本發(fā)明涉及植物育種領(lǐng)域，更特別地，涉及用于得到對鹽脅迫具有增強(qiáng)抗性的植物的質(zhì)粒載體和方法。

背景技術(shù)：

植物經(jīng)常處于逆境脅迫的環(huán)境中，植物應(yīng)對脅迫常見的響應(yīng)就是促進(jìn)活性氧的積累(Halliwell et al.，1998)。RCD1蛋白是植物逆境和生長發(fā)育過程中一個重要的調(diào)節(jié)因子(Jaspers et al.，2009；Teotia S et al.，2009)。SRO是植物特有的小蛋白家族，在擬南芥中，該家族共有六個成員，包括RCD1和5個SROs(SIMILAR-TO-RCD-ONE)，即AtSRO1-AtSRO5(Jaspers et al.，2009)。RCD1蛋白包含一個保守的球狀WWE結(jié)構(gòu)域和一個PARP(poly ADP-ribose polymerase)結(jié)構(gòu)域，WWE結(jié)構(gòu)域可以調(diào)節(jié)特定蛋白質(zhì)之間的相互作用(Aravind et al.，2001)。

土壤鹽漬度是一個影響植物生長和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力的重要環(huán)境因素，鹽漬土中的Na⁺在植物體細(xì)胞質(zhì)中過度積累對植物生長發(fā)育是不利的(Liu et al.，2001)。SOS(saltoverly sensitive)途徑負(fù)責(zé)維持植物體內(nèi)的Na⁺平衡(Zhu et al.，2002)，Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SOS1定位于質(zhì)膜上，它可以將細(xì)胞內(nèi)的Na⁺排出(Qiu et al.，2002)。擬南芥中，過量表達(dá)SOS1可以提高抗鹽脅迫能力。前人研究表明，擬南芥SOS1和RCD1在鹽脅迫和氧化脅迫時發(fā)生相互作用，共同參與植物的抗鹽和抗氧化途徑(Katiyar-Agarwal et al.，2006)。

植物體內(nèi)對氧化脅迫的響應(yīng)有利于植物的正常生長發(fā)育。前人研究表明酵母的Yap1(Yeast activator proteins1)參與酵母細(xì)胞對H₂O₂引起的氧化脅迫反應(yīng)，它作為H₂O₂轉(zhuǎn)錄因子在氧化脅迫信號中扮演重要角色(Carmel‐Harel et al.，2001；Fernandes et al.，1997)。植物中有許多參與氧化脅迫的相關(guān)因子已被深入研究，比如致病相關(guān)蛋白(RP)、抗壞血酸氧化酶(APX)、苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)等(Teotia et al.，2009)。Belles-Boix等研究表明，擬南芥RCD1可以增強(qiáng)酵母抗氧化能力并互補(bǔ)Yap1突變酵母表型，表明AtRCD1在擬南芥的氧化脅迫中扮演重要的角色(Belles-Boix et al.，2000)。擬南芥突變體rcd1-1表現(xiàn)出對臭氧和超氧化物超敏感，引起超氧根離子的積累，并在短時間內(nèi)傳播病態(tài)(Overmyer et al.，2005)。此外，突變體還表現(xiàn)出對脫落酸、乙烯、茉莉酸甲酯敏感度降低，并且這幾種植物激素調(diào)節(jié)基因的表達(dá)量也發(fā)生了改變(Overmyer et al.，2000)。因此，AtRCD1在調(diào)節(jié)擬南芥的生長發(fā)育及對環(huán)境脅迫的反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

擬南芥中，AtRCD1的同源基因AtSROs在PARP(Poly ADP-ribose polymerase)催化中心和C-末端的RST[RCD-SRO-TAF4(TATA-box-binding protein-associated factor 4)]結(jié)構(gòu)域上與AtRCD1具有高度保守性(Jaspers et al.，2009)。研究表明，AtSRO1與AtRCD1之間在功能上存在部分功能冗余,AtSRO1同樣參與到非生物脅迫反應(yīng)當(dāng)中(Ahlfors et al.，2009；Jaspers et al.，2009；Overmyer et al.，2000)，AtSRO5表達(dá)明顯受鹽脅迫誘導(dǎo)(Borsani et al.，2005)，AtSRO2、AtSRO3和AtSRO5也顯示出對多種非生物脅迫下轉(zhuǎn)錄子水平的變化,比如強(qiáng)光、鹽處理及O₃(Jaspers et al.，2010)。然而AtSRO4的研究相對較少，沒有相關(guān)類似的功能。

在擬南芥中RCD1已經(jīng)進(jìn)行了克隆和功能鑒定，但是在蘋果中的尚未見報道。因此，需要一種得到對鹽脅迫具有增強(qiáng)抗性的植物的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種用于得到對鹽脅迫具有增強(qiáng)抗性的植物的質(zhì)粒載體，其包含MdRCD1基因表達(dá)框和篩選標(biāo)記，所述MdRCD1基因表達(dá)框由包含在植物中組成型表達(dá)的強(qiáng)啟動子和由所述強(qiáng)啟動子控制表達(dá)的MdRCD1基因，所述MdRCD1基因表達(dá)的蛋白序列如SEQ ID NO:1所示。

優(yōu)選地，所述MdRCD1基因的序列如SEQ ID NO:2所示。

優(yōu)選地，所述植物是擬南芥、蘋果、桃、梨、楊樹、小麥、玉米或水稻。

優(yōu)選地，所述質(zhì)粒載體由所述MdRCD1基因順著CaMV35S啟動子的轉(zhuǎn)錄方向插入到PRI101質(zhì)粒的SalⅠ和EcoRⅠ之間得到。

本發(fā)明還提供了一種用于得到對鹽脅迫具有增強(qiáng)抗性的植物的方法，其包括以下步驟：將所述質(zhì)粒載體導(dǎo)入植物的愈傷組織細(xì)胞中，篩選攜帶有所述質(zhì)粒載體的愈傷組織細(xì)胞，并將其培育成植株，即得到所述對鹽脅迫具有增強(qiáng)抗性的植物。

優(yōu)選地，所述方法包括以下步驟：

1)用所述質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，得到攜帶有所述質(zhì)粒載體的農(nóng)桿菌LBA4404；

2)用所述攜帶有所述質(zhì)粒載體的農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化所述植物愈傷組織細(xì)胞共培養(yǎng)，得到被所述質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的植物；

3)通過所述篩選標(biāo)記篩選被所述轉(zhuǎn)化的植物愈傷組織細(xì)胞；

4)通過組織培養(yǎng)將篩選得到的所述被轉(zhuǎn)化的植物愈傷組織細(xì)胞培育成植株，即得到所述對鹽脅迫具有增強(qiáng)抗性的植物。

優(yōu)選地，所述植物是擬南芥、蘋果、桃、梨、楊樹、小麥、玉米或水稻。

優(yōu)選地，所述植物是蘋果。

優(yōu)選地，所述質(zhì)粒載體通過將所述MdRCD1基因順著CaMV35S啟動子的轉(zhuǎn)錄方向插入到PRI101質(zhì)粒的SalⅠ和EcoRⅠ之間來得到。

優(yōu)選地，所述方法包括以下步驟：

1)通過電轉(zhuǎn)法將所述質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入LB4404農(nóng)桿菌中，通過卡那霉素和PCR篩選攜帶有所述質(zhì)粒載體的LB4404；

2)然后將攜帶有所述質(zhì)粒載體的LB4404接種于10mL包含50mg/L卡那霉素的的YEP液體培養(yǎng)基中，于28℃、200rpm下振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.6-0.8，離心收集菌體，用MS液體培養(yǎng)基重懸稀釋20倍，得到轉(zhuǎn)化用的菌液，將蘋果愈傷組織在所述轉(zhuǎn)化用的菌液中浸泡10min，期間多次搖晃，除去所述轉(zhuǎn)化用的菌液，將經(jīng)浸泡的蘋果愈傷組織轉(zhuǎn)移至含有1.0mg/L 6-BA、1.0mg/L2,4-D、30g/L蔗糖和7.5g/L瓊脂的pH5.8的MS培養(yǎng)基中，于26℃黑暗下培養(yǎng)2d；

3)將步驟2)得到蘋果愈傷組織用無菌雙蒸水清洗2-3次后，均勻地鋪到含有500mg/L頭孢霉素、30mg/L卡那霉素、1.0mg/L 6-BA、1.0mg/L2,4-D、30g/L蔗糖和7.5g/L瓊脂的pH5.8的MS培養(yǎng)基的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，得到轉(zhuǎn)染了所述質(zhì)粒載體的蘋果愈傷組織細(xì)胞；

4)使用含有500mg/L頭孢霉素、30mg/L卡那霉素、1.0mg/L 6-BA、1.0mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖和7.5g/L瓊脂的pH5.8的MS培養(yǎng)基將所述轉(zhuǎn)染了所述質(zhì)粒載體的蘋果愈傷組織細(xì)胞培育成植株，即得到所述對鹽脅迫具有增強(qiáng)抗性的植物。

附圖說明

圖1為蘋果MdRCD1基因編碼區(qū)全長的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳照片；

圖2為轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織中MdRCD1的相對表達(dá)量，以王林蘋果愈傷組織中的MdRCD1相對表達(dá)量為1。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)例和附圖對本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

基于蘋果愈傷組織是單細(xì)胞組織，具有繁殖能力強(qiáng)、離體培養(yǎng)再生能力強(qiáng)、遺傳轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點(diǎn)，是蘋果研究領(lǐng)域普遍的研究材料。

1.對蘋果中MdRCD1基因的研究

發(fā)明人檢測了MdRCD1基因在嘎啦蘋果中無脅迫條件下和高鹽濃度下的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)MdRCD1基因在高鹽濃度下的上調(diào)表達(dá)，暗示MdRCD1基因可能蘋果的鹽脅迫抗性有關(guān)。

2.蘋果中MdRCD1基因的克隆以及表達(dá)載體的構(gòu)建

1)發(fā)明人通過使用引物1：5’-ATGGAAGCAAAGGTCGCAAAG-3’(SEQ ID NO:3)和引物2：5’-CTCATTGCTTTTATGAGGT-3’(SEQ ID NO:4)，通過RT-PCR從嘎啦蘋果擴(kuò)增得到MdRCD1基因片段(圖1)，將其連接到pMD18-T質(zhì)粒上，得到pMD18-T-MdRCD1質(zhì)粒，經(jīng)測序得到正確的克隆，該基因的基因序列如SEQ ID NO:2所示，基因表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

2)使用引物3：5’-GTCGACATGGAAGCAAAGGTCGCAAAG-3’(SEQ ID NO:5，下劃線標(biāo)示SalⅠ酶切位點(diǎn))和引物4：5’-GAATTCCTCATTGCTTTTATGAGGT-3’(SEQ ID NO:6，下劃線標(biāo)示EcoRⅠ酶切位點(diǎn))，從上述質(zhì)粒PCR擴(kuò)增得到帶有SalI和EcoRI酶切位點(diǎn)的MdRCD1基因片段；

3)將上述片段經(jīng)SalⅠ和EcoRⅠ雙酶切后連接到同樣經(jīng)SalⅠ和EcoRⅠ雙酶切的PRI101質(zhì)粒質(zhì)粒上，篩選正確的陽性克隆，得到MdRCD1基因表達(dá)質(zhì)粒載體。

3.MdRCD1基因表達(dá)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化LB4404

通過電轉(zhuǎn)法將MdRCD1基因表達(dá)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入LB4404農(nóng)桿菌中，通過卡那霉素和PCR篩選攜帶有所述質(zhì)粒載體的LB4404；

4.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化王林蘋果愈傷組織細(xì)胞

將攜帶有MdRCD1基因表達(dá)質(zhì)粒載體的LB4404接種于10mL包含50mg/L卡那霉素的的YEP液體培養(yǎng)基中，于28℃、200rpm下振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.6-0.8，離心收集菌體，用MS液體培養(yǎng)基重懸稀釋20倍，得到轉(zhuǎn)化用的菌液，將蘋果愈傷組織在所述轉(zhuǎn)化用的菌液中浸泡10min，期間多次搖晃，除去所述轉(zhuǎn)化用的菌液，將經(jīng)浸泡的蘋果愈傷組織轉(zhuǎn)移至含有1.0mg/L 6-BA、1.0mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖和7.5g/L瓊脂的pH5.8的MS培養(yǎng)基中，于26℃黑暗下培養(yǎng)2d；

得到蘋果愈傷組織用無菌雙蒸水清洗2-3次后，均勻地鋪到含有500mg/L頭孢霉素、30mg/L卡那霉素、1.0mg/L 6-BA、1.0mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖和7.5g/L瓊脂的pH5.8的MS培養(yǎng)基的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，得到轉(zhuǎn)染了所述質(zhì)粒載體的蘋果愈傷組織細(xì)胞；

使用含有500mg/L頭孢霉素、30mg/L卡那霉素、1.0mg/L 6-BA、1.0mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖和7.5g/L瓊脂的pH5.8的MS培養(yǎng)基將所述轉(zhuǎn)染了所述質(zhì)粒載體的蘋果愈傷組織細(xì)胞培育成植株，即得到所述對鹽脅迫具有增強(qiáng)抗性的植物。

5.轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織抵抗鹽脅迫的分析

(1)MdRCD1基因在轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷中的相對表達(dá)量

利用篩選培養(yǎng)基(含100mg/L卡那霉素和500mg/L頭孢霉素)篩選抗卡那霉素陽性的候選轉(zhuǎn)基因株系，共獲得4個35S:MdRCD1陽性株系(1-4)；為進(jìn)一步鑒定轉(zhuǎn)基因株系，在進(jìn)行繼代培養(yǎng)時，每株系各取0.1g左右的愈傷組織，提取相應(yīng)的RNA，反轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行定量qRT-PCR檢測(具體方法見實(shí)例3)，以確定這些株系中MdRCD1基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，MdRCD1基因在1-4中均過量表達(dá)(圖2)。由于株系1中表達(dá)量較高，選擇株系1繼續(xù)擴(kuò)繁，為MdRCD1基因的進(jìn)一步功能鑒定準(zhǔn)備材料。

為了進(jìn)一步確定轉(zhuǎn)基因愈傷的功能，發(fā)明人對轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷進(jìn)行抗鹽能力分析。

(3)逆境處理：選擇生長狀態(tài)良好且均一的王林和蘋果愈傷，進(jìn)行不同濃度的鹽脅迫逆境處理。

(4)結(jié)果觀察：15天以后，對王林愈傷和轉(zhuǎn)基因愈傷在鹽脅迫條件下的生長狀況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：WL和MdRCD1-OX在0mmol·L-1的培養(yǎng)基上生長狀態(tài)基本一致，隨著鹽濃度的提高，它們的長勢越來越差，但是可以觀察到，過量表達(dá)MdRCD1的愈傷組織的長勢明顯好于WL愈傷。這些結(jié)果充分說明了MdRCD1基因是一個抗鹽相關(guān)的基因，該基因的過量表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷的抗鹽能力。

根據(jù)上述技術(shù)，本發(fā)明從蘋果中克隆了基因MdRCD1，通過遺傳轉(zhuǎn)化蘋果愈傷鑒定了其可以明顯提高抗鹽性，為進(jìn)一步研究MdRCD1的功能奠定了基礎(chǔ)，使其作為蘋果砧木抗逆性分子改良的候選基因。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。