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丹參遺傳轉(zhuǎn)化方法與流程

文檔序號:12108910閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種丹參遺傳轉(zhuǎn)化方法,其特征在于,所述方法包括:

步驟1:取丹參組培苗的葉片,將葉片去除葉片邊緣后剪切成葉盤;

步驟2:將葉盤放置于不含潮霉素的第一固體培養(yǎng)基上預培養(yǎng)1-2天;

步驟3:將帶質(zhì)粒的農(nóng)桿菌接種于含卡那霉素50mg/L和利福平25mg/L的LB液體培養(yǎng)基中,28℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4-1.0;

步驟4:取2mL農(nóng)桿菌菌液離心,去除上清液,收集菌體后用Murashige&Skoog BASAL MEDIUM液體培養(yǎng)基重懸用于侵染;

步驟5:將預培養(yǎng)過后的葉片放入含有農(nóng)桿菌的Murashige&Skoog BASALMEDIUM液體培養(yǎng)基中侵染10-20min,中間輕輕晃動以使菌液充分接觸葉片;

步驟6:取出侵染后的葉盤,置于無菌濾紙上以吸干表面殘余的菌液;

步驟7:將去除表面菌液的葉盤置于新的第一固體培養(yǎng)基上,在25℃,黑暗條件下共培養(yǎng)2-3天;

步驟8:將共培養(yǎng)過后的葉片轉(zhuǎn)移至含有潮霉素的第二固體培養(yǎng)基上,光照培養(yǎng),每隔10-15天更換一次第二固體培養(yǎng)基以免抗生素失效;

步驟9:將分化出的小芽轉(zhuǎn)移至含有潮霉素的第三固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng),待葉片長得較大時再轉(zhuǎn)移至含有潮霉素和吲哚丁酸的第四固體培養(yǎng)基上誘導生根;

步驟10:將生根后的丹參組培苗轉(zhuǎn)移至中高瓶進行培養(yǎng),促進植株生長,初期在含有潮霉素的第五固體培養(yǎng)基上繼續(xù)進行篩選培養(yǎng),后期繼代培養(yǎng)時采用不含抗生素的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述第二固體培養(yǎng)基、第三固體培養(yǎng)基和第四固體培養(yǎng)基中的潮霉素濃度均為30-60mg/L。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述第一固體培養(yǎng)基的成分為:MS+0.8-1.2mg/L 6-BA+0.08-0.12mg/L NAA。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述第二固體培養(yǎng)基的成分為:MS+0.8-1.2mg/L 6-BA+0.08-0.12mg/L NAA+30-60mg/L Hyg+200-400mg/L Cef。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述第三固體培養(yǎng)基的成分為:MS+30-60mg/L Hyg+200-400mg/L Cef。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述第四固體培養(yǎng)基的成分為:1/2MS+0.3-0.4mg/L IBA+30-60mg/L Hyg+200-400mg/L Cef。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述第五固體培養(yǎng)基中的潮霉素濃度均為30-60mg/L。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,步驟1中采用生長4-7周的健碩的丹參99-3株系的丹參組培苗葉片。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,步驟3中的農(nóng)桿菌采用GV3101農(nóng)桿菌菌株。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,步驟3中的農(nóng)桿菌的質(zhì)粒中含有pri-miR828序列。

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