Moritaetal，Proteomics.(2006).19.P.Alfonsoetal，Proteomics.5，2602(2005).20.J.Madoz-Gurpideetal.，Mol.CellProteomics.5，1471(2006).權(quán)利要求1.診斷癌癥的方法，其中，針對(duì)膜聯(lián)蛋白A3的細(xì)胞內(nèi)分布對(duì)樣品加以分析。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述癌癥是泌尿生殖和/或胃腸道的癌癥。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述癌癥是上皮癌癥。4.權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的方法，其中所述癌癥是前列腺癌。5.權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)的方法，其中所述試劑是抗體。6.權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。7.權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)的方法，其是組織化學(xué)流程。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述樣品是組織樣品，特別是活檢樣時(shí)09.權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)的方法，其中在上皮細(xì)胞，特別是在前列腺上皮細(xì)胞中測(cè)定所述膜聯(lián)蛋白A3的細(xì)胞內(nèi)分布。10.權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)的方法，其包括對(duì)選自下述的疾病階段進(jìn)行區(qū)分性診斷(i)良性病況，(ii)癌前病況，和(iii)惡性病況。11.權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)的方法，其中還測(cè)定至少一種另外的標(biāo)記物。12.權(quán)利要求ll的方法，其中所述另外的標(biāo)記物是前列腺特異性抗原(PSA)和/或前列腺特異性膜抗原(PSMA)。13.權(quán)利要求1-12中任意一項(xiàng)的方法，其中測(cè)定其它針對(duì)膜聯(lián)蛋白A3的自身抗體。14.診斷癌癥特別是前列腺癌癥的方法，其中，針對(duì)膜聯(lián)蛋白A3的存在、含量和/或細(xì)胞內(nèi)分布以及針對(duì)針對(duì)膜聯(lián)蛋白A3的自身免疫應(yīng)答，對(duì)樣品，例如組織或體液樣品，加以分析，其中，優(yōu)選地，通過(guò)針對(duì)膜聯(lián)蛋白A3和/或前列腺小體/外來(lái)體的自身抗體的存在或通過(guò)ANXA3陽(yáng)性調(diào)控性T-細(xì)胞的存在來(lái)表征所述自身免疫應(yīng)答。15.診斷癌癥特別是前列腺癌癥的方法，其中，針對(duì)針對(duì)膜聯(lián)蛋白A3的抗體的存在和/或含量以及任選地針對(duì)調(diào)控性T-細(xì)胞的存在和/或含量來(lái)分析樣品。16.權(quán)利要求1-15中任意一項(xiàng)的方法，其中，膜聯(lián)蛋白A3的不存在指示前列腺癌的攻擊性亞組，特別是手術(shù)后進(jìn)展高風(fēng)險(xiǎn)的亞組。17.對(duì)已被分類(lèi)為前列腺癌癥發(fā)展中等風(fēng)險(xiǎn)的受試者進(jìn)行劃分的方法，其中，針對(duì)膜聯(lián)蛋白A3的存在和/或含量來(lái)分析來(lái)自所述受試者的樣品。18.診斷癌癥的測(cè)試試劑，其中包含(i)測(cè)定膜聯(lián)蛋白A3的試劑，以及(ii)測(cè)定針對(duì)膜聯(lián)蛋白A3的自身抗體的試劑和/或測(cè)定調(diào)控性T-細(xì)胞的試劑。19.權(quán)利要求18的試劑，用于診斷前列腺癌癥。20.用于診斷前列腺癌癥的測(cè)試試劑，其中包含用于測(cè)定針對(duì)膜聯(lián)蛋白A3的自身抗體的試劑。全文摘要本發(fā)明涉及診斷前列腺癌的方法，所述方法包括用特定試劑測(cè)定膜聯(lián)蛋白A3(ANXA3)和/或針對(duì)ANXA3的自身抗體。本發(fā)明允許對(duì)良性、癌前和惡性病況加以區(qū)分。此外，所述方法具有預(yù)后相關(guān)性。文檔編號(hào)G01N33/574GK101669032SQ200880011783公開(kāi)日2010年3月10日申請(qǐng)日期2008年4月9日優(yōu)先權(quán)日2007年4月12日發(fā)明者A·施拉滕赫爾茲申請(qǐng)人:普羅迪奧塞斯股份公司