本發(fā)明涉及一種殺蟲蛋白的用途，特別是涉及一種Cry1A蛋白質通過在植物中表達來控制勞氏黏蟲為害植物的用途。

背景技術：

勞氏黏蟲(Mythimna seperata)屬鱗翅目夜蛾科，屬雜食性、遷移性、間歇暴發(fā)性害蟲，主要以玉米、小麥、高粱、谷子、水稻、大豆等作物為食。在我國河南、山東、江蘇、安徽、湖南、湖北以及兩廣地區(qū)分布。在河南、山東地區(qū)勞氏黏蟲一年發(fā)生3-4代，越冬代成蟲4月中旬至5月上旬始見，至10月上中旬結束。主要危害春玉米。

玉米是中國重要的糧食作物，隨著全球溫室效應的加強，近兩年溫度不斷上升，蟲害發(fā)生種類及數量都有所提高，由于春玉米種植面積小，且苗齡小，因此受幼蟲危害較為集中，受害嚴重。第2代幼蟲主要危害夏玉米，危害盛期在7月上中旬，幼蟲孵化后首先取食心葉，食成天窗或孔洞，而后取食葉片，把葉片食成缺刻，嚴重時僅剩葉脈。第3代幼蟲危害盛期在8月中下旬，是對夏玉米危害最重的一代。第4代幼蟲發(fā)生在9月份，此時夏玉米已陸續(xù)成熟并逐漸收獲，幼蟲主要危害晚播田塊及補種的植株。

玉米是中國重要的糧食作物，隨著近年來天氣多變，尤其是局部地區(qū)干旱面積正在擴大，導致了勞氏黏蟲在河南以及山東一帶不斷有爆發(fā)的消息傳出(區(qū)別于東方黏蟲喜高溫高濕環(huán)境)。為了防治勞氏黏蟲，人們通常采用的主要防治方法有：農業(yè)防治、化學防治和物理防治。

農業(yè)防治是把整個農田生態(tài)系統(tǒng)多因素的綜合協(xié)調管理，調控作物、害蟲、環(huán)境因素、創(chuàng)造一個有利于作物生長而不利于勞氏黏蟲發(fā)生的農田生態(tài)環(huán)境。如在成蟲產卵盛期前選葉片完整、不霉爛的稻草8-10根扎成一小把，每畝30-50把，每隔5-7天更換一次(若草把經用藥劑浸泡可減少換把次數)，可顯著減少田間蟲口密度；還可在幼蟲發(fā)生期間放鴨啄食。因農業(yè)防治必須服從作物布局和增產的要求，應用有一定的局限性，不能作為應急措施，在勞氏黏蟲爆發(fā)時就顯得無能為力。

化學防治即農藥防治，是利用化學殺蟲劑來殺滅害蟲，是勞氏黏蟲綜合治理的重要組成部分，它具有快速、方便、簡便和高經濟效益的特點，特別是勞氏黏蟲大發(fā)生的情況下，是必不可少的應急措施。目前化學防治方法主要是藥液噴霧，如4.5％高效氯氰菊酯、2.5％溴氰菊酯，48％的樂斯本等分別以1000倍液和1500倍液整株噴霧，具有可取得較好的防治效果。但化學防治也有其局限性，如使用不當往往會導致農作物發(fā)生藥害、害蟲產生抗藥性，以及殺傷天敵、污染環(huán)境，使農田生態(tài)系統(tǒng)遭到破壞和農藥殘留對人、畜的安全構成威脅等不良后果。

物理防治主要根據害蟲對環(huán)境條件中各種物理因素的反應，利用各種物理因素如光、電、色、溫濕度等以及機械設備進行誘殺、輻射不育等方法來防治害蟲。目前應用最廣泛的是頻振式殺蟲燈誘殺，它利用害蟲成蟲的趨光性，近距離用光，遠距離用波，引誘害蟲靠近，對勞氏黏蟲成蟲的防治效果非常好；但是頻振式殺蟲燈需要每天及時清理高壓電網上的污垢，否則會影響殺蟲效果；并且在雷雨天不能開燈，在操作上還有電擊傷人的危險；此外安裝燈的一次性投入較大。

為了解決農業(yè)防治、化學防治和物理防治在實際應用中的局限性，科學家們經過研究發(fā)現將編碼殺蟲蛋白的抗蟲基因轉入植物中，可獲得一些抗蟲轉基因植物以防治植物蟲害。Cry1A殺蟲蛋白是眾多殺蟲蛋白中的一種，是由蘇云金芽孢桿菌庫斯塔基亞種(Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki，B.t.k.)產生的不溶性伴孢結晶蛋白。

Cry1A蛋白被昆蟲攝入進入中腸，毒蛋白原毒素被溶解在昆蟲中腸的堿性pH環(huán)境下。蛋白N-和C-末端被堿性蛋白酶消化，將原毒素轉變成活性片段；活性片段和昆蟲中腸上皮細胞膜上表面上受體結合，插入腸膜，導致細胞膜出現穿孔病灶，破壞細胞膜內外的滲透壓變化及pH平衡等，擾亂昆蟲的消化過程，最終導致其死亡。

已證明轉Cry1A基因的植株可以抵抗棉鈴蟲、草地貪夜蛾等鱗翅目(Lepidoptera)害蟲的侵害，然而，至今尚無關于通過產生表達Cry1A蛋白的轉基因植株來控制勞氏黏蟲對植物危害的報道。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的是提供一種殺蟲蛋白的用途，首次提供了通過產生表達Cry1A蛋白的轉基因植株來控制勞氏黏蟲對植物危害的方法，且有效克服現有技術農業(yè)防治、化學防治和物理防治等技術缺陷。

為實現上述目的，本發(fā)明提供了一種控制勞氏黏蟲害蟲的方法，包括將勞氏黏蟲害蟲至少與Cry1A蛋白接觸。

進一步地，所述Cry1A蛋白存在于至少產生所述Cry1A蛋白的宿主細胞中，所述勞氏黏蟲害蟲通過攝食所述宿主細胞至少與所述Cry1A蛋白接觸。

更進一步地，所述Cry1A蛋白存在于至少產生所述Cry1A蛋白的細菌或轉基因植物中，所述勞氏黏蟲害蟲通過攝食所述細菌或所述轉基因植物的組織至少與所述Cry1A蛋白接觸，接觸后所述勞氏黏蟲害蟲生長受到抑制和/或導致死亡，以實現對勞氏黏蟲危害植物的控制。

所述轉基因植物可以處于任意生育期。

所述轉基因植物的組織為葉片、莖稈、果實、雄穗、雌穗、花藥或花絲。

所述對勞氏黏蟲危害植物的控制不因種植地點和/或種植時間的改變而改變。

所述植物為玉米、小麥、高粱、谷子、水稻、大豆。

所述接觸步驟之前的步驟為種植含有編碼所述Cry1A蛋白的多核苷酸的植物。

在上述技術方案的基礎上，所述Cry1A蛋白為Cry1Ab蛋白、Cry1A.105蛋白或Cry1Ac蛋白。

優(yōu)選地，所述Cry1A蛋白氨基酸序列具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

在上述技術方案的基礎上，所述植物還包括至少一種不同于編碼所述Cry1A蛋白的核苷酸的第二種核苷酸。

進一步地，所述第二種核苷酸編碼Cry類殺蟲蛋白質、Vip類殺蟲蛋白質、蛋白酶抑制劑、凝集素、α-淀粉酶或過氧化物酶。

優(yōu)選地，所述第二種核苷酸編碼Vip3Aa蛋白或Cry2Ab蛋白。

更進一步地，所述第二種核苷酸具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。

可選擇地，所述第二種核苷酸為抑制目標昆蟲害蟲中重要基因的dsRNA。

為實現上述目的，本發(fā)明還提供了一種Cry1A蛋白質控制勞氏黏蟲害蟲的用途。

為實現上述目的，本發(fā)明還提供了一種產生控制勞氏黏蟲害蟲的植物的方法，包括向所述植物的基因組中引入編碼Cry1A蛋白的多核苷酸序列。

為實現上述目的，本發(fā)明還提供了一種產生控制勞氏黏蟲害蟲的植物種子的方法，包括將由所述方法獲得的第一植株與第二植株雜交，從而產生含有編碼Cry1A蛋白的多核苷酸序列的種子

為實現上述目的，本發(fā)明還提供了一種培養(yǎng)控制勞氏黏蟲害蟲的植物的方法，包括：

種植至少一粒植物種子，所述植物種子的基因組中包括編碼Cry1A蛋白的多核苷酸序列；

使所述植物種子長成植株；

使所述植株在人工接種勞氏黏蟲害蟲和/或勞氏黏蟲害蟲自然發(fā)生危害的條件下生長，收獲與其他不具有編碼Cry1A蛋白的多核苷酸序列的植株相比具有減弱的植物損傷和/或具有增加的植物產量的植株。

本發(fā)明中所述的“接觸”，是指昆蟲和/或害蟲觸碰、停留和/或攝食植物、植物器官、植物組織或植物細胞，所述植物、植物器官、植物組織或植物細胞既可以是其體內表達殺蟲蛋白，還可以是所述植物、植物器官、植物組織或植物細胞的表面具有殺蟲蛋白和/或具有產生殺蟲蛋白的微生物。

本發(fā)明術語“控制”和/或“防治”是指勞氏黏蟲害蟲至少與Cry1A蛋白接觸，接觸后勞氏黏蟲害蟲生長受到抑制和/或導致死亡。進一步地，勞氏黏蟲害蟲通過攝食植物組織至少與Cry1A蛋白接觸，接觸后全部或部分勞氏黏蟲害蟲生長受到抑制和/或導致死亡。抑制是指亞致死，即尚未致死但能引起生長發(fā)育、行為、生理、生化和組織等方面的某種效應，如生長發(fā)育緩慢和/或停止。同時，植物在形態(tài)上應是正常的，且可在常規(guī)方法下培養(yǎng)以用于產物的消耗和/或生成。此外，含有編碼Cry1A蛋白的多核苷酸序列的控制勞氏黏蟲害蟲的植物和/或植物種子，在人工接種勞氏黏蟲害蟲和/或勞氏黏蟲害蟲自然發(fā)生危害的條件下，與非轉基因的野生型植株相比具有減弱的植物損傷，具體表現包括但不限于改善的莖稈抗性、和/或提高的籽粒重量、和/或增產等。Cry1A蛋白對勞氏黏蟲的“控制”和/或“防治”作用是可以獨立存在的，不因其它可“控制”和/或“防治”勞氏黏蟲害蟲的物質的存在而減弱和/或消失。具體地，轉基因植物(含有編碼Cry1A蛋白的多核苷酸序列)的任何組織同時和/或不同步地，存在和/或產生，Cry1A蛋白和/或可控制勞氏黏蟲害蟲的另一種物質，則所述另一種物質的存在既不影響Cry1A蛋白對勞氏黏蟲的“控制”和/或“防治”作用，也不能導致所述“控制”和/或“防治”作用完全和/或部分由所述另一種物質實現，而與Cry1A蛋白無關。通常情況下，在大田，勞氏黏蟲害蟲攝食植物組織的過程短暫且很難用肉眼觀察到，因此，在人工接種勞氏黏蟲害蟲和/或勞氏黏蟲害蟲自然發(fā)生危害的條件下，如轉基因植物(含有編碼Cry1A蛋白的多核苷酸序列)的任何組織存在死亡的勞氏黏蟲害蟲、和/或在其上停留生長受到抑制的勞氏黏蟲害蟲、和/或與非轉基因的野生型植株相比具有減弱的植物損傷，即為實現了本發(fā)明的方法和/或用途，即通過勞氏黏蟲害蟲至少與Cry1A蛋白接觸以實現控制勞氏黏蟲害蟲的方法和/或用途。

在本發(fā)明中，Cry1A蛋白在一種轉基因植物中的表達可以伴隨著一個或多個Cry類殺蟲蛋白質和/或Vip類殺蟲蛋白質的表達。這種超過一種的殺蟲毒素在同一株轉基因植物中共同表達可以通過遺傳工程使植物包含并表達所需的基因來實現。另外，一種植物(第1親本)可以通過遺傳工程操作表達Cry1A蛋白質，第二種植物(第2親本)可以通過遺傳工程操作表達Cry類殺蟲蛋白質和/或Vip類殺蟲蛋白質。通過第1親本和第2親本雜交獲得表達引入第1親本和第2親本的所有基因的后代植物。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現象。因此在本發(fā)明中可以使用RNAi技術特異性剔除或關閉目標昆蟲害蟲中特定基因的表達。

勞氏黏蟲所屬的夜蛾科是鱗翅目中種類最豐富的科，全球已經發(fā)現了超過2萬種夜蛾科昆蟲，其中絕大部分為農業(yè)害蟲；中國已報道夜蛾科有2110種，分屬18個亞科514個屬。盡管勞氏黏蟲與東方黏蟲同屬于夜蛾科，除了在分類標準上存在相似性，在其它形態(tài)結構或習性上則存在極大差異，例如東方黏蟲體色呈灰褐色或淡黃色而勞氏黏蟲體色呈紅褐色，東方黏蟲幼蟲體長30-40mm而勞氏黏蟲幼蟲體長17-27mm，東方黏蟲在河南及山東地區(qū)不能越冬，只有在江蘇和浙江可有部分蟲以蛹或老熟幼蟲滯育越冬，而勞氏黏蟲的蛹或老熟幼蟲可以在河南、山東等地的土壤中越冬。類似的，植物中的草莓與蘋果一樣(同屬于薔薇目薔薇科)，它們都有花兩性，輻射對稱，花瓣5片等特征，但是其果實以及植株形態(tài)卻是千差萬別。但因人們較少接觸昆蟲，尤其是較少接觸農業(yè)害蟲，對于昆蟲形態(tài)上的差異較少關注，而使得人們以為昆蟲的形態(tài)大同小異。而事實上，勞氏黏蟲不管是從幼蟲形態(tài)還是成蟲形態(tài)上來看，都具有其獨特的特征。

本發(fā)明中所述的植物、植物組織或植物細胞的基因組，是指植物、植物組織或植物細胞內的任何遺傳物質，且包括細胞核和質體和線粒體基因組。

本發(fā)明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主細胞中編碼蛋白質或多肽。本領域技術人員很容易認識到，可以將本發(fā)明的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的調控序列控制下。

本領域技術人員所熟知的，DNA典型的以雙鏈形式存在。在這種排列中，一條鏈與另一條鏈互補，反之亦然。由于DNA在植物中復制產生了DNA的其它互補鏈。這樣，本發(fā)明包括對序列表中示例的多核苷酸及其互補鏈的使用。本領域常使用的“編碼鏈”指與反義鏈結合的鏈。為了在體內表達蛋白質，典型將DNA的一條鏈轉錄為一條mRNA的互補鏈，它作為模板翻譯出蛋白質。mRNA實際上是從DNA的“反義”鏈轉錄的?！坝辛x”或“編碼”鏈有一系列密碼子(密碼子是三個核苷酸，一次讀三個可以產生特定氨基酸)，其可作為開放閱讀框(ORF)閱讀來形成目的蛋白質或肽。本發(fā)明還包括與示例的DNA有相當功能的RNA。

本發(fā)明中核酸分子或其片段在嚴格條件下與本發(fā)明Cry1A基因雜交。任何常規(guī)的核酸雜交或擴增方法都可以用于鑒定本發(fā)明Cry1A基因的存在。核酸分子或其片段在一定情況下能夠與其他核酸分子進行特異性雜交。本發(fā)明中，如果兩個核酸分子能形成反平行的雙鏈核酸結構，就可以說這兩個核酸分子彼此間能夠進行特異性雜交。如果兩個核酸分子顯示出完全的互補性，則稱其中一個核酸分子是另一個核酸分子的“互補物”。本發(fā)明中，當一個核酸分子的每一個核苷酸都與另一個核酸分子的對應核苷酸互補時，則稱這兩個核酸分子顯示出“完全互補性”。如果兩個核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們在至少常規(guī)的“低度嚴格”條件下退火且彼此結合，則稱這兩個核酸分子為“最低程度互補”。類似地，如果兩個核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們在常規(guī)的“高度嚴格”條件下退火且彼此結合，則稱這兩個核酸分子具有“互補性”。從完全互補性中偏離是可以允許的，只要這種偏離不完全阻止兩個分子形成雙鏈結構。為了使一個核酸分子能夠作為引物或探針，僅需保證其在序列上具有充分的互補性，以使得在所采用的特定溶劑和鹽濃度下能形成穩(wěn)定的雙鏈結構。

本發(fā)明中，基本同源的序列是一段核酸分子，該核酸分子在高度嚴格條件下能夠和相匹配的另一段核酸分子的互補鏈發(fā)生特異性雜交。促進DNA雜交的適合的嚴格條件，例如，大約在45℃條件下用6.0×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)處理，然后在50℃條件下用2.0×SSC洗滌，這些條件對本領域技術人員是公知的。例如，在洗滌步驟中的鹽濃度可以選自低度嚴格條件的約2.0×SSC、50℃到高度嚴格條件的約0.2×SSC、50℃。此外，洗滌步驟中的溫度條件可以從低度嚴格條件的室溫約22℃，升高到高度嚴格條件的約65℃。溫度條件和鹽濃度可以都發(fā)生改變，也可以其中一個保持不變而另一個變量發(fā)生改變。優(yōu)選地，本發(fā)明所述嚴格條件可為在6×SSC、0.5％SDS溶液中，在65℃下發(fā)生特異性雜交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜1次。

因此，具有抗蟲活性并在嚴格條件下與本發(fā)明SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8雜交的序列包括在本發(fā)明中。這些序列與本發(fā)明序列至少大約40％-50％同源，大約60％、65％或70％同源，甚至至少大約75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同源性。

本發(fā)明中所述的基因和蛋白質不但包括特定的示例序列，還包括保存了所述特定示例的蛋白質的殺蟲活性特征的部分和/片段(包括與全長蛋白質相比在內和/或末端缺失)、變體、突變體、取代物(有替代氨基酸的蛋白質)、嵌合體和融合蛋白。所述“變體”或“變異”是指編碼同一蛋白或編碼有殺蟲活性的等價蛋白的核苷酸序列。所述“等價蛋白”是指與權利要求的蛋白具有相同或基本相同的抗勞氏黏蟲害蟲的生物活性的蛋白。

本發(fā)明中所述的DNA分子或蛋白序列的“片段”或“截短”是指涉及的原始DNA或蛋白序列(核苷酸或氨基酸)的一部分或其人工改造形式(例如適合植物表達的序列)，前述序列的長度可存在變化，但長度足以確保(編碼)蛋白質為昆蟲毒素。

使用標準技術可以修飾基因和容易的構建基因變異體。例如，本領域熟知制造點突變的技術。又例如美國專利號5605793描述了在隨機斷裂后使用DNA重裝配產生其它分子多樣性的方法?？梢允褂蒙虡I(yè)化核酸內切酶制造全長基因的片段，并且可以按照標準程序使用核酸外切酶。例如，可以使用酶諸如Bal31或定點誘變從這些基因的末端系統(tǒng)地切除核苷酸。還可以使用多種限制性內切酶獲取編碼活性片段的基因?？梢允褂玫鞍酌钢苯荧@得這些毒素的活性片段。

本發(fā)明可以從B.t.分離物和/或DNA文庫衍生出等價蛋白和/或編碼這些等價蛋白的基因。有多種方法獲取本發(fā)明的殺蟲蛋白。例如，可以使用本發(fā)明公開和要求保護的殺蟲蛋白的抗體從蛋白質混合物鑒定和分離其它蛋白。特別地，抗體可能是由蛋白最恒定和與其它B.t.蛋白最不同的蛋白部分引起的。然后可以通過免疫沉淀、酶聯免疫吸附測定(ELISA)或western印跡方法使用這些抗體專一地鑒定有特征活性的等價蛋白。可使用本領域標準程序容易的制備本發(fā)明中公開的蛋白或等價蛋白或這類蛋白的片段的抗體。然后可以從微生物中獲得編碼這些蛋白的基因。

由于遺傳密碼子的豐余性，多種不同的DNA序列可以編碼相同的氨基酸序列。產生這些編碼相同或基本相同的蛋白的可替代DNA序列正在本領域技術人員的技術水平內。這些不同的DNA序列包括在本發(fā)明的范圍內。所述“基本上相同的”序列是指有氨基酸取代、缺失、添加或插入但實質上不影響殺蟲活性的序列，亦包括保留殺蟲活性的片段。

本發(fā)明中氨基酸序列的取代、缺失或添加是本領域的常規(guī)技術，優(yōu)選這種氨基酸變化為：小的特性改變，即不顯著影響蛋白的折疊和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常約1-30個氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端延伸一個甲硫氨酸殘基；小的連接肽，例如約20-25個殘基長。

保守取代的實例是在下列氨基酸組內發(fā)生的取代：堿性氨基酸(如精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變特定活性的那些氨基酸取代在本領域內是眾所周知的，并且已由，例如，N.Neurath和R.L.Hill在1979年紐約學術出版社(Academic Press)出版的《Protein》中進行了描述。最常見的互換有Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thu/Ser，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu和Asp/Gly，以及它們相反的互換。

對于本領域的技術人員而言顯而易見地，這種取代可以在對分子功能起重要作用的區(qū)域之外發(fā)生，而且仍產生活性多肽。對于由本發(fā)明的多肽，其活性必需的并因此選擇不被取代的氨基酸殘基，可以根據本領域已知的方法，如定點誘變或丙氨酸掃描誘變進行鑒定(如參見，Cunningham和Wells，1989，Science 244：1081-1085)。后一技術是在分子中每一個帶正電荷的殘基處引入突變，檢測所得突變分子的抗蟲活性，從而確定對該分子活性而言重要的氨基酸殘基。底物-酶相互作用位點也可以通過其三維結構的分析來測定，這種三維結構可由核磁共振分析、結晶學或光親和標記等技術測定(參見，如de Vos等，1992，Science 255：306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol 224:899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Letters 309：59-64)。

在本發(fā)明中，Cry1A蛋白包括但不限于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4，與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有一定同源性的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。這些序列與本發(fā)明序列類似性/相同性典型的大于78％，優(yōu)選的大于85％，更優(yōu)選的大于90％，甚至更優(yōu)選的大于95％，并且可以大于99％。也可以根據更特定的相同性和/或類似性范圍定義本發(fā)明的優(yōu)選的多核苷酸和蛋白質。例如與本發(fā)明示例的序列有78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性和/或類似性。

在本發(fā)明中，產生所述Cry1A蛋白的轉基因植物包括但不限于Mon810轉基因玉米事件和/或包含Mon810轉基因玉米事件的植物材料(如在US6713259 B2所描述的)、Bt11轉基因玉米事件和/或包含Bt11轉基因玉米事件的植物材料(如在USDA APHIS非管制狀態(tài)申請95-195-01p所描述的，其所包含的Cry1Ab蛋白的氨基酸序列如本發(fā)明SEQ ID NO:3所示)、Bt176轉基因玉米事件和/或包含Bt176轉基因玉米事件的植物材料(如在USDA APHIS非管制狀態(tài)申請94-319-01p所描述的，其所包含的Cry1Ab蛋白的氨基酸序列如US5625136B2所描述的)、TT51轉基因水稻事件和/或包含TT51轉基因水稻事件的植物材料(如在CN100582223C和CN101302520B所描述的)、223F-S21轉基因水稻品系和/或包含223F-S21轉基因水稻品系的植物材料(如在CN103773759A所描述的)、Mon15985轉基因棉花事件和/或包含Mon15985轉基因棉花事件的植物材料(如在CN101413028B所描述的)、MON531轉基因棉花事件和/或包含MON531轉基因棉花事件的植物材料(如在USDA APHIS非管制狀態(tài)申請00-342-01p所描述的)、COT67B轉基因棉花事件和/或包含COT67B轉基因棉花事件的植物材料(如在USDA APHIS非管制狀態(tài)申請07-108-01p所描述的)或者3006-210-23轉基因棉花事件和/或包含3006-210-23轉基因棉花事件的植物材料(如在USDA APHIS非管制狀態(tài)申請03-036-02p所描述的)，其均可以實現本發(fā)明的方法和/或用途，即通過勞氏黏蟲害蟲至少與Cry1A蛋白接觸以實現控制勞氏黏蟲害蟲的方法和/或用途。本領域技術人員所理解的，使上述轉基因事件中的Cry1A蛋白在不同植物中表達亦能實現本發(fā)明的方法和/或用途。更具體地，所述Cry1A蛋白存在于至少產生所述Cry1A蛋白的轉基因植物中，所述勞氏黏蟲害蟲通過攝食所述轉基因植物的組織至少與所述Cry1A蛋白接觸，接觸后所述勞氏黏蟲害蟲生長受到抑制和/或導致死亡，以實現對勞氏黏蟲危害植物的控制。

本發(fā)明中所述調控序列包括但不限于啟動子、轉運肽、終止子、增強子、前導序列、內含子以及其它可操作地連接到所述Cry1A蛋白的調節(jié)序列。

所述啟動子為植物中可表達的啟動子，所述的“植物中可表達的啟動子”是指確保與其連接的編碼序列在植物細胞內進行表達的啟動子。植物中可表達的啟動子可為組成型啟動子。指導植物內組成型表達的啟動子的示例包括但不限于，來源于花椰菜花葉病毒的35S啟動子、玉米Ubi啟動子、水稻GOS2基因的啟動子等。備選地，植物中可表達的啟動子可為組織特異的啟動子，即該啟動子在植物的一些組織內如在綠色組織中指導編碼序列的表達水平高于植物的其他組織(可通過常規(guī)RNA試驗進行測定)，如PEP羧化酶啟動子。備選地，植物中可表達的啟動子可為創(chuàng)傷誘導啟動子。創(chuàng)傷誘導啟動子或指導創(chuàng)傷誘導的表達模式的啟動子是指當植物經受機械或由昆蟲啃食引起的創(chuàng)傷時，啟動子調控下的編碼序列的表達較正常生長條件下有顯著提高。創(chuàng)傷誘導啟動子的示例包括但不限于，馬鈴薯和西紅柿的蛋白酶抑制基因(pin Ⅰ和pin Ⅱ)和玉米蛋白酶抑制基因(MPI)的啟動子。

所述轉運肽(又稱分泌信號序列或導向序列)是指導轉基因產物到特定的細胞器或細胞區(qū)室，對受體蛋白質來說，所述轉運肽可以是異源的，例如，利用編碼葉綠體轉運肽序列靶向葉綠體，或者利用‘KDEL’保留序列靶向內質網，或者利用大麥植物凝集素基因的CTPP靶向液泡。

所述前導序列包含但不限于，小RNA病毒前導序列，如EMCV前導序列(腦心肌炎病毒5’非編碼區(qū))；馬鈴薯Y病毒組前導序列，如MDMV(玉米矮縮花葉病毒)前導序列；人類免疫球蛋白質重鏈結合蛋白質(BiP)；苜?；ㄈ~病毒的外殼蛋白質mRNA的不翻譯前導序列(AMV RNA4)；煙草花葉病毒(TMV)前導序列。

所述增強子包含但不限于，花椰菜花葉病毒(CaMV)增強子、玄參花葉病毒(FMV)增強子、康乃馨風化環(huán)病毒(CERV)增強子、木薯脈花葉病毒(CsVMV)增強子、紫茉莉花葉病毒(MMV)增強子、夜香樹黃化曲葉病毒(CmYLCV)增強子、木爾坦棉花曲葉病毒(CLCuMV)、鴨跖草黃斑駁病毒(CoYMV)和花生褪綠線條花葉病毒(PCLSV)增強子。

對于單子葉植物應用而言，所述內含子包含但不限于，玉米hsp70內含子、玉米泛素內含子、Adh內含子1、蔗糖合酶內含子或水稻Act1內含子。對于雙子葉植物應用而言，所述內含子包含但不限于，CAT-1內含子、pKANNIBAL內含子、PIV2內含子和“超級泛素”內含子。

所述終止子可以為在植物中起作用的適合多聚腺苷酸化信號序列，包括但不限于，來源于農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂堿合成酶(NOS)基因的多聚腺苷酸化信號序列、來源于蛋白酶抑制劑Ⅱ(pinⅡ)基因的多聚腺苷酸化信號序列、來源于豌豆ssRUBISCO E9基因的多聚腺苷酸化信號序列和來源于α-微管蛋白(α-tubulin)基因的多聚腺苷酸化信號序列。

本發(fā)明中所述“有效連接”表示核酸序列的聯結，所述聯結使得一條序列可提供對相連序列來說需要的功能。在本發(fā)明中所述“有效連接”可以為將啟動子與感興趣的序列相連，使得該感興趣的序列的轉錄受到該啟動子控制和調控。當感興趣的序列編碼蛋白并且想要獲得該蛋白的表達時“有效連接”表示：啟動子與所述序列相連，相連的方式使得得到的轉錄物高效翻譯。如果啟動子與編碼序列的連接是轉錄物融合并且想要實現編碼的蛋白的表達時，制造這樣的連接，使得得到的轉錄物中第一翻譯起始密碼子是編碼序列的起始密碼子。備選地，如果啟動子與編碼序列的連接是翻譯融合并且想要實現編碼的蛋白的表達時，制造這樣的連接，使得5’非翻譯序列中含有的第一翻譯起始密碼子與啟動子相連結，并且連接方式使得得到的翻譯產物與編碼想要的蛋白的翻譯開放讀碼框的關系是符合讀碼框的?？梢浴坝行нB接”的核酸序列包括但不限于：提供基因表達功能的序列(即基因表達元件，例如啟動子、5’非翻譯區(qū)域、內含子、蛋白編碼區(qū)域、3’非翻譯區(qū)域、聚腺苷化位點和/或轉錄終止子)、提供DNA轉移和/或整合功能的序列(即T-DNA邊界序列、位點特異性重組酶識別位點、整合酶識別位點)、提供選擇性功能的序列(即抗生素抗性標記物、生物合成基因)、提供可計分標記物功能的序列、體外或體內協(xié)助序列操作的序列(即多接頭序列、位點特異性重組序列)和提供復制功能的序列(即細菌的復制起點、自主復制序列、著絲粒序列)。

本發(fā)明中所述的“殺蟲”或“抗蟲”是指對農作物害蟲是有毒的，從而實現“控制”和/或“防治”農作物害蟲。優(yōu)選地，所述“殺蟲”或“抗蟲”是指殺死農作物害蟲。更具體地，目標昆蟲是勞氏黏蟲害蟲。

本發(fā)明中Cry1A蛋白對勞氏黏蟲害蟲具有毒性。本發(fā)明中的植物，特別是玉米，在其基因組中含有外源DNA，所述外源DNA包含編碼Cry1A蛋白的核苷酸序列，勞氏黏蟲害蟲通過攝食植物組織與該蛋白接觸，接觸后勞氏黏蟲害蟲生長受到抑制和/或導致死亡。抑制是指致死或亞致死。同時，植物在形態(tài)上應是正常的，且可在常規(guī)方法下培養(yǎng)以用于產物的消耗和/或生成。此外，該植物可基本消除對化學或生物殺蟲劑的需要(所述化學或生物殺蟲劑為針對Cry1A蛋白所靶向的勞氏黏蟲害蟲的殺蟲劑)。

植物材料中殺蟲晶體蛋白(ICP)的表達水平可通過本領域內所描述的多種方法進行檢測，例如通過應用特異引物對組織內產生的編碼殺蟲蛋白質的mRNA進行定量，或直接特異性檢測產生的殺蟲蛋白質的量。

可以應用不同的試驗測定植物中ICP的殺蟲效果。本發(fā)明中目標昆蟲主要為勞氏黏蟲。

本發(fā)明中，所述Cry1A蛋白可以具有序列表中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。除了包含Cry1A蛋白的編碼區(qū)外，也可包含其他元件，例如編碼選擇性標記的蛋白質。

此外，包含編碼本發(fā)明Cry1A蛋白的核苷酸序列的表達盒在植物中還可以與至少一種編碼除草劑抗性基因的蛋白質一起表達，所述除草劑抗性基因包括但不限于，草胺膦抗性基因(如bar基因、pat基因)、苯敵草抗性基因(如pmph基因)、草甘膦抗性基因(如EPSPS基因)、溴苯腈(bromoxynil)抗性基因、磺酰脲抗性基因、對除草劑茅草枯的抗性基因、對氨腈的抗性基因或谷氨酰胺合成酶抑制劑(如PPT)的抗性基因，從而獲得既具有高殺蟲活性、又具有除草劑抗性的轉基因植物。

本發(fā)明中，將外源DNA導入植物，如將編碼所述Cry1A蛋白的基因或表達盒或重組載體導入植物細胞，常規(guī)的轉化方法包括但不限于，農桿菌介導的轉化、微量發(fā)射轟擊、直接將DNA攝入原生質體、電穿孔或晶須硅介導的DNA導入。

本發(fā)明提供了一種殺蟲蛋白的用途，具有以下優(yōu)點：

1、內因防治。現有技術主要是通過外部作用即外因來控制勞氏黏蟲害蟲的危害，如農業(yè)防治、化學防治和物理防治；而本發(fā)明是通過植物體內產生能夠殺死勞氏黏蟲的Cry1A蛋白來控制勞氏黏蟲害蟲的，即通過內因來防治。

2、無污染、無殘留?，F有技術使用的化學防治方法雖然對控制勞氏黏蟲害蟲的危害起到了一定作用，但同時也對人、畜和農田生態(tài)系統(tǒng)帶來了污染、破壞和殘留；使用本發(fā)明控制勞氏黏蟲害蟲的方法，可以消除上述不良后果。

3、全生育期防治?，F有技術使用的控制勞氏黏蟲害蟲的方法都是階段性的，而本發(fā)明是對植物進行全生育期的保護，轉基因植物(Cry1A蛋白)從發(fā)芽、生長，一直到開花、結果，都可以避免遭受勞氏黏蟲的侵害。

4、全植株防治。現有技術使用的控制勞氏黏蟲害蟲的方法大多是局部性的，如葉面噴施；而本發(fā)明是對整個植株進行保護，如轉基因植物(Cry1A蛋白)的葉片、莖稈、果實、雄穗、雌穗、花藥或花絲等都是可以抵抗勞氏黏蟲侵害的。

5、效果穩(wěn)定?，F有技術使用的無論是農業(yè)防治方法還是物理防治方法都需要利用環(huán)境條件對害蟲進行防治，可變因素較多；本發(fā)明是使所述Cry1A蛋白在植物體內進行表達，有效地克服了環(huán)境條件不穩(wěn)定的缺陷，且本發(fā)明轉基因植物(Cry1A蛋白)的防治效果在不同地點、不同時間、不同遺傳背景也都是穩(wěn)定一致的。

6、簡單、方便、經濟。現有技術使用的頻振式殺蟲燈的一次性投入較大，且操作不當還有電擊傷人的危險；本發(fā)明只需種植能夠表達Cry1A蛋白的轉基因植物即可，而不需要采用其它措施，從而節(jié)省了大量人力、物力和財力。

7、效果徹底?，F有技術使用的控制勞氏黏蟲害蟲的方法，其效果是不徹底的，只起到減輕作用；而本發(fā)明轉基因植物(Cry1A蛋白)可以造成初孵勞氏黏蟲幼蟲的大量死亡，且對小部分存活幼蟲發(fā)育進度造成極大的抑制，3天后幼蟲基本仍處于初孵狀態(tài)，都是明顯的發(fā)育不良，且已停止發(fā)育，在田間自然環(huán)境中無法存活，而轉基因植物大體上只受到輕微損傷。

下面通過附圖和實施例，對本發(fā)明的技術方案做進一步的詳細描述。

附圖說明

圖1為本發(fā)明殺蟲蛋白的用途的含有Cry1A核苷酸序列的重組克隆載體DBN01-T構建流程圖；

圖2為本發(fā)明殺蟲蛋白的用途的含有Cry1A核苷酸序列的重組表達載體DBN100738構建流程圖。

具體實施方式

下面通過具體實施例進一步說明本發(fā)明殺蟲蛋白的用途的技術方案。

第一實施例、基因的獲得和合成

1、獲得核苷酸序列

Cry1Ab-01殺蟲蛋白質的氨基酸序列(818個氨基酸)，如序列表中SEQ ID NO:1所示；編碼相應于所述Cry1Ab-01殺蟲蛋白質的氨基酸序列的Cry1Ab-01核苷酸序列(2457個核苷酸)，如序列表中SEQ ID NO:5所示。

Cry1Ab-02殺蟲蛋白質的氨基酸序列(615個氨基酸)，如序列表中SEQ ID NO:2所示；編碼相應于所述Cry1Ab-02殺蟲蛋白質的氨基酸序列的Cry1Ab-02核苷酸序列(1848個核苷酸)，如序列表中SEQ ID NO:6所示。

Cry1A.105殺蟲蛋白質的氨基酸序列(1177個氨基酸)，如序列表中SEQ ID NO:3所示；編碼相應于所述Cry1A.105殺蟲蛋白質的氨基酸序列的Cry1A.105核苷酸序列(3534個核苷酸)，如序列表中SEQ ID NO:7所示。

Cry1Ac殺蟲蛋白質的氨基酸序列(1178個氨基酸)，如序列表SEQ ID NO:4所示；編碼相應于所述Cry1Ac殺蟲蛋白質的氨基酸序列的Cry1Ac核苷酸序列(3537個核苷酸)，如序列表中SEQ ID NO:8所示。

編碼Vip3A殺蟲蛋白質的氨基酸序列(789個氨基酸)的Vip3A核苷酸序列(2370個核苷酸)，如序列表中SEQ ID NO:9所示。

編碼Cry2Ab殺蟲蛋白質的氨基酸序列(634個氨基酸)的Cry2Ab核苷酸序列(1905個核苷酸)，如序列表中SEQ ID NO:10所示。

2、合成上述核苷酸序列

所述Cry1Ab-01核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:5所示)、所述Cry1Ab-02核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:6所示)、所述Cry1A.105核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:7所示)、所述Cry1Ac核苷酸序列(如序列表SEQ ID NO:8)、所述Vip3A核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:9所示)和所述Cry2Ab核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:10所示)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。合成的所述Cry1Ab-01核苷酸序列(SEQ ID NO:5)的5’端還連接有NcoI酶切位點，所述Cry1Ab-01核苷酸序列(SEQ ID NO:5)的3’端還連接有SwaI酶切位點；合成的所述Cry1Ab-02核苷酸序列(SEQ ID NO:6)的5’端還連接有NcoI酶切位點，所述Cry1Ab-02核苷酸序列(SEQ ID NO:6)的3’端還連接有SwaI酶切位點；合成的所述Cry1A.105核苷酸序列(SEQ ID NO:7)的5’端還連接有NcoI酶切位點，所述Cry1A.105核苷酸序列(SEQ ID NO:7)的3’端還連接有SwaI酶切位點；合成的所述Cry1Ac核苷酸序列(SEQ ID NO:8)的5’端還連接有NcoI酶切位點，所述Cry1Ac核苷酸序列(SEQ ID NO:8)的3’端還連接有SwaI酶切位點；合成的所述Vip3A核苷酸序列(SEQ ID NO:9)的5’端還連接有AscI酶切位點，所述Vip3A核苷酸序列(SEQ ID NO:9)的3’端還連接有BamHI酶切位點；合成的所述Cry2Ab核苷酸序列(SEQ ID NO:10)的5’端還連接有AscI酶切位點，所述Cry2Ab核苷酸序列(SEQ ID NO:10)的3’端還連接有BamHI酶切位點。

第二實施例、重組表達載體的構建及重組表達載體轉化農桿菌

1、構建含有Cry1A基因的重組克隆載體

將合成的Cry1Ab-01核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T(Promega，Madison，USA，CAT：A3600)上，操作步驟按Promega公司產品pGEM-T載體說明書進行，得到重組克隆載體DBN01-T，其構建流程如圖1所示(其中，Amp表示氨芐青霉素抗性基因；f1表示噬菌體f1的復制起點；LacZ為LacZ起始密碼子；SP6為SP6 RNA聚合酶啟動子；T7為T7 RNA聚合酶啟動子；Cry1Ab-01為Cry1Ab-01核苷酸序列(SEQ ID NO:5)；MCS為多克隆位點)。

然后將重組克隆載體DBN01-T用熱激方法轉化大腸桿菌T1感受態(tài)細胞(Transgen，Beijing，China，CAT：CD501)，其熱激條件為：50μl大腸桿菌T1感受態(tài)細胞、10μl質粒DNA(重組克隆載體DBN01-T)，42℃水浴30秒；37℃振蕩培養(yǎng)1小時(100rpm轉速下搖床搖動)，在表面涂有IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的氨芐青霉素(100mg/L)的LB平板(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、瓊脂15g/L，用NaOH調pH至7.5)上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、氨芐青霉素100mg/L，用NaOH調pH至7.5)中于溫度37℃條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質粒：將菌液在12000rpm轉速下離心1min，去上清液，沉淀菌體用100μl冰預冷的溶液I(25mM Tris-HCl、10mM EDTA(乙二胺四乙酸)、50mM葡萄糖，pH8.0)懸?。患尤?50μl新配制的溶液II(0.2M NaOH、1％SDS(十二烷基硫酸鈉))，將管子顛倒4次，混合，置冰上3-5min；加入150μl冰冷的溶液III(4M醋酸鉀、2M醋酸)，立即充分混勻，冰上放置5-10min；于溫度4℃、轉速12000rpm條件下離心5min，在上清液中加入2倍體積無水乙醇，混勻后室溫放置5min；于溫度4℃、轉速12000rpm條件下離心5min，棄上清液，沉淀用濃度(V/V)為70％的乙醇洗滌后晾干；加入30μl含RNase(20μg/ml)的TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)溶解沉淀；于溫度37℃下水浴30min，消化RNA；于溫度-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

提取的質粒經KpnI和BglI酶切鑒定后，對陽性克隆進行測序驗證，結果表明重組克隆載體DBN01-T中插入的所述Cry1Ab-01核苷酸序列為序列表中(SEQ ID NO:5)所示的核苷酸序列，即Cry1Ab-01核苷酸序列正確插入。

按照上述構建重組克隆載體DBN01-T的方法，將合成的所述Cry1Ab-02核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T上，得到重組克隆載體DBN02-T，其中，Cry1Ab-02為Cry1Ab-02核苷酸序列(SEQ ID NO:6)。酶切和測序驗證重組克隆載體DBN02-T中所述Cry1Ab-02核苷酸序列正確插入。

按照上述構建重組克隆載體DBN01-T的方法，將合成的所述Cry1A.105核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T上，得到重組克隆載體DBN03-T，其中，Cry1A.105為Cry1A.105核苷酸序列(SEQ ID NO:7)。酶切和測序驗證重組克隆載體DBN03-T中所述Cry1A.105核苷酸序列正確插入。

按照上述構建重組克隆載體DBN01-T的方法，將合成的所述Cry1Ac核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T上，得到重組克隆載體DBN04-T，其中，Cry1Ac為Cry1Ac核苷酸序列(SEQ ID NO:8)。酶切和測序驗證重組克隆載體DBN04-T中所述Cry1Ac核苷酸序列正確插入。

按照上述構建重組克隆載體DBN01-T的方法，將合成的所述Vip3A核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T上，得到重組克隆載體DBN05-T，其中，Vip3A為Vip3A核苷酸序列(SEQ ID NO:9)。酶切和測序驗證重組克隆載體DBN05-T中所述Vip3A核苷酸序列正確插入。

按照上述構建重組克隆載體DBN01-T的方法，將合成的所述Cry2Ab核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T上，得到重組克隆載體DBN06-T，其中，Cry2Ab為Cry2Ab核苷酸序列(SEQ ID NO:10)。酶切和測序驗證重組克隆載體DBN06-T中所述Cry2Ab核苷酸序列正確插入。

2、構建含有Cry1A基因的重組表達載體

用限制性內切酶NcoI和SwaI分別酶切重組克隆載體DBN01-T和表達載體DBNBC-01(載體骨架：pCAMBIA2301(CAMBIA機構可以提供))，將切下的Cry1Ab-01核苷酸序列片段插到表達載體DBNBC-01的NcoI和SwaI位點之間，利用常規(guī)的酶切方法構建載體是本領域技術人員所熟知的，構建成重組表達載體DBN100738，其構建流程如圖2所示(Kan：卡那霉素基因；RB：右邊界；prUbi：玉米泛素(Ubiquitin)基因啟動子(SEQ ID NO:11)；Cry1Ab-01：Cry1Ab-01核苷酸序列(SEQ ID NO:5)；tNos：胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQ ID NO:12)；PMI：磷酸甘露糖異構酶基因(SEQ ID NO:13)；LB：左邊界)。

將重組表達載體DBN100738用熱激方法轉化大腸桿菌T1感受態(tài)細胞，其熱激條件為：50μl大腸桿菌T1感受態(tài)細胞、10μl質粒DNA(重組表達載體DBN100738)，42℃水浴30秒；37℃水浴1小時(100rpm轉速下搖床搖動)；然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固體平板(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、瓊脂15g/L，用NaOH調pH至7.5)上于溫度37℃條件下培養(yǎng)12小時，挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、卡那霉素50mg/L，用NaOH調pH至7.5)中于溫度37℃條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質粒。將提取的質粒用限制性內切酶NcoI和SwaI酶切后鑒定，并將陽性克隆進行測序鑒定，結果表明重組表達載體DBN100738在NcoI和SwaI位點間的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO:5所示核苷酸序列，即Cry1Ab-01核苷酸序列。

按照上述構建重組表達載體DBN100738的方法，將NcoI和SwaI、AscI和BamHI分別酶切重組克隆載體DBN01-T和DBN05-T切下的所述Cry1Ab-01核苷酸序列和Vip3A核苷酸序列插入表達載體DBNBC-01，得到重組表達載體DBN100053。酶切和測序驗證重組表達載體DBN100053中的核苷酸序列含有為序列表中SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9所示核苷酸序列，即Cry1Ab-01核苷酸序列和Vip3A核苷酸序列。所述Cry1Ab-01核苷酸序列和所述Vip3A核苷酸序列可以分別連接所述Ubi啟動子和Nos終止子。

按照上述構建重組表達載體DBN100738的方法，將NcoI和SwaI酶切重組克隆載體DBN02-T切下的所述Cry1Ab-02核苷酸序列插入表達載體DBNBC-01，得到重組表達載體DBN100106。酶切和測序驗證重組表達載體DBN100106中的核苷酸序列含有為序列表中SEQ ID NO:6所示核苷酸序列，即Cry1Ab-02核苷酸序列。所述Cry1Ab-02核苷酸序列可以連接所述Ubi啟動子和Nos終止子。

按照上述構建重組表達載體DBN100738的方法，將NcoI和SwaI酶切重組克隆載體DBN04-T切下的所述Cry1Ac核苷酸序列插入表達載體DBNBC-01，得到重組表達載體DBN100734。酶切和測序驗證重組表達載體DBN100734中的核苷酸序列含有為序列表中SEQ ID NO:8所示核苷酸序列，即Cry1Ac核苷酸序列。所述Cry1Ac核苷酸序列可以連接所述Ubi啟動子和Nos終止子。

按照上述構建重組表達載體DBN100738的方法，將NcoI和SwaI酶切重組克隆載體DBN03-T切下的所述Cry1A.105核苷酸序列插入表達載體DBNBC-01，得到重組表達載體DBN100029。酶切和測序驗證重組表達載體DBN100029中的核苷酸序列含有為序列表中SEQ ID NO:7所示核苷酸序列，即Cry1A.105核苷酸序列。所述Cry1A.105核苷酸序列可以連接所述Ubi啟動子和Nos終止子。

按照上述構建重組表達載體DBN100738的方法，將NcoI和SwaI、AscI和BamHI分別酶切重組克隆載體DBN03-T和DBN06-T切下的所述Cry1A.105核苷酸序列和Cry2Ab核苷酸序列插入表達載體DBNBC-01，得到重組表達載體DBN100076。酶切和測序驗證重組表達載體DBN100076中的核苷酸序列含有為序列表中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:10所示核苷酸序列，即Cry1A.105核苷酸序列和Cry2Ab核苷酸序列。所述Cry1A.105核苷酸序列和所述Cry2Ab核苷酸序列可以分別連接所述Ubi啟動子和Nos終止子。

3、重組表達載體轉化農桿菌

對己經構建正確的重組表達載體DBN100738、DBN100053、DBN100106、DBN100029、DBN100076和DBN100734用液氮法轉化到農桿菌LBA4404(Invitrgen，Chicago，USA，CAT：18313-015)中，其轉化條件為：100μl農桿菌LBA4404、3μl質粒DNA(重組表達載體)；置于液氮中10分鐘，37℃溫水浴10分鐘；將轉化后的農桿菌LBA4404接種于LB試管中于溫度28℃、轉速為200rpm條件下培養(yǎng)2小時，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素的LB平板上直至長出陽性單克隆，挑取單克隆培養(yǎng)并提取其質粒，用限制性內切酶對重組表達載體DBN100738、DBN100053、DBN100106、DBN100029、DBN100076和DBN100734酶切后進行驗證，結果表明重組表達載體DBN100738、DBN100053、DBN100106、DBN100029、DBN100076和DBN100734結構完全正確。

第三實施例、轉基因玉米植株的獲得

按照常規(guī)采用的農桿菌侵染法，將無菌培養(yǎng)的玉米品種綜31(Z31)的幼胚與第二實施例中3所述的重組表達載體轉化的農桿菌共培養(yǎng)，以將第二實施例中2構建的重組表達載體DBN100738、DBN100053、DBN100106、DBN100029、DBN100076和DBN100734中的T-DNA(包括玉米Ubiquitin基因的啟動子序列、Cry1Ab-01核苷酸序列、Cry1Ab-02核苷酸序列、Cry1A.105核苷酸序列、Cry1Ac核苷酸序列、Vip3A核苷酸序列、Cry2Ab核苷酸序列、PMI基因和Nos終止子序列)轉入到玉米染色體組中，獲得了轉入Cry1Ab-01核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1Ab-02核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1Ab-01-Vip3A核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1A.105核苷酸序列的玉米植株和轉入Cry1A.105-Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株和轉入Cry1Ac核苷酸序列的玉米植株；同時以野生型玉米植株作為對照。

對于農桿菌介導的玉米轉化，簡要地，從玉米中分離未成熟的幼胚，用農桿菌懸浮液接觸幼胚，其中農桿菌能夠將能夠將Cry1Ab-01核苷酸序列、Cry1Ab-02核苷酸序列、Cry1Ac核苷酸序列、Cry1Ab-01-Vip3A核苷酸序列、Cry1A.105核苷酸序列和/或Cry1A.105-Cry2Ab核苷酸序列傳遞至幼胚之一的至少一個細胞(步驟1：侵染步驟)，在此步驟中，幼胚優(yōu)選地浸入農桿菌懸浮液(OD₆₆₀＝0.4-0.6，侵染培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖68.5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1mg/L，pH5.3))中以啟動接種。幼胚與農桿菌共培養(yǎng)一段時期(3天)(步驟2：共培養(yǎng)步驟)。優(yōu)選地，幼胚在侵染步驟后在固體培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS)100mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1mg/L、瓊脂8g/L，pH5.8)上培養(yǎng)。在此共培養(yǎng)階段后，可以有一個選擇性的“恢復”步驟。在“恢復”步驟中，恢復培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1mg/L、瓊脂8g/L，pH5.8)中至少存在一種己知抑制農桿菌生長的抗生素(頭孢霉素)，不添加植物轉化體的選擇劑(步驟3：恢復步驟)。優(yōu)選地，幼胚在有抗生素但沒有選擇劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以消除農桿菌并為侵染細胞提供恢復期。接著，接種的幼胚在含選擇劑(甘露糖)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇生長著的轉化愈傷組織(步驟4：選擇步驟)。優(yōu)選地，幼胚在有選擇劑的篩選固體培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖5g/L、甘露糖12.5g/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1mg/L、瓊脂8g/L，pH5.8)上培養(yǎng)，導致轉化的細胞選擇性生長。然后，愈傷組織再生成植物(步驟5：再生步驟)，優(yōu)選地，在含選擇劑的培養(yǎng)基上生長的愈傷組織在固體培養(yǎng)基(MS分化培養(yǎng)基和MS生根培養(yǎng)基)上培養(yǎng)以再生植物。

篩選得到的抗性愈傷組織轉移到所述MS分化培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、6-芐基腺嘌呤2mg/L、甘露糖5g/L、瓊脂8g/L，pH5.8)上，25℃下培養(yǎng)分化。分化出來的小苗轉移到所述MS生根培養(yǎng)基(MS鹽2.15g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、吲哚-3-乙酸1mg/L、瓊脂8g/L，pH5.8)上，25℃下培養(yǎng)至約10cm高，移至溫室培養(yǎng)至結實。在溫室中，每天于28℃下培養(yǎng)16小時，再于20℃下培養(yǎng)8小時。

第四實施例、用TaqMan驗證轉基因植株

分別取轉入Cry1Ab-01核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1Ab-02核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1Ab-01-Vip3A核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1A.105核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1A.105-Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株和轉入Cry1Ac核苷酸序列的玉米植株的葉片約100mg作為樣品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因組DNA，通過Taqman探針熒光定量PCR方法檢測Cry1Ab-01基因、Cry1Ab-02基因、Cry1A.105基因、Cry1Ac基因、Vip3A基因和Cry2Ab基因的拷貝數。同時以野生型玉米植株作為對照，按照上述方法進行檢測分析。實驗設3次重復，取平均值。

檢測Cry1Ab-01基因、Cry1Ab-02基因、Cry1A.105基因、Cry1Ac基因、Vip3A基因和Cry2Ab基因拷貝數的具體方法如下：

步驟11、分別取轉入Cry1Ab-01核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1Ab-02核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1Ab-01-Vip3A核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1A.105核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1A.105-Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1Ac核苷酸序列的玉米植株和野生型玉米植株的葉片各100mg，分別在研缽中用液氮研成勻漿，每個樣品取3個重復；

步驟12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述樣品的基因組DNA，具體方法參考其產品說明書；

步驟13、用NanoDrop 2000(Thermo Scientific)測定上述樣品的基因組DNA濃度；

步驟14、調整上述樣品的基因組DNA濃度至同一濃度值，所述濃度值的范圍為80-100ng/μl；

步驟15、采用Taqman探針熒光定量PCR方法鑒定樣品的拷貝數，以經過鑒定已知拷貝數的樣品作為標準品，以野生型玉米植株的樣品作為對照，每個樣品3個重復，取其平均值；熒光定量PCR引物和探針序列分別是：

以下引物和探針用來檢測Cry1Ab-01核苷酸序列：

引物1：CGAACTACGACTCCCGCAC如序列表中SEQ ID NO:14所示；

引物2：GTAGATTTCGCGGGTCAGTTG如序列表中SEQ ID NO:15所示；

探針1：CTACCCGATCCGCACCGTGTCC如序列表中SEQ ID NO:16所示；

以下引物和探針用來檢測Cry1Ab-02核苷酸序列：

引物3：TGCGTATTCAATTCAACGACATG如序列表中SEQ ID NO:17所示；

引物4：CTTGGTAGTTCTGGACTGCGAAC如序列表中SEQ ID NO:18所示；

探針2：CAGCGCCTTGACCACAGCTATCCC如序列表中SEQ ID NO:19所示；

以下引物和探針用來檢測Vip3A核苷酸序列：

引物5：ATTCTCGAAATCTCCCCTAGCG如序列表中SEQ ID NO:20所示；

引物6：GCTGCCAGTGGATGTCCAG如序列表中SEQ ID NO:21所示；

探針3：CTCCTGAGCCCCGAGCTGATTAACACC如序列表中SEQ ID NO:22所示；

以下引物和探針用來檢測Cry1A.105核苷酸序列：

引物7：ATCGTGAACAACCAGAACCAGTG如序列表中SEQ ID NO:23所示；

引物8：CTCCAGGATCTCGATCTCCG如序列表中SEQ ID NO:24所示；

探針4：CGTGCCGTACAACTGCCTGAACAACC如序列表中SEQ ID NO:25所示；

以下引物和探針用來檢測Cry2Ab核苷酸序列：

引物9：TCATTTGGGGCTTCGTCG如序列表中SEQ ID NO:26所示；

引物10：TGATTGATCAGCTGCTCAACCT如序列表中SEQ ID NO:27所示；

探針5：CCAGTGGGATGCGTTCCTCGCTC如序列表中SEQ ID NO:28所示；

以下引物和探針用來檢測Cry1Ac核苷酸序列：

引物11：CATTCAATTCAATGACATGAACAGC如序列表中SEQ ID NO:29所示；

引物12：GACAAGTGCAGGTTGGCAGC如序列表中SEQ ID NO:30所示；

探針6：TCCGCTCTTCGCCGTTCAGAATTACC如序列表中SEQ ID NO:31所示；

PCR反應體系為：

所述50×引物/探針混合物包含1mM濃度的每種引物各45μl，100μM濃度的探針50μl和860μl 1×TE緩沖液，并且在4℃，貯藏在琥珀試管中。

PCR反應條件為：

利用SDS2.3軟件(Applied Biosystems)分析數據。

實驗結果表明，Cry1Ab-01核苷酸序列、Cry1Ab-02核苷酸序列、Cry1Ab-01-Vp3A核苷酸序列、Cry1A.105核苷酸序列、Cry1A.105-Cry2Ab核苷酸序列和Cry1Ac核苷酸序列均已整合到所檢測的玉米植株的染色體組中，而且轉入Cry1Ab-01核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1Ab-02核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1Ab-01-Vip3A核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1A.105核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1A.105-Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株和轉入Cry1Ac核苷酸序列的玉米植株均獲得了單拷貝的轉基因玉米植株。

第五實施例、轉基因玉米植株的抗蟲效果檢測

將轉入Cry1Ab-01核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1Ab-01-Vip3A核苷酸序列的玉米植株；轉入Cry1Ab-02核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1A.105核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1A.105-Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株和轉入Cry1Ac核苷酸序列的的玉米植株；相應的野生型玉米植株，以及經Taqman鑒定為非轉基因的玉米植株對勞氏黏蟲進行抗蟲效果檢測。

分別取轉入Cry1Ab-01核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1Ab-01-Vip3A核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1Ab-02核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1A.105核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1A.105-Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1Ac核苷酸序列的的玉米植株、野生型玉米植株和經Taqman鑒定為非轉基因的玉米植株(V3-V4期)的新鮮葉片(心葉)，用無菌水沖洗干凈并用紗布將葉片上的水吸干，然后將玉米葉片去除葉脈，同時剪成約1cm×4cm的長條狀，取1片剪后的長條狀葉片放入圓形塑料培養(yǎng)皿底部的保濕濾紙上，每個培養(yǎng)皿中放10頭勞氏黏蟲(初孵幼蟲)，蟲試培養(yǎng)皿加蓋后，在溫度25-28℃、相對濕度70％-80％、光周期(光/暗)16:8的條件下放置3天后，統(tǒng)計勞氏黏蟲幼蟲的致死率和葉片損傷情況，致死率＝死亡蟲數/接蟲總數×100％。轉入Cry1Ab-01核苷酸序列的共3個株系(S1、S2和S3)，轉入Cry1Ab-02核苷酸序列的共3個株系(S7、S8、S9)，轉入Cry1Ab-01-Vip3A核苷酸序列的共3個株系(S4、S5和S6)，轉入Cry1A.105核苷酸序列的共3個株系(S10、S11和S12)，轉入Cry1A.105-Cry2Ab核苷酸序列的共3個株系(S13、S14和S15)，轉入Cry1Ac核苷酸序列的共3個株系(S16、S17和S18)，經Taqman鑒定為非轉基因的(NGM)共1個株系，野生型的(CK)共1個株系；從每個株系選5株進行測試，每株重復3次。結果如表1所示。

表1、轉基因玉米植株接種勞氏黏蟲的抗蟲實驗結果

表1的結果表明：轉入Cry1Ab-01核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1Ab-02核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1Ab-01-Vip3A核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1A.105核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1A.105-Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株和轉入Cry1Ac核苷酸序列的玉米植株對勞氏黏蟲均具有較好的殺蟲效果，初孵幼蟲的致死率均在85％以上，尤其是含有Cry1Ab和Cry1A.105成分的玉米植株的初孵幼蟲致死率甚至達到97％以上；而野生型玉米植株及Taqman鑒定為非轉基因的植株的初孵幼蟲致死率一般在15％左右。

檢測結果還表明，轉入Cry1Ab-01核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1Ab-02核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1Ab-01-Vip3A核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1A.105核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1A.105-Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株和轉入Cry1Ac核苷酸序列的玉米植株大體上只受到輕微損傷，肉眼幾乎無法辨別出勞氏黏蟲的取食痕跡。

由此證明轉入Cry1Ab-01核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1Ab-02核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1Ab-01-Vip3A核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1A.105核苷酸序列的玉米植株、轉入Cry1A.105-Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株和轉入Cry1Ac核苷酸序列的玉米植株都顯示出高抗勞氏黏蟲的活性，這種活性足以對勞氏黏蟲的生長產生不良效應從而使其在田間得以控制。同時通過控制勞氏黏蟲為害，也有可能降低玉米上病害的發(fā)生，極大的提高玉米的產量及品質。

綜上所述，本發(fā)明殺蟲蛋白的用途通過植物體內產生能夠殺死勞氏黏蟲的Cry1A蛋白來控制勞氏黏蟲害蟲；與現有技術使用的農業(yè)防治方法、化學防治方法和物理防治方法相比，本發(fā)明對植物進行全生育期、全植株的保護以防治勞氏黏蟲害蟲的侵害，且無污染、無殘留，效果穩(wěn)定、徹底，簡單、方便、經濟。

最后所應說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的精神和范圍。