專利名稱：：抗人α9整聯(lián)蛋白抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及特異性識別人a9整聯(lián)蛋白的抗體(尤其是單克隆抗體)、嵌合抗體、人源化抗體和人抗體(humanantibody);產(chǎn)生前述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)力包；前述單克隆抗體的制備方法；前述雜交瘤細(xì)胞的制備方法；含有前述抗人a9整聯(lián)蛋白抗體的治療劑；含有前述人a9整聯(lián)蛋白抗體的診斷試劑；抑制人a9整聯(lián)蛋白的活性的化合物的篩選方法等。
背景技術(shù)：
：生物體中，維持生命現(xiàn)象的最小功能單位為細(xì)胞，具有相同功能的細(xì)胞聚集在一起構(gòu)成組織，各種組織聚集并協(xié)同而形成具有一定功能的器官，作為整體進(jìn)行協(xié)調(diào)統(tǒng)一的生命活動(dòng)。多數(shù)組織基本由細(xì)胞和胞外基質(zhì)構(gòu)成，通過黏附細(xì)胞和胞外基質(zhì)的細(xì)胞-胞外基質(zhì)間勦附、以及細(xì)胞間黏附而維持構(gòu)造。就胞外基質(zhì)而言，一直以來認(rèn)為其沒有生物活性，只是一種填充物，實(shí)際上，現(xiàn)已逐漸清楚其在幾乎所有的組織中起重要的作用?，F(xiàn)在已經(jīng)了解了細(xì)胞和胞外基質(zhì)間翁附活性，提示其不僅起細(xì)胞的立足點(diǎn)的作用，還與各種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)和維持組織、器官的恒常性有關(guān)，已認(rèn)識到其重要性。連結(jié)細(xì)胞和胞外基質(zhì)的#占附通過整聯(lián)蛋白所代表的跨膜細(xì)胞l占附蛋白而進(jìn)行。整聯(lián)蛋白構(gòu)成為a鏈和p鏈l:l的異二聚體，迄今為止已發(fā)現(xiàn)18種a鏈，8種p鏈，已鑒定至少24種它們的組合。已知各整聯(lián)蛋白分別識別特異的胞外基質(zhì)(配體)。而且，還逐漸了解了含有整聯(lián)蛋白的跨膜細(xì)胞翁附蛋白質(zhì)的作用不僅在于細(xì)胞和胞外基質(zhì)的黏附、固定，而且還將來自于胞外基質(zhì)的信息轉(zhuǎn)換為細(xì)胞內(nèi)信號，承擔(dān)細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞死亡、分化等的調(diào)節(jié)。整聯(lián)蛋白根據(jù)配體的特異性和功能被分類為亞家族，被分為膠原受體、層粘連蛋白受體、識別纖連蛋白和玻連蛋白等中包含的Arg-Gly-Asp(RGD)序列的RGD受體、只存在于白細(xì)胞中的白細(xì)胞特異性受體(HynesRO.2002.Integrins:Bidirectional,AllostericSignalingMachines.Cell110:673-87;MiyasakaM.2000.NeweditionofAdhesionMoleculehandbook.Shuj畫ya.)。a4和a9整聯(lián)蛋白是不屬于上述任何一個(gè)的亞家族，一皮稱為a4整聯(lián)蛋白亞家族(EliseL.Palmer,CurzioRfiegg，RonaldFerrando,RobertPytela，SheppardD.1993.SequenceandTissueDistributionoftheIntegrina9Subunit,aNovelPartnerof131ThatIsWidelyDistributedinEpitheliaandMuscle.TheJournalofCellBiology123:1289-97)。作為胞外基質(zhì)(ECM)—種的骨橋蛋白(osteopontin;以下簡稱為OPN)是分子量約41kDa的分泌型磷酸化酸性糖蛋白，是在乳汁、尿、腎小管、破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、活化T細(xì)胞、肺瘤組織等中可見到廣泛表達(dá)的分子。分子中央部位具有細(xì)胞黏附序列GRGDS，且在人OPN中具有SVVYGLR序列，在小鼠OPN中具有SLAYGLR序列，緊隨其后具有凝血酶酶切位點(diǎn)，通過GRGDS序列與RGD受體的整聯(lián)蛋白翁附，通過SVVYGLR序列或SLAYGLR序列與a4(a4pi)和a9(a9(31)整聯(lián)蛋白翁附。研究發(fā)現(xiàn)，a4pl與未被凝血酶切斷的OPN(非切斷型OPN)和被凝血酶切斷的N末端片段(切斷型OPN)這兩者結(jié)合，而a9pl只與切斷型OPN結(jié)合，二者存在這種模式上的差異(Y.Yokosakietal"(1999)TheJournalofBiologicalChemistry274，36328-36334;P.M.Greenetal.,(2001)FEBSLetters503,75-79;S.T.Barryetal"(2000)ExperimentalCellResearch258，342-351)。a4和a9整聯(lián)蛋白除了OPN以夕卜還具有許多共同的配體。已知有纖連蛋白的EDA部位、前肽-馮維勒布蘭德因子(pp-vWF)、組織型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tTG)、第XIII凝血因子和血管細(xì)胞翁附分子-l(VCAM-1)等。而且，作為a4整聯(lián)蛋白特異性識別的配體，已知有纖連蛋白的CS-l結(jié)構(gòu)域、MadCAM-1(a4卩7)等。作為a9整聯(lián)蛋白特異性識別的配體，已知有腱生蛋白C、纖溶酶等。a4、a9整聯(lián)蛋白以及(31的整聯(lián)蛋白亞單位的氨基酸序列是公知的，登錄在GenBank上。而且，已知這些整聯(lián)蛋白的氨基酸序列在種間相似性很高。WO02/081522中公開了利用OPN缺失小鼠或使用OPN的中和抗體以抑制OPN功能時(shí)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、肝炎的治療效果。而且，在該公報(bào)中還公開了作為a4整聯(lián)蛋白、a9整聯(lián)蛋白的識別序列的SVVYGLR序列對于炎癥性疾病發(fā)病十分重要，OPN的受體在免疫活性細(xì)胞等中表達(dá)，與炎癥性疾病相關(guān)。
發(fā)明內(nèi)容目前，已知有許多種癌、炎癥性疾病、傳染病、自身免疫性疾病和骨病的治療藥，希望開發(fā)出具有進(jìn)一步改善的治療效果的癌、炎癥性疾病、傳染病、自身免疫性疾病和骨病的預(yù)防藥和/或治療藥等。因此，本發(fā)明人著眼于整聯(lián)蛋白、尤其是a9整聯(lián)蛋白，進(jìn)行了各種研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ot9整聯(lián)蛋白的特異性抑制抗體具有癌抑制效果、抗炎效果，從而完成本發(fā)明。也就是說，具體而言，本發(fā)明提供以下所述的抗人(X9整聯(lián)蛋白抗體，產(chǎn)生其的細(xì)胞，含有前述抗體的治療劑，抑制ot9整聯(lián)蛋白活性的化合物的篩選方法等。(1)一種抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，其識別選自于序列號l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的氨基酸序列中的l個(gè)以上氨基酸序列。(2)—種抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，其重鏈的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDRH)中的CDRH1為序列號16、17、18、19或41的氨基酸序列，CDRH2為序列號20、21、22、23或42的氨基酸序列，CDRH3為序列號24、25、26、27或43的氨基酸序列，輕鏈的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDRL)中的CDRL1為序列號28、29、30、31或44的氨基酸序列，CDRL2為序列號32、33、34、35或45的氨基酸序列，CDRL3為序列號36、37、38、39或46的氨基酸序列。(3)—種抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，其具有含有序列號16、20、24、28、32或36的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)中的至少一個(gè)。(4)一種抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，其具有含有序列號16、20、24、28、32或36的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)的全部。(5)—種抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，其具有含有序列號17、21、25、29、33或37的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)中的至少一個(gè)o(6)—種抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，其具有含有序列號17、21、25、29、33或37的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)的全部。(7)—種抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，其具有含有序列號18、22、26、30、34或38的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)中的至少一個(gè)。(8)—種抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，其具有含有序列號18、22、26、30、34或38的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)的全部。(9)一種抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，其具有含有序列號19、23、27、31、35或39的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)中的至少一個(gè)。(10)—種抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，其具有含有序列號19、23、27、31、35或39的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)的全部。(11)一種抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，其具有含有序列號41、42、43、44、45或46的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)中的至少一個(gè)。(12)—種抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，其具有含有序列號41、42、43、44、45或46的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)的全部。(13)根據(jù)上述(1)~(12)所述的抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，其抑制人a9整聯(lián)蛋白與a9整聯(lián)蛋白的配體的結(jié)合。(14)根據(jù)上述(1)~(13)任意一項(xiàng)所述的抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，其由保藏號FERMBP-10510、FERMBP-10511、FERMBP-10512、FERMBP-10513或FERMBP-10832標(biāo)示的雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生。(15)根據(jù)上述(1)~(14)任意一項(xiàng)所述的抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，其為單克隆抗體。(16)根據(jù)上述(1)~(13)任意一項(xiàng)所述的抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，其為嵌合抗體。(17)根據(jù)上述(1)~(13)任意一項(xiàng)所述的抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，其為人源化抗體。(18)根據(jù)上述(1)~(13)任意一項(xiàng)所述的抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，其為人抗體。(19)一種癌、炎癥性疾病、傳染病、自身免疫性疾病或骨病的治療劑，其含有上述(l)~(18)任意一項(xiàng)所述的抗人a9整聯(lián)蛋白抗體作為有效成分。(20)—種癌、炎癥性疾病、傳染病、自身免疫性疾病或骨病的治療劑，其含有上述(l)~(18)任意一項(xiàng)所述的抗人a9整聯(lián)蛋白抗體和抗人a4整聯(lián)蛋白抗體兩者作為有效成分。(21)—種癌、炎癥性疾病、傳染病、自身免疫性疾病或骨病的診斷試劑，其含有上述(l)~U8)任意一項(xiàng)所述的抗人a9整聯(lián)蛋白抗體作為有效成分。(22)—種抑制a9整聯(lián)蛋白的活性的化合物的篩選方法，其特征在于，使用含有選自于序列號1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的氨基酸序列中的1個(gè)以上氨基酸序列的肽。發(fā)明效果本發(fā)明的抗體通過抑制a9整聯(lián)蛋白功能，來發(fā)揮對癌(例如癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移)、炎癥性疾病(例如關(guān)節(jié)風(fēng)濕病、骨關(guān)節(jié)炎、肝炎、支氣管。孝喘、纖維癥、糖尿病、動(dòng)脈硬化、多發(fā)性硬化癥、炎性腸病(潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病))、傳染病(例如肝炎)、自身免疫性疾病(例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性肌炎、自身免疫性曱狀腺疾病、腎小管間質(zhì)性腎炎、重癥肌無力癥)和骨病(例如骨質(zhì)疏松癥)等的治療效果。而且，含有本發(fā)明的抗a9整聯(lián)蛋白抗體和抗a4整聯(lián)蛋白抗體兩者的醫(yī)藥組合物發(fā)揮進(jìn)一步改善的癌、炎癥性疾病等的治療效果。由于本發(fā)明的抗體可以在病理學(xué)上4企測出a9整聯(lián)蛋白在細(xì)胞、組織中的表達(dá)，因此還可以作為診斷藥使用。圖1(圖l-l和l-2)是表示分析抗人a9整聯(lián)蛋白抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)的結(jié)果的圖。圖2是表示通過人a9整聯(lián)蛋白表達(dá)細(xì)胞研究抗人a9整聯(lián)蛋白抗體5個(gè)克隆的細(xì)胞翁附抑制效果的結(jié)果的圖。圖3是表示使抗人a9整聯(lián)蛋白抗體與抗人a4整聯(lián)蛋白抗體共存時(shí)的癌細(xì)胞(人黑色素瘤細(xì)胞)的細(xì)胞祐附抑制效果的圖。圖4是表示抗小鼠a9整聯(lián)蛋白抗體在風(fēng)濕病病理模型中的風(fēng)濕治療效果的圖。圖5是表示通過小鼠關(guān)節(jié)炎模型研究抗小鼠a9整聯(lián)蛋白抗體的關(guān)節(jié)炎治療效果的結(jié)果的圖。圖6表示由抗小鼠a9整聯(lián)蛋白抗體產(chǎn)生的關(guān)節(jié)炎抑制的圖像。圖7是表示對抗a9整聯(lián)蛋白抗體在關(guān)節(jié)炎發(fā)病后的治療效果進(jìn)行研究的結(jié)果的圖。圖8是表示為了研究抗小鼠a9整聯(lián)蛋白抗體在關(guān)節(jié)炎發(fā)病后的治療效果中的作用才幾制，通過PCR測定關(guān)節(jié)部位的細(xì)胞因子的變化量的研究結(jié)果的圖。圖9是表示為了研究小鼠關(guān)節(jié)炎模型中Thl7的影響，測定小鼠腹股溝淋巴結(jié)的IL-17和RORYt的表達(dá)的結(jié)果的圖。具體實(shí)施例方式ii[發(fā)明的詳細(xì)內(nèi)容]2004年11月，BiogenldecInc.,(美國馬薩諸塞州)和ElanCorporation(愛爾蘭)的、作為a4整聯(lián)蛋白抗體的Tysabri(注冊商標(biāo))(natalizumab)作為多發(fā)性硬化癥治療藥獲得美國食品醫(yī)藥品局(FDA)批準(zhǔn)。而且，Tysab弁ri(注冊商標(biāo))正以克羅恩病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病為對象進(jìn)行臨床開發(fā)。另夕卜，被稱為P4C2的抗人a4pi整聯(lián)蛋白單克隆抗體得到實(shí)驗(yàn)室水平的應(yīng)用。但是，a9整聯(lián)蛋白的抗體中，對人和豚鼠的a9整聯(lián)蛋白顯示出特異性的被稱為Y9A2的單克隆抗體(A.Wangetal，(1996)Am.J.Respir.,CellMol.Biol.15、664-672)雖已供于實(shí)驗(yàn)用途但未用于臨床。本發(fā)明中，通過注意以下方面并進(jìn)一步開展，可以獲得與人的a9整聯(lián)蛋白特異性反應(yīng)的抗體。(1)人a9整聯(lián)蛋白過度表達(dá)抹的制備為了制備a9整聯(lián)蛋白的抗體，向倉鼠的卵巢來源的細(xì)胞CHO-Kl細(xì)胞導(dǎo)入基因，建立過度表達(dá)人a9整聯(lián)蛋白的細(xì)胞才朱，以該細(xì)胞作為抗原，免疫小鼠。(2)雜交瘤的篩選為了從通過細(xì)胞融合獲得的各種雜交瘤中高效獲得只與人a9整聯(lián)蛋白反應(yīng)的克隆，使用在CHO-Kl細(xì)胞中表達(dá)同屬于整聯(lián)蛋白家族的人a4整聯(lián)蛋白的細(xì)胞，選擇出與其它整聯(lián)蛋白不顯示交差反應(yīng)性、與親細(xì)胞(CHO-K1)的細(xì)胞表面抗原不反應(yīng)的克隆，由此有效地獲得了與人a9整聯(lián)蛋白特異性反應(yīng)的抑制抗體。本發(fā)明提供一種人a9整聯(lián)蛋白的單克隆抗體。本發(fā)明中，所謂"抗體"是指可以與作為抗原的a9整聯(lián)蛋白或其部分肽結(jié)合的抗體分子整體或其片段(例如、Fab、Fab'、F(ab')2等片段)，可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體。在本發(fā)明中優(yōu)選是指單克隆抗體。而且，本發(fā)明中"抗體"包括嵌合抗體、人源化抗體、人抗體。本發(fā)明中，"單克隆抗體"是指對于抗原高度特異，識別單一抗原的抗體。本發(fā)明中，所謂"抗體片段"是指全長抗體的一部分，其為抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)。例如，抗體片段包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段。這些抗體片段可以通過抗體的木瓜蛋白酶消化、胃蛋白酶消化等一般公知的方法制備。上述所謂"嵌合抗體"是指通過基因工程方法將本發(fā)明中獲得的抗人a9整聯(lián)蛋白抗體的恒定區(qū)改造成具有與人的抗體相同的恒定區(qū)的人.小鼠.嵌合抗體(參照歐州專利公開公報(bào)EP0125023)。所謂"人源化抗體"是指通過基因工程方法將本發(fā)明中獲得的抗人a9整聯(lián)蛋白抗體的H鏈和L鏈的互補(bǔ)性決定區(qū)域以外的一級結(jié)構(gòu)改造成對應(yīng)于人的抗體的一級結(jié)構(gòu)的抗體。所謂"人抗體"是指使用導(dǎo)入了與人抗體產(chǎn)生相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備的單克隆抗體(參照歐州專利公開公報(bào)EP0546073)。更具體而言，本發(fā)明首先提供了識別選自于序列號l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的氨基酸序列的1個(gè)以上氨基酸序列的抗人a9整聯(lián)蛋白抗體。本發(fā)明的優(yōu)選方式的抗體識別選自于序列號l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的氨基酸序列中的2個(gè)以上、3個(gè)以上、4個(gè)以上、5個(gè)以上或6個(gè)氨基酸序列。本發(fā)明的優(yōu)選抗體特異性識別如下的氨基酸序列(1)序列號2、序列號5、序列號7、序列號8、序列號IO、和序列號ll的氨基酸序列；(2)序列號5;(3)序歹'J號7;(4)序列號1、序列號5、序列號6、序列號7和序列號13的氨基酸序列；(5)序列號5、序列號7、序列號10和序列號13的氨基酸序列；(6)序歹'J號2、序列號5、序列號7、序列號8和序列號15的氨基酸序列；(7)序列號5、序列號7、序列號10和序列號13;(8)序列號11的氨基酸序列。此外，本發(fā)明的優(yōu)選方式的抗體具有含有序列號16、20、24、28、32或36的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)中的至少一個(gè)。更優(yōu)選的抗體是具有含有序列號16、20、24、28、32或36的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)中的2個(gè)以上、3個(gè)以上、4個(gè)以上、5個(gè)以上或6個(gè)的抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，特別優(yōu)選的抗體含有如下的氨基酸序列(l)序列號16、序列號20、序列號24和序列號36的氨基酸序列；(2)序列號16、序列號20和序列號24的氨基酸序列；(3)序歹'J號28、序列號32和序列號36的氨基酸序列；(4)序列號20和序列號24的氨基酸序列；或(5)序列號24和序列號36的氨基酸序列。此外，本發(fā)明的其它方式的抗體具有含有序列號17、21、25、29、33或37的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)中的至少一個(gè)。更優(yōu)選的抗體是具有含有序列號17、21、25、29、33或37的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)中的2個(gè)以上、3個(gè)以上、4個(gè)以上、5個(gè)以上或6個(gè)的抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，特別優(yōu)選的抗體含有如下的氨基酸序列(l)序列號17、序列號21、序列號25和序列號37的氨基酸序列；(2)序列號17、序列號21和序列號25的氨基酸序列；(3)序列號29、序列號33和序列號37的氨基酸序列；(4)序列號21和序列號25的氨基酸序列；或(5)序列號25和序列號37的氨基酸序列。此外，本發(fā)明的其它方式的抗體具有含有序列號18、22、1426、30、34或38的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)中的至少一個(gè)。更優(yōu)選的抗體是具有含有序列號18、22、26、30、34或38的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)中的2個(gè)以上、3個(gè)以上、4個(gè)以上、5個(gè)以上或6個(gè)的抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，特別優(yōu)選的抗體含有如下的氨基酸序列(l)序列號18、序列號22、序列號26和序列號38的氨基酸序列；(2)序列號18、序列號22和序列號26的氨基酸序列；(3)序列號30、序列號34和序列號38的氨基酸序列；(4)序列號22和序列號26的氨基酸序列；或(5)序列號26和序列號38的氨基酸序列。此外，本發(fā)明的其它方式的抗體具有含有序列號19、23、27、31、35或39的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)中的至少一個(gè)。更優(yōu)選的抗體是具有含有序列號19、23、27、31、35或39的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)中的2個(gè)以上、3個(gè)以上、4個(gè)以上、5個(gè)以上或6個(gè)的抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，特別優(yōu)選的抗體含有如下的氨基酸序列(l)序列號19、序列號23、序列號27和序列號39的氨基酸序列；(2)序列號19、序列號23和序列號27的氨基酸序列；(3)序列號31、序列號35和序列號39的氨基酸序列；(4)序列號23和序列號27的氨基酸序列；或(5)序列號27和序列號39的氨基酸序列。此外，本發(fā)明的其它方式的抗體具有含有序列號41、42、43、44、45或46的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)中的至少一個(gè)。更優(yōu)選的抗體是具有含有序列號41、42、43、44、45或46的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)中的2個(gè)以上、3個(gè)以上、4個(gè)以上、5個(gè)以上或6個(gè)的抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，特別優(yōu)選的抗體含有如下的氨基酸序列(l)序列號41、序列號42、序列號43和序列號46的氨基酸序列；(2)序列號41、序列號42和序列號43的氨基酸序列；(3)序列號44、序列號45和序列號46的氨基酸序列；(4)序列號42和序列號43的氨基酸序列；或(5)序列號43和序列號46的氨基酸序列。本發(fā)明中，特別優(yōu)選的抗體是由保藏號FERMBP-10510、FERMBP-10511、FERMBP-10512、FERMBP-10513或FERMBP-10832標(biāo)示的雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的抗人a9整聯(lián)蛋白抗體。以下，對抗a9整聯(lián)蛋白單克隆抗體的制備進(jìn)行詳細(xì)說明，但該抗體的制備不限于此。本發(fā)明中，作為抗原使用的a9整聯(lián)蛋白可以是(l)來源于人和其它哺乳動(dòng)物的表達(dá)a9整聯(lián)蛋白的所有細(xì)胞或存在這些細(xì)胞的所有組織的蛋白質(zhì)，(2)將編碼a9整聯(lián)蛋白的基因DNA優(yōu)選cDNA導(dǎo)入細(xì)菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞等細(xì)胞林中并使之表達(dá)的重組蛋白質(zhì)；另外還可以是(3)合成蛋白質(zhì)。此外，本發(fā)明的a9整聯(lián)蛋白還包括與各種哺乳動(dòng)物的a9整聯(lián)蛋白的氨基酸序列、特別優(yōu)選與人a9整聯(lián)蛋白的氨基酸序列(序列號40)具有基本相同的氨基酸序列的多肽。這里所謂的"具有基本相同的氨基酸序列的多肽"是指只要是具有與天然型的a9整聯(lián)蛋白特別優(yōu)選人來源的a9整聯(lián)蛋白基本相同的生物學(xué)性質(zhì)即可，可以是具有該氨基酸序列中的多個(gè)氨基酸、優(yōu)選1至10個(gè)氨基酸、特別優(yōu)選l至多個(gè)(例如1至5個(gè)、l至4個(gè)、l至3個(gè)、l至2個(gè))氨基酸纟皮置換、缺失和/或被修飾的氨基酸序列的突變多肽和具有在該天然型的a9整聯(lián)蛋白特別優(yōu)選在人來源的a9整聯(lián)蛋白的氨基酸序列中添加了多個(gè)氨基酸優(yōu)選1至10個(gè)氨基酸、特別優(yōu)選l至多個(gè)(例如1至5個(gè)、l至4個(gè)、l至3個(gè)、l至2個(gè))氨基酸的氨基酸序列的突變多肽。此外，還可以是具有這種置換、缺失、修飾和添加中的多個(gè)的突變多肽。本發(fā)明的a9整聯(lián)蛋白，尤其是人來源的a9整聯(lián)蛋白，除了基因重組技術(shù)外，還可以通過適當(dāng)使用化學(xué)合成法，細(xì)胞培養(yǎng)法等本領(lǐng)域中公知的方法或其修飾方法來制備。而且，作為突變多肽的制備方法，可以例舉例如合成寡核苷酸介導(dǎo)的點(diǎn)突變法(缺口雙鏈(gappedduplex)法)、通過亞硝酸或亞碌l酸處理隨機(jī)地導(dǎo)入點(diǎn)突變的方法，通過Ba131酶等制備缺失突變體的方法、盒式突變(cassettemutagenesis)法、接頭分區(qū)裔變法、錯(cuò)誤摻入(missincorporation)法、錯(cuò)酉己引物(mismatchprimer)法、DNA片I殳合成法等。此外，本發(fā)明的a9整聯(lián)蛋白還包括該a9整聯(lián)蛋白的"一部分"。這里所謂的"一部分"，是含有用于與OPN、腱生蛋白-C、VCAM-1等a9整聯(lián)蛋白配體結(jié)合所必需的區(qū)域的部分，具體是指含有序列號1表示的氨基酸序列的第29位至第980位的部分。該ot9整聯(lián)蛋白的"一部分"，還可以按照后述的本領(lǐng)域中公知的方法或其修飾方法，通過基因重組技術(shù)或化學(xué)合成法進(jìn)行制備，此外還可以通過蛋白質(zhì)分解酶等將利用細(xì)胞培養(yǎng)法分離的a9整聯(lián)蛋白特別優(yōu)選人來源的a9整聯(lián)蛋白適當(dāng)切斷來制造。作為抗原，還可以使用通過重組技術(shù)在細(xì)胞膜上過度表達(dá)a9整聯(lián)蛋白的細(xì)胞自身或其膜部分等。本發(fā)明的a9整聯(lián)蛋白還包括具有與人a9整聯(lián)蛋白的氨基酸序列(序列號40)基本相同的氨基酸序列的多肽。作為具有與序列號40所示的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的多肽，具體可以例舉具有序列號1至15所示的氨基酸序列的人a9整聯(lián)蛋白。而且，在本發(fā)明中，優(yōu)選使用通過重組技術(shù)在細(xì)胞膜上過度表達(dá)人a9整聯(lián)蛋白的細(xì)胞自身。因此，還存在后述的、用公知的基因工程技術(shù)克隆編碼人a9整聯(lián)蛋白的基因(例如、cDNA),制備在細(xì)胞膜上過度表達(dá)人a9整聯(lián)蛋白的細(xì)胞自身或其細(xì)胞膜部分來作為抗原的情況。[抗體產(chǎn)生細(xì)胞的制備]還可以將抗原自身單獨(dú)地或與載體、稀釋劑一起給予至通過對被免疫的動(dòng)物給予而能夠產(chǎn)生抗體的部位。在給予時(shí)為了提高抗體產(chǎn)生能力，還可以給予弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑。給予通常每l~6周進(jìn)行1次，總計(jì)進(jìn)行210次左右。作為使用的溫血?jiǎng)游铮梢岳e例如小鼠、猴、兔、狗、豚鼠、大鼠、倉鼠、綿羊、山羊、雞等，本發(fā)明中優(yōu)選使用小鼠。治療的對象是人且產(chǎn)生a9整聯(lián)蛋白抑制抗體的動(dòng)物為小鼠時(shí)，最好使用人小鼠嵌合抗體或人源化抗體，此外最好使用導(dǎo)入了與抗體產(chǎn)生相關(guān)的人基因的小鼠等轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備的人單克隆抗體。作為骨髓瘤細(xì)胞，可以使用小鼠、大鼠、人等來源的細(xì)月包。例如小鼠骨髓瘤P3U1、P3X63-Ag8、P3X63-Ag8-Ul、P3NS卜Ag4、SP2/0-Ag14、P3X63-Ag8-653等，優(yōu)選抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞來源于同種動(dòng)物，特別優(yōu)選來源于同系統(tǒng)(samesystem)的動(dòng)物。骨髓瘤細(xì)胞可以冷凍保存，或通過用添加了馬、兔或胎牛血清的一般培養(yǎng)基進(jìn)行傳代而維持。細(xì)胞融合時(shí)優(yōu)選使用對數(shù)增殖期的細(xì)胞。本發(fā)明中優(yōu)選使用P3X63-Ag8-653。作為使抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合而形成雜交瘤的方法，可以例舉使用聚乙二醇(PEG)的方法、使用仙臺病毒的方法、使用電融合裝置的方法等。例如PEG法的情況時(shí)，可以以l~10:1、優(yōu)選5~10:1的混合比將脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞懸浮于含有約30~60%的PEG(平均分子量1000~6000)的適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基或緩沖液中，在溫度為約25~37°C,pH68的條件下，使之反應(yīng)約30秒~3分鐘左右。反應(yīng)結(jié)束后，除去PEG溶液，再懸浮于培養(yǎng)基中，接種于細(xì)胞孔板中，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。[雜交瘤細(xì)^^包的4兆選]產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的挑選，可以按照公知或基于7>知方法的方法來進(jìn)行。通常，可以用添加了HAT(次黃嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶脫氧核苷)的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)基來進(jìn)行。作為挑選和育種用培養(yǎng)基，可以使用雜交瘤細(xì)胞能夠生長的任意一種培養(yǎng)基。例如，可以使用含有l(wèi)~20%優(yōu)選10~20%的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基、含有1~10%的胎牛血清的GIT培養(yǎng)基(和光純藥工業(yè)(林))或雜交瘤培養(yǎng)用無血清培養(yǎng)基(SFM-101、日水制藥(林))等。培養(yǎng)溫度通常為2040。C、優(yōu)選為約37。C。培養(yǎng)時(shí)間通常為5天~3周、優(yōu)選為1周~2周。培養(yǎng)通?？梢栽?%(302下進(jìn)行。本發(fā)明的單克隆抗體的產(chǎn)生，可以使用記載于科學(xué)評論社1997年的《新臨床免疫實(shí)驗(yàn)操作法(第3部)》的細(xì)胞ELISA法進(jìn)行確認(rèn)和篩選。如果預(yù)測在篩選時(shí)使用免疫所使用的細(xì)胞則背景變高、假陽性增多時(shí)，可以將與不同于免疫中使用的細(xì)胞的細(xì)胞中過度表達(dá)的人a9整聯(lián)蛋白反應(yīng)、且與過量表達(dá)a4整聯(lián)蛋白的細(xì)胞不反應(yīng)的克隆作為抗人a9整聯(lián)蛋白抗體。對于這種克隆，通過重復(fù)進(jìn)行1至5次優(yōu)選2至4次的有限稀釋法，可以制備單克隆抗體。[抗體的分離純化]獲得的抗體可以進(jìn)行純化直至均勻?？贵w的分離、純化可使用通常蛋白質(zhì)所使用的分離、純化方法。例如，適當(dāng)選擇組合親合層析等層析柱、過濾、超濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電點(diǎn)電泳等，可以分離、純化抗體(Antibodies:ALaboratoryManual.EdHarlowandDavidLaneColdSpringHarborLaboratory,1988),^f旦不F艮于it匕。4乍為在親合層析中使用的柱，可以例舉蛋白A柱、蛋白G柱。例如，作為<吏用蛋白A柱的柱，可以例舉HyperD，POROS，SepharoseF.F.(AmershamBiosciences)等。[4元體的才示i己]可以使用公知的方法或市售的試劑盒對獲得的抗體進(jìn)行各種標(biāo)記(例如生物素標(biāo)記、FITC標(biāo)記、APC標(biāo)記)。本發(fā)明中優(yōu)選使用采用生物素標(biāo)記試劑盒(BiotinLabelingKit)(同仁化學(xué))的生物素標(biāo)記。這樣獲得的單克隆抗體，根據(jù)需要純化后，按照常規(guī)方法制劑化，可以作為癌、炎癥性疾病、傳染病、自身免疫性疾病和骨病等的預(yù)防和/或治療劑使用。作為這些預(yù)防和/或治療劑的劑型，可以制成注射劑、點(diǎn)滴用劑等非口服制劑，也可通過創(chuàng)意加工制成口服制劑來使用。而且，當(dāng)制劑化時(shí)，在藥事上和藥學(xué)允許的范圍內(nèi)，可以使用與劑型相應(yīng)的載體、稀釋劑或添加劑等。現(xiàn)在已逐漸了解整聯(lián)蛋白的作用不僅在于細(xì)胞和胞外基質(zhì)(ECM)的教附，固定，還承擔(dān)將來自于胞外基質(zhì)的信息轉(zhuǎn)換為細(xì)胞內(nèi)信號，承擔(dān)細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞死亡、分化等的調(diào)節(jié)。因此，獲得的單克隆抗體，由于可以通過抑制ECM與a9整聯(lián)蛋白的結(jié)合來阻斷來自于ECM的信息的細(xì)胞內(nèi)信號傳遞，因此可以治療與ECM相關(guān)的疾病。作為與a9整聯(lián)蛋白結(jié)合的ECM和a9配體，已知有OPN、纖連蛋白、前肽-馮維勒布蘭德因子(pp-vWF)、組織型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tTG)、第XIII凝血因子、血管細(xì)胞教附分子-1(VCAM-1)、腱生蛋白C、纖溶酶等。使用這些ECM和表達(dá)a9整聯(lián)蛋白的細(xì)胞、癌細(xì)胞，通過體外觀察在獲得的單克隆抗體存在下的結(jié)合抑制，可以發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的單克隆抗體的對象疾病。另一方面，在使用抗人a9整聯(lián)蛋白抗體作為人的治療用藥品時(shí)，確認(rèn)其效果所必需的、臨床前開發(fā)階段中的體內(nèi)的病理模型動(dòng)物無法確認(rèn)抗體對人的抗原的效果。也就是說，在進(jìn)行給予人以確認(rèn)治療效果的臨床試驗(yàn)之前，需要進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以確認(rèn)對對象疾病的治療效果。已知小鼠遺傳背景已明確的系統(tǒng)專交多，可以觀察與人基本相同的疾病的病理模型數(shù)量眾多，因此適于作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。但是，一般而言，抗體藥物是針對人的抗原的抗體，很少與小鼠的同一對象抗原呈現(xiàn)交差反應(yīng)，通過制備針對小鼠的對象抗原的抗體，使用其進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，可以觀察人使用抗體的藥理效果、推測用作臨床試驗(yàn)的給藥量、與對象抗原以外的反應(yīng)性、副作用的發(fā)生等，可以反映在人中的作用。具體而言，通過對病理模型小鼠給予抗小鼠a9整聯(lián)蛋白抗體，可明確抗人a9整聯(lián)蛋白抗體的對象疾病。含有本發(fā)明的單克隆抗體的醫(yī)藥組合物可以用作炎性疾病例如風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、肝炎、支氣管哮喘、纖維癥、糖尿病、癌轉(zhuǎn)移、動(dòng)脈硬化、多發(fā)性硬化癥、肉芽肺等的診斷試劑以及抑制器官移植后的慢性排斥反應(yīng)、系統(tǒng)性自身免疫疾病.紅斑狼瘡'葡萄膜炎'白塞病(Behcet'sdisease).多發(fā)性肌炎-系膜增殖性腎炎結(jié)節(jié)病等自身免疫疾病的診斷試劑。本發(fā)明的單克隆抗體由于能夠特異性識別a9整聯(lián)蛋白，因此可以用于待測液中的a9整聯(lián)蛋白的定量、尤其是通過夾層免疫測定法、竟?fàn)幏?、免疫測量法(immunometric)或散色比濁法(nephrometry)等進(jìn)行的定量等。當(dāng)這些免疫學(xué)的測定法應(yīng)用于本發(fā)明的測定方法時(shí)，不需要設(shè)定特別的條件、操作等?？梢栽诟鞣椒ǖ某Ｒ?guī)條件、操作方法基礎(chǔ)上再加上本領(lǐng)域技術(shù)人員通常的技術(shù)性考慮來構(gòu)建LLPL或其鹽的測定系統(tǒng)。這些常規(guī)技術(shù)手段的詳細(xì)內(nèi)容，可以參照總論、現(xiàn)有書籍等。如上所述，通過使用本發(fā)明的抗體，可以高敏感度地定量a9整聯(lián)蛋白。此外，通過利用使用本發(fā)明的抗體的、生物體內(nèi)的a9整聯(lián)蛋白的定量方法，可以進(jìn)行與a9整聯(lián)蛋白相關(guān)的各種疾病的診斷。例如，在檢測到a9整聯(lián)蛋白濃度的增減時(shí)，可以診斷為與a9整聯(lián)蛋白相關(guān)的疾病、例如炎癥性疾病的可能性高或者將來患這種病的可能性高。而且，本發(fā)明的單克隆抗體可用于特異性檢測存在于體液、組織等待測對象中的a9整聯(lián)蛋白。而且，還可以在用于純化a9整聯(lián)蛋白的抗體柱的制備、包含于純化時(shí)的各成分中的a9整聯(lián)蛋白的檢測、待測細(xì)胞內(nèi)a9整聯(lián)蛋白的行為的分析等中使用。通過利用本發(fā)明的抗體所識別的人a9整聯(lián)蛋白上的表位，可以篩選抑制人a9整聯(lián)蛋白活性的化合物。具體而言，本發(fā)明提供一種抑制人a9整聯(lián)蛋白活性的低分子化合物的篩選方法，其特征在于，使用含有選自于序列號l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的氨基酸序列中的l個(gè)以上氨基酸序列的多肽(以下，稱為"肽A")。作為肽A,優(yōu)選具有選自于序列號l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的氨基酸序列中的2個(gè)以上、3個(gè)以上、4個(gè)以上、5個(gè)以上、6個(gè)以上、7個(gè)以上、或8個(gè)氨基酸序列。肽A可以通過公知的合成法進(jìn)行合成。更優(yōu)選的肽A含有如下的氨基酸序列(1)序列號2、序列號5、序列號7、序列號8、序列號9、序列號IO、序列號11和序列號12的氨基酸序列；(2)序歹'J號5、序列號7、序列號8和序列號11的氨基酸序列；(3)序列號2、序列號3、序列號5、序列號8、序列號9、序列號ll、序列號12和序列號14的氨基酸序列；(4)序列號5、序列號7、序列號IO、序列號13和序列號14的氨基酸序列；(5)序列號1、序列號5、序列號6、序列號7和序列號13的氨基酸序列；(6)序列號10和序列號13的氨基酸序列或(7)序列號5和序列號7的氨基酸序列。在本發(fā)明的篩選方法中，例如，將(i)使肽A與人a9整聯(lián)蛋白的配體(例如、腱生蛋白C、纖溶酶等)接觸的情況與(ii)使肽A與配體和試驗(yàn)化合物接觸的情況進(jìn)行比較。工序(i)和(ii)的比較例如通過測定配體與肽A的結(jié)合量來進(jìn)行。為了容易地進(jìn)行這種結(jié)合量的比較，優(yōu)選使用已通過公知的方法標(biāo)記的配體。對于通過這種方法獲得的候選化合物，對是否抑制人a9整聯(lián)蛋白活性進(jìn)行確認(rèn)實(shí)驗(yàn)，從而獲得抑制人a9整聯(lián)蛋白活性的化合物。其中，作為待測物質(zhì)，可以使用多肽、蛋白質(zhì)、生物體來源的非肽化合物、合成化合物、微生物培養(yǎng)物、細(xì)胞提取液、植物提取液、動(dòng)物組織提取液等，可以是新化合物，也可以是/>知的化合物。所選擇的化合物與本發(fā)明的抗體一樣，可作為癌、炎癥性疾病、傳染病、自身免疫性疾病和骨病等的預(yù)防和/或治療劑使用。實(shí)施例以下通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更為詳細(xì)的說明，但這并不限定本發(fā)明的范圍。(實(shí)施例l)人a9整聯(lián)蛋白的抗體的制備，通過參考消減免疫(SubtractiveImmunization)法(WilliamsC.V.,StechmannC丄.，McLoonS.C.，Biotechniques.(1992)12:842-847),對3只BALB/c小鼠進(jìn)行免疫。首先，將CHO-Kl細(xì)胞以4xl()6個(gè)細(xì)胞/只進(jìn)行腹腔內(nèi)給予，次日和第三天將環(huán)磷酰胺以4mg/只進(jìn)行腹腔內(nèi)給予。環(huán)磷酰胺給予2周后，將人a9整聯(lián)蛋白表達(dá)細(xì)月包(人a9/CHO-K1細(xì)胞)以2x106個(gè)細(xì)胞/只進(jìn)行腹腔內(nèi)給予，再于其2周后，將人a9/CHO-Kl細(xì)月包以3xl()6個(gè)細(xì)胞/只進(jìn)行腹腔內(nèi)給予。將與人a9/CHO-Kl細(xì)胞反應(yīng)且不與表達(dá)人a4整聯(lián)蛋白的CHO-Kl細(xì)胞反應(yīng)的克隆作為抗a9整聯(lián)蛋白抗體。其結(jié)果為，建立了產(chǎn)生抗人a9整聯(lián)蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞的5個(gè)克隆(1K11、21C5、24111、25B6、28S1)。這里獲得的雜交瘤細(xì)胞1K11、21C5、24111和25B6于2006年2月15日、28Sl于2007年5月29日分另'J以J呆藏號FERMBP—10510、10511、10512、10513和FERMBP-10832保藏于茨城縣筑波市東l丁目1番地1中央第6(郵政編碼305-8566)獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心。(實(shí)施例2)對于自人a9整聯(lián)蛋白的N末端起第1-12位的氨基酸序列的肽、第4-15位的氨基酸序列的肽、第7-18位的氨基酸序列的肽這樣的依次向C末端方向移動(dòng)3個(gè)氨基酸且由12個(gè)氨基酸構(gòu)成的肽，將其在配置了C6間隔段后，再結(jié)合了2個(gè)(3Ala的纖維素膜上配制成5nmo1/斑點(diǎn)。用封閉緩沖液(牛奶/0.05%Tween20,PBS)封閉膜之后，室溫下將膜在10mL1.0(ig/mL基于常規(guī)方法制備的過氧化物酶標(biāo)記抗人a9整聯(lián)蛋白抗體(1K11、21C5、24111和25B6)溶液中浸漬3小時(shí)。用洗滌液(T-TBS)洗膜之后，用ECL檢測試劑在室溫下反應(yīng)1分鐘。觀察酶反應(yīng)生成物的螢光，根據(jù)螢光強(qiáng)度鑒定表位。此外，作為對照的抗人a9整聯(lián)蛋白抗體使用市售的Y9A2。如下表1所示，1Kll識別人a9整聯(lián)蛋白的氨基酸序列序列號40中的第79位-96位(序列號2)、第160位-177位(序歹寸號5)、第23W立_252^立(序歹'J號7)、第277^[立_2944立(序列號8)、第454位-471位(序歹'J號10)和第556位-573位(序列號ll),21C5識別第79位-96位(序列號2)、第124-141位(序列號3)、第160位-177位(序列號5)、第238位-252位(序歹'J號7)、第2774立一294<立(序歹'J號8)、第4094立_432<立(序歹'J號9)、第454位-471位(序列號IO)、第556位-573位(序歹'J號ll)、第592^立_6214立(序歹'J號12)、第7064立一723位(序歹'J號14)和第931位-951位(序列號15),24111識別第79位-96位(序列號2)、第142位-156位(序列號4)、第160位-177位(序列號5)、第238位-252位(序歹'J號7)、第277位-294位(序列號8)、第556位-573位(序列號ll)、第706位-723位(序歹'J號14)和第931位-951位(序列號15)，25B6識別第40位-5H立(序列號l)、第160位-177位(序列號5)、第2084立一2254立(序歹寸號6)、第2384立_2524立(序歹ll號7)禾口第646位-657位(序列號13),這提示這些抗體并不是識別一部分的肽，而是識別立體結(jié)構(gòu)。另外，本發(fā)明中獲得的抗人a9整聯(lián)蛋白抗體與作為對照的Y9A2發(fā)生反應(yīng)的肽不同，因此可以說是識別與Y9A2不同表位的抗體。表l表位作圖的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>(實(shí)施例3)從產(chǎn)生人a9整聯(lián)蛋白抗體(1K11、21C5、24111、25B6、28S1)的雜交瘤中提取mRNA,通過逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。以該cDNA作為模板，使用ScFv克隆用引物(LightPrimerMix、HeavyPrimerMix;AmershamBiosciences公司)進(jìn)行PCR,對抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)分別進(jìn)行延伸和擴(kuò)增。然后，基于常規(guī)方法將PCR產(chǎn)物插入pCRIITOPO載體中。對其進(jìn)行測序，確定氨基酸序列。對于各個(gè)抗體各進(jìn)行3次上述操作。如圖l所示，可判斷出1K11重鏈的CDR由DYNMD(序列號16)、DINPNNGGTIYNQKFQG(序列號20)和SGVISTDY(序列號24)構(gòu)成，其輕鏈的CDR由RASQEISGYLI(序列號28)、AASTLDS(序歹'J號32)禾口YANYPP(序歹'J號36)斗勾成，21C5重鏈的CDR由DYYMY(序歹'J號17)、TISDGGNYTYYPDSVKG(序列號21)和DRDGSSLFAY(序列號25)構(gòu)成，其輕鏈的CDR由KASQDVNIAVA(序列號29)、WASTRHT(序歹'J號33)和HYNTPW(序列號37)構(gòu)成，24111重《連的CDR由DTYVH(序列號18)、NIDPANGNTKYDPKFQG(序歹'J號22)和WLRHFYYAMDY(序列號26)構(gòu)成，其輕鏈的CDR由RASENIYYSLA(序列號30)、NANSLED(序列號34)和AYDVPY(序列號38)構(gòu)成，25B6重鏈的CDR由SYGVH(序列號19)、VIWSGGSTNYNSALMS(序列號23)和DYGNYPWFAY(序歹'J號27)構(gòu)成，其輕鏈的CDR由KASQDVNTAVA(序列號31)、SASYRYT(序列號35)和HYSTPC(序列號39)構(gòu)成，28S1重鏈的CDR由GYGVN(序列號41)、MIWGDGITEYNSALKSR(序歹'J號42)和DASSGYGFAY(序歹'J號43)構(gòu)成，其輕鏈的CDR由TASSSVSSSYLH(序列號44)、STSNLAS(序歹'J號45)和YHRSPY(序列號46)構(gòu)成。為了參考，將CDR和序列號的對應(yīng)示于表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>(實(shí)施例4)細(xì)胞黏附時(shí)，由于a9整聯(lián)蛋白與包含OPN、纖連蛋白、腱生蛋白C、VCAM-l等的胞外基質(zhì)(ECM)的a9配體結(jié)合，因此對能夠成為獲得的抗人a9整聯(lián)蛋白抗體抑制細(xì)胞教附時(shí)的對象的胞外基質(zhì)進(jìn)行了研究。hOPN(RAA)N-half是將人OPN的GRD序列變化為RAA序列，將直至凝血酶酶切部位的N末端區(qū)域以GST融合蛋白的形式從大腸桿菌中純化出來，用精確蛋白酶(PrecisionProtease)(AmershamBiosciences公司)切斷GST并除去而獲得的蛋白質(zhì)。VCAM-1由R&DSystems公司獲得。腱生蛋白C使用的是針對a9整聯(lián)蛋白的腱生蛋白C黏附序列區(qū)域的AEIDGIEL肽，而人纖連蛋白使用的是合成作為對于與a9整聯(lián)蛋白的黏附十分重要的EDA區(qū)域內(nèi)部分肽的CPEDGIHELFP肽后，使之與BSA結(jié)合的物質(zhì)。作為人a9整聯(lián)蛋白高表達(dá)細(xì)胞，使用表達(dá)人a9整聯(lián)蛋白的CHO-Kl細(xì)胞(人a9/CH0-K1)。將各50nl的1.25~5.0jag/mL的腱生蛋白C、纖連蛋白、VCAM-l或hOPN(RAA)N-half添加于96孔板中，于37度靜置1小時(shí)，以此進(jìn)行固定。用封閉液(0.5%BSA/PBS)封閉后，用PBS洗1次，然后將懸浮于添加了0.25Q/。BSA的D-MEM的人a9/CHO-K1細(xì)胞與獲得的單克隆抗體混合，分別添加200(il使得細(xì)胞達(dá)到1.0xl()S個(gè)/ml、抗體濃度達(dá)到10ng/mL。于37。C、5%C02T反應(yīng)1小時(shí)后，在孔中各添加50pl的0.5%結(jié)晶紫(WAKO，Osaka,Japan)/20%甲醇溶液，于室溫下放置30分鐘，以此進(jìn)行細(xì)胞的固定和染色。用蒸餾水洗板后，用20%醋酸溶液轉(zhuǎn)溶，測定590nm處的吸光度。另外，使用人骨橋蛋白的單克隆抗體(5A1)作為陰性對照，使用市售的抗人a9整聯(lián)蛋白抗體Y9A2作為陽性對照。其結(jié)果示于圖2。與腱生蛋白C相關(guān)的細(xì)胞翁附受21C5、24111、25B6和28S1抑制，但不受1K11抑制。觀察到與纖連蛋白相關(guān)的細(xì)胞翻附受21C5、25B6和28S1抑制，受到24I11的少許抑制，但不受1K11抑制。觀察到與VCAM-l相關(guān)的細(xì)胞黏附受到21C5、24111、25B6和28S1抑制，但不受1K11抑制。與hOPN(RAA)N-half相關(guān)的細(xì)胞l占附受到21C5、24111、25B6和28S1抑制，但不受1K11抑制。(實(shí)施例5)a4和a9整聯(lián)蛋白與很多共同的ECM結(jié)合。因此，由于存在針對這兩種整聯(lián)蛋白的抗體，可認(rèn)為細(xì)胞翻附抑制效果增強(qiáng)。于是，為了在體外調(diào)查抗人a4整聯(lián)蛋白抗體和抗人a9整聯(lián)蛋白抗體共存下的癌轉(zhuǎn)移抑制效果，研究了兩種抗體對表達(dá)a4整聯(lián)蛋白和a9整聯(lián)蛋白的癌細(xì)胞的、人黑色素瘤細(xì)胞(G361)與ECM的黏附的影響。z使用VCAM-1(1.25|ig/mL)作為ECM,抗人a4整聯(lián)蛋白抗體使用P1H4，與實(shí)施例4同樣進(jìn)行。其結(jié)果示于圖3。與VCAM-1相關(guān)的細(xì)胞f占附完全不受抗體抑制，但一旦抗人a4整聯(lián)蛋白抗體共存，則可發(fā)現(xiàn)陽性對照(Y9A2),21C5和24111受到抑制。由于許多表達(dá)a9整聯(lián)蛋白的細(xì)胞也表達(dá)a4整聯(lián)蛋白，提示通過一起使用抗人a4整聯(lián)蛋白抗體和抗人a9整聯(lián)蛋白抗體可以抑制細(xì)胞黏附，從而可以期待對抑制包括癌浸潤在內(nèi)的許多疾病具有增強(qiáng)效果。(實(shí)施例6)對于7周大的雌性小鼠(Balb/c)各3只，以400^g/只在腹腔內(nèi)分別給予抗小鼠a9整聯(lián)蛋白抗體(55A2C),作為對照給予正常倉鼠IgG(以后簡稱為NHG)。24小時(shí)后，以2mg/小鼠靜脈給予用于引起關(guān)節(jié)炎的II型膠原單克隆抗體混合物(Chondrex公司)。在給予II型膠原單克隆抗體混合物起72小時(shí)后，再以400)ig/只在腹腔內(nèi)給予55A2C或NHG。同時(shí)，以50pg/只在腹腔內(nèi)給予LPS。從LPS給予前3天至LPS給予后第6天觀察小鼠，按照Wood的方法(F.D.Wood,C.M.Pearson,ATanaka,Int.Arch.AllergyAppl.Immunol.，35,456(1969)),對關(guān)節(jié)炎的程度評分，記錄分?jǐn)?shù)。其結(jié)果示于圖4。用對照的NHG的分?jǐn)?shù)上升，觀察到風(fēng)濕發(fā)病，這提示抗小鼠a9整聯(lián)蛋白抗體完全抑制風(fēng)濕發(fā)病。因此，可知抗a9整聯(lián)蛋白抗體具有抑制風(fēng)濕發(fā)病和惡化的治療效果。(實(shí)施例7)以往，認(rèn)為控制免疫系統(tǒng)的輔助性T細(xì)胞大致分為Thl和Th2,但是最近了解到存在Thl7細(xì)胞和抑制性T細(xì)胞等。而且，還了解到只有通過白介素(IL)-23而增加的Thl7細(xì)胞具有增加破骨細(xì)胞的作用。Thl7細(xì)胞通過產(chǎn)生IL-17,在引起周圍細(xì)胞的炎癥的同時(shí)增加破骨細(xì)胞分化因子RANKL(receptorofactivatorofNF-kBligand),因此形成容易產(chǎn)生破骨細(xì)胞的環(huán)境。此外，據(jù)報(bào)道，由于IL-23、17的基因被破壞的小鼠不會(huì)產(chǎn)生炎性骨破壞，因此這些因子對骨破壞起重要的作用。因此，為了調(diào)查抗a9整聯(lián)蛋白抗體對Thl7的影響，用小鼠的關(guān)節(jié)炎模型和抗小鼠a9整聯(lián)蛋白抗體進(jìn)行研究。對于6周齡的雌性小鼠(Balb/c)各3只，以400pg/只在腹腔內(nèi)分別給予抗小鼠a9整聯(lián)蛋白抗體(18R18D、55A2C)，作為對照給予正常倉鼠IgG(以后簡稱為NHG)。18R18D是不具有細(xì)胞黏附抑制能力的抗a9整聯(lián)蛋白抗體，55A2C是具有細(xì)胞黏附抑制能力的抗體。24小時(shí)后以2mg/小鼠靜脈給予用于引起關(guān)節(jié)炎的II型膠原單克隆抗體混合物(Chondrex公司)。自給予II型膠原單克隆抗體混合物72小時(shí)后，再次以400pg/只在腹腔內(nèi)給予55A2C或NHG。同時(shí)，以50pg/只腹腔內(nèi)給予LPS。從LPS給予前3天至LPS給予后第6天觀察小鼠，按照Wood的方法(F.D.Wood，C.M.Pearson,ATanaka,Int.Arch.Allergyppl.Immunol.35，456(1969)),也就是說使用"0:無癥狀，l:四肢的趾等小關(guān)節(jié)只有一根肺脹發(fā)紅，2:小關(guān)節(jié)2根以上、或手腕或腳腕等比較大的關(guān)節(jié)腫脹發(fā)紅，3:1只手或腳整體肺脹發(fā)紅，4:1只手或腳整體進(jìn)一步肺脹達(dá)到最大限度"的評價(jià)項(xiàng)目，對關(guān)節(jié)炎的程度評分，記錄分?jǐn)?shù)。結(jié)果示于圖5。NHG和18R18D的分?jǐn)?shù)上升，觀察到關(guān)節(jié)炎發(fā)病，可知關(guān)節(jié)炎發(fā)病受到抗小鼠a9整聯(lián)蛋白抗體55A2C強(qiáng)烈的抑制。還可知抗a9整聯(lián)蛋白抗體除了具有關(guān)節(jié)炎的發(fā)病預(yù)防效果，還具有抑制惡化的效果。而且，抗a9整聯(lián)蛋白抗體所產(chǎn)生的關(guān)節(jié)炎抑制圖像示于圖6?？芍贚PS給予后第6天，由于給予55A2C抑制了關(guān)節(jié)的腫脹。然后，研究了抗a9整聯(lián)蛋白抗體的關(guān)節(jié)炎發(fā)病后的治療效果。以2mg/小鼠靜脈給予用于引起關(guān)節(jié)炎的II型膠原單克隆抗體混合物(Chondrex公司)，72小時(shí)后以50^g/只腹腔內(nèi)給予LPS。其3天后，腹腔給予(400fig/只)55A2C或NHG,調(diào)查得分。其結(jié)果如圖7所示，可知即使在關(guān)節(jié)炎發(fā)病后給予抗a9整聯(lián)蛋白抗體，也有關(guān)節(jié)炎的治療效果。根據(jù)以上所述，提示抗a9整聯(lián)蛋白抗體不僅對關(guān)節(jié)炎具有發(fā)病預(yù)防效果，還具有發(fā)病后的治療效果，因此對其作用機(jī)制進(jìn)行研究。對關(guān)節(jié)炎發(fā)病小鼠給予抗a9整聯(lián)蛋白抗體后，;吝tFkfDPD、:mi1々主記A*法亦乂r^AAEI^7ra工,TT^力hjin、wjj八^，j入叫一'j工hv;w/。hj、丄L一U，tnf-a、IL-1(3、IFN-y和TGF-P)的變化量。其結(jié)果為，通過JA—一1A,.*7人—L、TTT■O^N入Jt7入—、11_/一--丄二TTZTTJ八一為、丁S且與JNhlLr殆、T^L2iL4丁^井父，1L-t)、巧口TGF-a的mRNA的表達(dá)顯著地受到抑制(圖8)。據(jù)報(bào)道，這些細(xì)胞因子對于Thl7的分化很重要，可以推測抗a9整聯(lián)蛋白抗體產(chǎn)生的關(guān)節(jié)炎抑制效果是源于通過a9整聯(lián)蛋白功能的抑制來抑制對Thl7的分化很重要的細(xì)胞因子的產(chǎn)生。另一方面，為了調(diào)查本關(guān)節(jié)炎模型中Thl7的影響，測定正常小鼠和LPS給予后第1天、第3天、第6天的小鼠(BALB/c、6周齡、雌性)的小鼠腹股溝淋巴結(jié)的IL-17和RORyt(視黃酸相關(guān)孤兒受體yt(retinoicacid-relatedorphanreceptoryt):核內(nèi)受體，與Thl7分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子)的表達(dá)。其結(jié)果為，隨著關(guān)節(jié)炎惡化，IL-17、RORyt的mRNA的表達(dá)顯著提高，由此提示本關(guān)節(jié)炎模型中的Thl7的影響(圖9)。因此，為了研究由抗a9整聯(lián)蛋白抗體產(chǎn)生的a9整聯(lián)蛋白的功能抑制對Thl7的分化的影響，在抗a9整聯(lián)蛋白抗體給予后，通過實(shí)時(shí)PCR測定手足關(guān)節(jié)病變部位的IL-17和RORyt表達(dá)量。如圖8所示，二者的表達(dá)被抗a9整聯(lián)蛋白抗體顯著抑制。也就是說，可知抗a9整聯(lián)蛋白抗體抑制Thl7的分化。工業(yè)上利用的可能性本發(fā)明的抗體，通過a9整聯(lián)蛋白功能抑制，對癌(例如癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移)、炎癥性疾病(例如關(guān)節(jié)風(fēng)濕病、骨關(guān)節(jié)炎、肝炎、支氣管哮喘、纖維癥、糖尿病、動(dòng)脈硬化、多發(fā)性硬化癥、炎性腸病(潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病))、傳染病(例如肝炎)、自身免疫性疾病(例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性肌炎、自身免疫性甲狀腺疾病、腎小管間質(zhì)性腎炎、重an*+'g、4rt備'jif恭免7云、#、faa、、厶、力六a罷工且，含有本發(fā)明的抗a9整聯(lián)蛋白抗體和抗a4整聯(lián)蛋白抗體這丄/'人-，/人—入-ij丄—、jj>，p_*/—w*/a、i*丄，i_s>-a-々》/、,網(wǎng)百日3約a"5且勺、a"處a迎一歹-又音曰^j溜、火？正'r玍？矢媽虧曰？、/S療效果。本發(fā)明的抗體可以在病理學(xué)上檢測細(xì)胞和組織中a9整聯(lián)蛋白的表達(dá)，因此還可以作為診斷藥來使用。權(quán)利要求1.一種抗人α9整聯(lián)蛋白抗體，其識別選自于序列號1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的氨基酸序列中的1個(gè)以上氨基酸序列。2.—種抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，其重鏈的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDRH)中的CDRH1為序列號16、17、18、19或41的氨基酸序列，CDRH2為序列號20、21、22、23或42的氨基酸序列，CDRH3為序列號24、25、26、27或43的氨基酸序列，輕鏈的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDRL)中的CDRL1為序列號28、29、30、31或44的氨基酸序列，CDRL2為序列號32、33、34、35或45的氨基酸序列，CDRL3為序列號36、37、38、39或46的氨基酸序列。3.—種抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，其具有含有序列號16、20、24、28、32或36的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)中的至少一個(gè)。4.一種抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，其具有含有序列號16、20、24、28、32或36的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)的全部。5.權(quán)利要求，含有序列號17、21、25、29、33或37的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)中的至少一個(gè)。6.—種抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，其具有含有序列號17、21、25、29、33或37的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)的全部。7.—種抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，其具有含有序列號18、22、26、30、34或38的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)中的至少一個(gè)。8.—種抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，其具有含有序列號18、22、26、30、34或38的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)的全部。9.一種抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，其具有含有序列號19、23、27、31、35或39的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)中的至少一個(gè)。10.—種抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，其具有含有序列號19、23、27、31、35或39的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)的全部。11.一種抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，其具有含有序列號41、42、43、44、45或46的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)中的至少一個(gè)。12.—種抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，其具有含有序列號41、42、43、44、45或46的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)的全部。13.根據(jù)權(quán)利要求l~12所述的抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，其抑制人a9整聯(lián)蛋白與a9整聯(lián)蛋白的配體的結(jié)合。14.根據(jù)權(quán)利要求l~13任意一項(xiàng)所述的抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，其由保藏號FERMBP-10510、FERMBP-10511、FERMBP-10512、FERMBP-10513或FERMBP-10832標(biāo)示的雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生。15.根據(jù)權(quán)利要求l~14任意一項(xiàng)所述的抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，其為單克隆抗體。16.根據(jù)權(quán)利要求l~13任意一項(xiàng)所述的抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，其為嵌合抗體。17.根據(jù)權(quán)利要求l~13任意一項(xiàng)所述的抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，其為人源化抗體。18.根據(jù)權(quán)利要求l~13任意一項(xiàng)所述的抗人a9整聯(lián)蛋白抗體，其為人抗體。19.一種癌、炎癥性疾病、傳染病、自身免疫性疾病或骨病的治療劑，其含有權(quán)利要求l~18任意一項(xiàng)所述的抗人a9整聯(lián)蛋白抗體作為有效成分。20.—種癌、炎癥性疾病、傳染病、自身免疫性疾病或骨病的治療劑，其含有權(quán)利要求l~18任意一項(xiàng)所述的抗人a9整聯(lián)蛋白抗體和抗人a4整聯(lián)蛋白抗體兩者作為有效成分。21.—種癌、炎癥性疾病、傳染病、自身免疫性疾病或骨病的診斷試劑，其含有權(quán)利要求l~18任意一項(xiàng)所述的抗人a9整聯(lián)蛋白抗體作為有效成分。22.—種抑制a9整聯(lián)蛋白的活性的化合物的篩選方法，其特征在于，使用含有選自于序列號l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的氨基酸序列中的l個(gè)以上氨基酸序列的肽。全文摘要本發(fā)明涉及特異性識別人α9整聯(lián)蛋白的抗體(尤其是單克隆抗體)、嵌合抗體、人源化抗體和人抗體；產(chǎn)生前述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞；前述單克隆抗體的制備方法；前述雜交瘤細(xì)胞的制備方法；含有前述抗人α9整聯(lián)蛋白抗體的治療劑；含有前述抗人α9整聯(lián)蛋白抗體的診斷試劑；抑制人α9整聯(lián)蛋白的活性的化合物的篩選方法等。文檔編號G01N33/15GK101506239SQ200780026209公開日2009年8月12日申請日期2007年7月11日優(yōu)先權(quán)日2006年7月12日發(fā)明者上出利光,今重之,金山剛士,黑滝大翼申請人:株式會(huì)社遺傳科技