本發(fā)明屬于微生物免疫學(xué)領(lǐng)域,具體涉及一種VP2融合基因、重組狂犬病病毒rHEP-rVP2株、構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù):
:狂犬病病毒(Rabiesvirus,RV)引起的狂犬?。≧abies),一旦發(fā)病致死率幾乎高達100%,我國是狂犬病的高發(fā)區(qū),發(fā)病人數(shù)僅次于印度。目前對于狂犬病,主要以有效的疫苗防治為主,人或者動物一旦發(fā)病,無特效藥可治。犬只成為我國狂犬病的主要帶毒宿主和傳染源,消滅人狂犬病,就必須減少流浪狗的數(shù)量,普及家養(yǎng)犬只的免疫,使其免疫率達到70%以上,先在動物中消滅狂犬病。現(xiàn)有技術(shù)中的獸用滅活狂犬疫苗,成本高、免疫后效果仍然不能讓人滿意。犬細小病毒性腸炎引起成年犬嚴重胃腸炎和幼犬心肌炎。CPV(犬細小病毒)滅活疫苗所誘導(dǎo)的血清抗體效價不高。雖然弱毒苗的效果比較理想,但是弱毒株可能發(fā)生突變、毒力返強現(xiàn)象。犬細小病毒(Canineparvovirus,CPV)粒子呈20面體軸對稱,大小25nm,其衣殼蛋白由VP1、VP2和VP3三種結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成。VP2由8個反向平行的β片層基序和4個展示在外的多肽loop組成,loop1和loop3上集中了CPV主要的B細胞表位。已有研究證明僅VP2蛋白可自行組裝成犬細小病毒樣粒子,loop1、loop3和loop4對于病毒樣粒子的組裝起主要作用,而loop2可容許插入外源性抗原表位,不影響病毒粒子裝配,且能將外源表位展示在病毒樣粒子表面。技術(shù)實現(xiàn)要素:本發(fā)明的目的是提供一種VP2融合基因。本發(fā)明的再一目的是提供攜帶所述融合基因的重組狂犬病病毒rHEP-rVP2株,該毒株具有較好的免疫原性,免疫后能夠產(chǎn)生較高水平針對狂犬病病毒和犬細小病毒的抗體。本發(fā)明的另一目的是提供重組狂犬病病毒rHEP-rVP2株的構(gòu)建方法,該方法簡單、高效、安全。本發(fā)明的目的采用如下技術(shù)方案實現(xiàn):一種VP2融合基因,是將狂犬病毒中和線性抗原表位序列替代犬細小病毒VP2基因部分序列后得到的,所述VP2融合基因的序列如SEQIDNO:1所示。含有所述融合基因的質(zhì)粒、細胞。本發(fā)明還提供攜帶所述融合基因的重組狂犬病病毒rHEP-rVP2株,是在狂犬病病毒HEP-Flury株基因組的G基因和L基因之間插入所述VP2融合基因后得到的。本發(fā)明還提供所述重組狂犬病病毒rHEP-rVP2株的構(gòu)建方法,包括如下步驟:在狂犬病病毒HEP-Flury株全長cDNA中插入權(quán)利要求1所述VP2融合基因構(gòu)建重組質(zhì)粒pHEP-rVP2,轉(zhuǎn)染宿主細胞,拯救病毒,得到重組狂犬病病毒rHEP-rVP2株。優(yōu)選的技術(shù)方案中,利用核酸限制性內(nèi)切酶BsiWI和NheI,分別對VP2融合基因和pHEP-3.0質(zhì)粒進行酶切,然后將兩者的酶切片段連接,獲得所述重組質(zhì)粒pHEP-rVP2。在本發(fā)明中,所述宿主細胞為BHK-21細胞。本發(fā)明還提供含有所述重組狂犬病病毒rHEP-rVP2株的疫苗。本發(fā)明具有以下有益效果:本發(fā)明攜帶所述融合基因的重組狂犬病病毒rHEP-rVP2株,該毒株以狂犬病病毒HEP-Flury為親本株,有效表達犬細小病毒VP2融合蛋白,且該融合蛋白展示狂犬病毒中和線性抗原表位,具有更好的免疫原性,免疫后能夠產(chǎn)生較高水平針對狂犬病病毒和犬細小病毒的抗體。重組狂犬病病毒rHEP-rVP2株,與親本株HEP-Flury具相似的病毒滴度,可以降低犬用疫苗的成本。本發(fā)明重組狂犬病病毒rHEP-rVP2株的構(gòu)建方法,簡單、高效、安全。附圖說明圖1為VP2融合基因構(gòu)建策略。圖2為pHEP-rVP2質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。圖3為pHEP-rVP2質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖,M為DL15000,1,2:pHEP-rVP2陽性質(zhì)粒酶切片段。圖4為攜帶VP2融合基因的重組病毒rHEP-rVP2拯救后免疫熒光鑒定結(jié)果圖5為RT-PCR檢測重組病毒rHEP-rVP2的傳代穩(wěn)定性。泳道1為F1代毒,泳道2為F10代毒,有條帶且大小相符,泳道3為陰性對照,4孔為陽性對照圖6為攜帶VP2融合基因的重組病毒rHEP-rVP2及親本株HEP-Flury在BSR上的生長曲線。圖7為重組病毒rHEP-rVP2滅活疫苗組KM小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的針對狂犬病病毒抗體水平。圖8為重組病毒rHEP-rVP2滅活疫苗組KM小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的針對犬細小病毒抗體水平,同時設(shè)立CPV對照組。此圖為血凝抑制實驗結(jié)果,rHep-rVP2滅活疫苗組KM小鼠血清共三份,一份CPV陽性對照,每孔稀釋度兩孔重復(fù),此圖可以看出rHep-rVP2滅活疫苗組KM小鼠血清抗體效價為、29、29和210。具體實施方式以下結(jié)合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發(fā)明,但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明,本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本
技術(shù)領(lǐng)域:
常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。除非特別說明,以下實施例所用試劑和材料均為市購。實施例1VP2融合基因的構(gòu)建采用狂犬病病毒(RV)G蛋白第253-275位點之間的線性中和表位(PPDQLVNLHDFRSDEIEHLVVEE,SEQIDNO:2))的編碼序列替換VP2基因中l(wèi)oop2的第684-686位點之間的序列,構(gòu)建VP2融合基因,如圖1所示。VP2融合基因的序列如SEQIDNO:1所示。1.引物設(shè)計根據(jù)Genbank注冊的犬細小病毒VP2基因上、下游序列,設(shè)計擴增VP2基因完整序列的正向引物VP2-P1和反向引物VP2-P4,正向引物引入BsiWⅠ酶切位點,反向引物引入NheⅠ酶切位點,引物序列如下:VP2-P1:5-AGTCGTACGATGAGTGATGGA-3;VP2-P4:5-CCTGCTAGCTTAATATAATTT-3。根據(jù)VP2基因中l(wèi)oop2的第684-686位點上、下游序列,設(shè)計引物23aa-P2和23aa-P3。引物23aa-P2和23aa-P3帶有狂犬病病毒(RV)G蛋白第253-275位點之間線性中和表位的編碼序列。23aa-P2:5'-TCTGAGCGAAAGTCGTGCAAATTCACCAACTGACCTGGAGGAGTTCCAGTATGA-3'23aa-P3:5'-ACTTTCGCTCAGACGAGATTGAGCATCTCGTTGAGGAAGAGAGTGGCACACCA-3'2.VP2融合基因的構(gòu)建抽提犬細小病毒(2a亞型毒株)的基因組DNA。(1)以犬細小病毒基因組DNA為模板,采用引物VP2-P1和23aa-P2進行PCR擴增,所得片段命名為P1P2片段。PCR擴增體系如表1:表1犬細小病毒基因組DNA4μL10×rTaqBuffer2.5μL2.5mMdNTP2μLVP2-P1(20pmol)各1μL23aa-P2(20pmol)各1μLrTaq0.125μLddH2O14.375μLTotal25μL(2)以犬細小病毒基因組DNA為模板,采用引物23aa-P3和VP2-P4進行PCR擴增,所得片段命名為P3P4片段。PCR體系如表2:表2犬細小病毒基因組DNA模板4μL10×rTaqBuffer2.5μL2.5mMdNTP2μLVP2-P4(20pmol)各1μL23aa-P3(20pmol)各1μLrTaq0.125μLddH2O14.375μLTotal25μL(3)以P1P2片段和P3P4片段為模板,采用引物VP2-P1和VP2-P4進行PCR擴增,得到VP2融合基因。PCR體系如表3:表3P1P2片段和P3P4片段各4μL10×rTaqBuffer2.5μL2.5mMdNTP2μLVP2-P1(20pmol)各1μLVP2-P4(20pmol)各1μLrTaq0.125μLddH2O10.375μLTotal25μL(4)參照Omega公司的凝膠回收試劑盒(E.Z.N.A.GelExtractionKitI)使用說明書對PCR產(chǎn)物進行切膠回收、純化,回收片段與克隆載體pTA2(Takara公司)進行連接。連接反應(yīng)體系如表4所示:表42×LigationBuffer5μLPCR純化產(chǎn)物4μLpTA21μLTotal10μL(5)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞,抽提重組質(zhì)粒,酶切鑒定正確。將質(zhì)粒送測序,結(jié)果成功構(gòu)建VP2融合基因。實施例2VP2融合基因克隆至HEP-Flury株全長cDNA將VP2融合基因插入HEP-Flury株全長cDNA中G基因和L基因之間假基因區(qū)域的NheI和BsiWI酶切位點之間,構(gòu)建重組質(zhì)粒pHEP-rVP2,策略見圖2所示。具體方法如下:將PCR擴增的VP2融合基因進行切膠回收、純化,將純化的VP2基因和pHEP-3.0質(zhì)粒(攜帶HEP-Flury毒株全長cDNA的重組質(zhì)粒,構(gòu)建方法見ItoN.,TakayamaI.M.,YamadaK.,etal.ImprovedrecoveryofrabiesvirusfromclonedcDNAusingavacciniavirus-freereversegeneticssystem[J].MicrobiologyandImmunology,2003,47(8):613-617.)用NheI和BsiWI核酸限制性內(nèi)切酶進行雙酶切,酶切體系如表5所示:表5VP2融合基因/pHEP-3.04μL10×Tangobuffer2μLNheI1μLBsiWI1μLddH2O13μLTotal20μL上述體系混勻后,先37℃孵育3h,用凝膠回收試劑盒進行回收。將回收產(chǎn)物連接,連接體系如表6所示:表6VP2融合基因酶切產(chǎn)物7μLpHEP-3.0酶切產(chǎn)物1μLT4DNA連接酶10×Buffer1μLT4DNA連接酶1μLTotal10μL上述體系混勻后,置于連接儀中,22℃連接24h,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化XL10-Gold感受態(tài)細胞,篩選陽性克隆,抽提重組質(zhì)粒,用BsiWI/NheI進行酶切鑒定,酶切體系如表7所示:表7重組質(zhì)粒5μL(約1μg)10×TangoBuffer2μLBsiWI1μLNheI1μLddH2O11μLTotal20μL將酶切體系混勻,37℃水浴2h。電泳檢測酶切產(chǎn)物,以pHEP-3.0質(zhì)粒做為對照,見圖3,結(jié)果正確。經(jīng)質(zhì)粒抽提和酶切鑒定正確的質(zhì)粒送上海英駿生物工程有限公司進行序列測定,將鑒定正確的質(zhì)粒命名為pHEP-rVP2。將含有質(zhì)粒pHEP-rVP2的克隆參照Qiagen公司質(zhì)粒中量提取試劑盒說明書進行去內(nèi)毒素中提pHEP-rVP2重組質(zhì)粒,4℃保存待用。實施例3利用重組質(zhì)粒pHEP-rVP2進行重組病毒rHEP-rVP2的拯救及篩選1、轉(zhuǎn)染和病毒篩選方法參照Ito(2003)的方法(ItoN.,TakayamaI.M.,YamadaK.,etal.ImprovedrecoveryofrabiesvirusfromclonedcDNAusingavacciniavirus-freereversegeneticssystem[J].MicrobiologyandImmunology,2003,47(8):613-617.)進行。轉(zhuǎn)染:(1)準備BHK-21細胞:在12孔細胞培養(yǎng)板中加入BHK-21細胞,細胞密度為1×105個/孔,采用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液在37℃培養(yǎng)12~16h,至細胞50%-60%匯合。轉(zhuǎn)染前,用800μLPBS緩沖液洗滌細胞一次。(2)取1.25μg重組質(zhì)粒pHEP-rVP2,0.625μgpH-N,0.3125μgpH-P,0.125μgpH-L和0.1875μgpH-G混勻在1.5mL離心管中,添加滅菌去離子水至75μL,瞬時離心,使得管頂部的液滴進入溶液中。其中,pH-N、pH-P、pH-L和pH-G為輔助質(zhì)粒,用以輔助拯救重組病毒。(3)在步驟(2)處理后的離心管中,添加7.5μL轉(zhuǎn)染試劑(SuperfectTransfectionReagent購自QIAGEN公司),漩渦震蕩器上震蕩10s。(4)將步驟(3)處理后的離心管室溫靜置15min,添加400μL含10%胎牛血清和雙抗(青霉素、鏈霉素)(100IU/mL)的DMEM于離心管中,上下顛倒管幾次,混勻。(5)將步驟(4)處理后的溶解液加入細胞(12孔培養(yǎng)板中的一孔),37℃培養(yǎng)2.5~3h,靠板壁輕輕吸去DMEM,用PBS洗滌細胞一次,重新添加DMEM(含10%胎牛血清和雙抗)。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h,細胞95%長滿后轉(zhuǎn)入34℃培養(yǎng)96h。病毒篩選:(1)用錫箔紙包住轉(zhuǎn)染后的細胞板,-70℃反復(fù)凍融細胞3次,每次冷凍時間1h,室溫溶解。取60μL上清液和60μL新鮮的BHK-21細胞(細胞密度為4×105個/mL)混合于96孔板,其后在37℃培養(yǎng)48h,34℃培養(yǎng)96h。(2)傾去細胞培養(yǎng)液,每孔加滿80%預(yù)冷的丙酮,快速傾去丙酮,再次加滿丙酮,錫箔紙包住培養(yǎng)板,置-20℃1h。棄去丙酮,輕微空干,每孔添加25μL抗狂犬病病毒N蛋白熒光抗體(購自Centocor公司)以及抗CPV熒光抗體(購自Centocor公司),37℃孵育1h,棄去溶解液,用1×PBS洗滌細胞兩次,每次5min,再用去離子水快速洗滌細胞一次。自然干燥,熒光顯微鏡下觀察,可見大量綠色熒光斑點,見圖4。證明,病毒拯救成功,命名為rHEP-rVP2株。實施例4重組病毒rHEP-rVP2的傳代和鑒定1、將-80℃保存的狂犬病病毒HEP-Flury株與rHEP-rVP2株取出,檢測病毒滴度,低于105FFU/mL的病毒使用同單層細胞接種培養(yǎng)法進行傳代。在六孔細胞培養(yǎng)皿中加入新鮮消化的BSR細胞約2×105個/mL,按病毒液體積:培養(yǎng)液總體積=1:10進行接毒。細胞在37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約48h,待細胞長滿后再放入34℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約96h。在-80℃/室溫凍融細胞1次,收獲病毒,分裝-80℃保存?zhèn)溆?。依次傳代至?0次,檢測病毒滴度、RT-PCR擴增VP2融合基因,同時對擴增片段進行序列測定。2、狂犬病病毒HEP-Flury株與rHEP-rVP2株的病毒滴度達106FFU/mL。rHEP-rVP2株RT-PCR產(chǎn)物的電泳圖中出現(xiàn)了約1800bp條帶,與VP2融合基因大小相符,檢測結(jié)果正確,如圖5所示。RT-PCR產(chǎn)物的序列檢測結(jié)果正確,沒有發(fā)現(xiàn)任何突變。上述結(jié)果表明,本發(fā)明的重組病毒rHEP-rVP2可以穩(wěn)定傳代。實施例5重組病毒rHEP-rVP2在BSR細胞上的體外生長研究1、用細胞營養(yǎng)液調(diào)整BSR細胞密度為2×105/mL,將狂犬病毒HEP-Flury株和rHEP-rVP2株病毒分別按照MOI(multiplicityofinfection)為0.1接種細胞,于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,當細胞完全匯合時轉(zhuǎn)移至34℃培養(yǎng)72h,共培養(yǎng)96h;每隔24h收集100μL上清培養(yǎng)液并進行直接免疫熒光抗體檢測(方法參考譚業(yè)平等.熒光素酶標記狂犬病病毒的反向遺傳學(xué).中國獸醫(yī)學(xué)報,2010,30(7):936-940.),測定不同時間的病毒滴度,繪制成生長曲線。2、結(jié)果顯示,重組病毒滴度與親本株滴度相似,見圖6。病毒的一步生長曲線表明rHEP-rVP2與親本株HEP-Flury相比較生長特性基本一致。實施例6重組病毒rHEP-rVP2在KM小鼠體內(nèi)的免疫原性研究1、狂犬病病毒的滅活和滅活疫苗的制備:(1)將rHEP-rVP2株病毒液的滴度稀釋為1×107FFU/mL,按體積比1:4000的比例加入β-丙內(nèi)脂,4℃放置24h,再置于37℃水解2h。將滅活后的rHEP-rVP2株病毒液、未滅活的rHEP-rVP2株病毒液分別與BSR細胞共同培養(yǎng)在96孔細胞培養(yǎng)板上,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4d后,進行固定和熒光染色,在熒光顯微鏡下觀察各組有無熒光點及細胞狀態(tài)。結(jié)果滅活病毒無熒光斑點,未滅活病毒均有綠色熒光斑點。(2)參照法國賽比克公司ESSALGEL佐劑說明書推薦的方法進行滅活疫苗的制備:在超凈工作臺內(nèi)將ESSALGEL佐劑和已檢測合格的rHEP-rVP2株滅活狂犬病毒液按照佐劑在總重量的比例(w/w)為10%混合。在磁力攪拌器上以300r/min的速度攪拌10min,得到rHEP-rVP2株滅活疫苗,然后將配好的疫苗分裝于滅菌的玻璃瓶內(nèi),加蓋密封,置于4℃保存?zhèn)溆?。按照上述相同方法,制備親本株HEP-Flury株滅活疫苗。2.免疫接種實驗6~8周齡的清潔級昆明系雌性小鼠分為4組,即HEP-Flury株滅活疫苗組、rHEP-rVP2株滅活疫苗組,犬細小病毒滅活疫苗組和空白對照組,免疫組每組25只,空白對照組10只。免疫組每只小鼠肌注100μL疫苗(注射劑量約為106FFU/只),空白對照組肌注100μLDMEM。于免疫后21d尾靜脈采血制備血清,采用ELISA試劑盒(購自法國SYNOBIOTICS公司)分別進行狂犬病病毒抗體檢測和犬細小病毒HI抗體檢測。2、結(jié)果如圖7,rHEP-rVP2株滅活疫苗組針對狂犬病病毒的平均抗體水平為12.8EU,HEP-Flury株滅活疫苗組針對狂犬病病毒的平均抗體水平為11.5EU,重組病毒能產(chǎn)生相當于親本株的狂犬病抗體,且均大于0.6EU/mL,被認為是具有抗狂犬病病毒保護力的。如圖8,rHEP-rVP2株滅活疫苗組針對犬細小病毒的平均HI抗體水平為1:29,與犬細小病毒疫苗對照組HI抗體相當。SEQUENCELISTING<110>江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院<120>一種VP2融合基因、重組狂犬病病毒rHEP-rVP2株、構(gòu)建方法及其應(yīng)用<130>20161031<160>2<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1824<212>DNA<213>artificial<220><223>VP2融合基因<400>1atgagtgatggagcagttcaaccagacggtggtcaacctgctgtcagaaatgaaagagca60acaggatctgggaacgggtctggaggcgggggtggtggtggttctgggggtgtggggatt120tctacgggtactttcaataatcagacggaatttaaatttttggaaaacggatgggtggaa180atcacagcaaactcaagcagacttgtacatttaaatatgccagaaagtgaaaattataga240agagtggttgtaaataatttggataaaactgcagttaacggaaacatggctttagatgat300actcatgcacaaattgtaacaccttggtcattggttgatgcaaatgcttggggagtttgg360tttaatccaggagattggcaactaattgttaatactatgagtgagttgcatttagttagt420tttgaacaagaaatttttaatgttgttttaaagactgtttcagaatctgctactcagcca480ccaactaaagtttataataatgatttaactgcatcattgatggttgcattagatagtaat540aatactatgccatttactccagcagctatgagatctgagacattgggtttttatccatgg600aaaccaaccataccaactccatggagatattattttcaatgggatagaacattaatacca660tctcatactggaactcctccaggtcagttggtgaatttgcacgactttcgctcagacgag720attgagcatctcgttgaggaagagagtggcacaccaacaaatatataccatggtacagat780ccagatgatgttcaattttatactattgaaaattctgtgccagtacacttactaagaaca840ggtgatgaatttgctacaggaacatttttttttgattgtaaaccatgtagactaacacat900acatggcaaacaaatagagcattgggcttaccaccatttctgaattctttgcctcaagct960gaaggaggtactaactttggttatataggagttcaacaagataaaagacgtggtgtaact1020caaatgggaaatacaaactatattactgaagctactattatgagaccagctgaggttggt1080tatagtgcaccatattattcttttgaggcgtctacacaagggccatttaaaacacctatt1140gcagcaggacgggggggagcgcaaacagatgaaaatcaagcagcagatggtgatccaaga1200tatgcatttggtagacaacatggtcaaaaaactaccacaacaggagaaacacctgagaga1260tttacatatatagcacatcaagatacaggaagatatccagaaggagattggattcaaaat1320attaactttaaccttcctgtaacagaagataatgtattgctaccaacagatccaattgga1380ggtaaaacaggaattaactatactaatatatttaatacctatggtcctttaactgcatta1440aataatgtaccaccagtttatccaaatggtcaaatttgggataaagaatttgatactgac1500ttaaaaccaagacttcatgtaaatgcaccatttgtttgtcaaaataattgtcctggtcaa1560ttatttgtaaaagttgcgcctaatttaacaaatgaatatgatcctgatgcatctgctaat1620atgtcaagaattgtaacttactcagatttttggtggaaaggtaaattagtatttaaagct1680aaactaagagcctctcatacttggaatccaattcaacaaatgagtattaatgtagataac1740caatttaactatgtaccaagtaatattggaggtatgaaaattgtatatgaaaaatctcaa1800ctagcacctagaaaattatattaa1824<210>2<211>23<212>PRT<213>狂犬病病毒<400>2ProProAspGlnLeuValAsnLeuHisAspPheArgSerAspGluIle151015GluHisLeuValValGluGlu20當前第1頁1 2 3