本發(fā)明涉及一種提高芽胞桿菌生物量的芽胞桿菌，特別是提高芽胞桿菌生物量的基因工程改造方法。

背景技術(shù)：

芽胞桿菌是廣泛存在于自然界的一種革蘭氏陽性菌，大多數(shù)的芽胞桿菌被認(rèn)為是生物安全性菌株(GRAS)，通過芽胞桿菌發(fā)酵可以合成多種生物產(chǎn)品，如：細(xì)胞分裂素、絮凝劑、桿菌肽、聚γ-谷氨酸、地衣素、乙偶姻及丁二醇等。同時(shí)，芽胞桿菌也具有良好的外源蛋白分泌能力，具備成為良好外源蛋白表達(dá)宿主菌的條件。通過代謝工程改造和發(fā)酵工藝優(yōu)化，芽胞桿菌可以高效合成多種生物化工產(chǎn)品，滿足人類的不同需求。同時(shí)部分芽胞桿菌發(fā)酵還可以抑制枯萎病的發(fā)生。因此在芽胞桿菌的發(fā)酵生產(chǎn)中，無論是對于菌劑還是目標(biāo)化合物的合成，單位時(shí)間內(nèi)獲得最多的生物量具有重要的意義，而微生物生物量更是微生物生理研究及其工業(yè)應(yīng)用中必不可少的監(jiān)測參數(shù)。

Phop-phoR是芽胞桿菌中廣泛存在一種重要的雙組子調(diào)控因子，在低磷環(huán)境下，感應(yīng)激酶PhoR可以自磷酸化，并且將獲得的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到調(diào)控因子Phop上，從而激活phop的表達(dá)水平。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，基因phop對枯草芽胞桿菌NCD-2菌株中fengycin的合成具有正調(diào)控功能；PhoQ/PhoP是序列保守的銅綠假單胞菌二元信號(hào)傳導(dǎo)因子，其可以介導(dǎo)細(xì)菌對氨基糖苷類抗生素的耐藥性。與此同時(shí)，相關(guān)研究也指出，phop也可以直接負(fù)調(diào)控氮代謝相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響生物體對氮源的利用效率。phop的缺失可以顯著提高細(xì)胞對氮源的利用水平，從而提高菌體的生物量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種可以顯著提高芽胞桿菌的生物量的基因工程改造方法。

一種提高芽胞桿菌生物量的基因工程改造方法，針對芽胞桿菌，敲除其基因phop，獲得phop缺失的芽胞桿菌缺失株。所述的芽胞桿菌為枯草芽胞桿菌，地衣芽胞桿菌或解淀粉芽胞桿菌。

制備所述提高生物量的基因工程改造芽胞桿菌的方法，其步驟如下：

1)以芽胞桿菌基因組為模板，擴(kuò)增phop基因上下游片段，然后將該上下游片段連接起來，形成phop上下游同源臂；

2)將phop基因缺失片段插入敲除載體，構(gòu)建phop基因敲除載體；

3)將構(gòu)建的phop基因敲除載體電轉(zhuǎn)化至芽胞桿菌，通過同源雙交換，得到phop缺失的芽胞桿菌。

步驟1)中利用引物通過PCR的方法擴(kuò)增出phop上下游同源臂序列A和B；所述的引物，其中枯草芽胞桿菌中用于上下游同源臂擴(kuò)增的引物分別為Bs-phop-KF1/R1，Bs-phop-KF2/R2；地衣芽胞桿菌中用于上下游同源臂擴(kuò)增的引物分別為Bl-phop-KF1/R1，Bl-phop-KF2/R2；解淀粉芽胞桿菌中用于上下游同源臂擴(kuò)增的引物分別為Ba-phop-KF1/R1，Ba-phop-KF2/R2；步驟2)中通過SOE的方法將A和B連到一起，構(gòu)成A+B，隨后用XbaI和BamHI雙酶切A+B片段，并與經(jīng)相同內(nèi)切酶酶切后的質(zhì)粒連接；所述的質(zhì)粒為T₂(2)-Ori質(zhì)粒；步驟3)中通過電轉(zhuǎn)法將質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至芽胞桿菌。之后采用驗(yàn)證引物T2-F/R對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，并對陽性轉(zhuǎn)化子抽質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和測序驗(yàn)證；所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)條件為，發(fā)酵溫度25-45℃，250mL三角瓶中裝液量20-100mL，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，發(fā)酵周期48h。

附圖說明

圖1為基因phop敲除載體的構(gòu)建圖(上下游同源臂擴(kuò)增膠圖)；

圖2為敲除載體轉(zhuǎn)化枯草芽胞桿菌168菌落PCR驗(yàn)證圖；

圖3為枯草芽胞桿菌168△phop敲除菌株構(gòu)建驗(yàn)證PCR圖；

圖4為枯草芽胞桿菌168及168△phop生長曲線；

圖5為地衣芽胞桿菌WX-02及WX-02△phop生長曲線；

圖6為解淀粉芽孢桿菌LX-12及LX-12△phop生長曲線；

圖7為枯草芽胞桿菌168及168△phop生物量；

圖8為地衣芽胞桿菌WX-02及WX-02△phop生物量；

圖9為解淀粉芽胞桿菌LX-12及LX-12△phop生物量。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的優(yōu)越性作進(jìn)一步說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。

實(shí)施步驟一、芽胞桿菌中phop敲除載體的構(gòu)建

以枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)168(CCTCC NO：ATCC23857)為例介紹phop敲除載體的構(gòu)建。根據(jù)枯草芽胞桿菌168的全基因組序列及調(diào)控因子基因phop序列，設(shè)計(jì)引物，引物分別為Bs-phop-KF1/R1，Bs-phop-KF2/R2，采用PCR的方法擴(kuò)增出phop上下游同源臂序列A和B；并通過SOE的方法將A和B連到一起，構(gòu)成A+B，隨后用XbaI和BamHI雙酶切A+B片段，并與經(jīng)相同內(nèi)切酶酶切后的T₂(ori)質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化DH5α。采用驗(yàn)證引物T2-F/R對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，并對陽性轉(zhuǎn)化子克隆抽質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和測序驗(yàn)證，最終得到phop的敲除載體。

如下圖1所示為基因phop敲除載體的構(gòu)建圖(上下游同源臂擴(kuò)增膠圖)，泳道2、3分別為phop的上下游同源臂A和B。泳道1：5K DNA marker(從上到下依次為：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。采用相同的方法構(gòu)建了地衣芽胞桿菌WX-02，解淀粉芽胞桿菌LX-12中phop的敲除載體。

枯草芽胞桿菌敲除載體引物：

Bs-phop-KF1 GCCGAGCTCAAAGGCGGAGGCGAAATCGTG

Bs-phop-KR1 GTAGATCGGTTTTTTGGTATTGATTCTTCATCATCCACAAC

Bs-phop-KF2 GTTGTGGATGATGAAGAATCAATACCAAAAAACCGATCTAC

Bs-phop-KR2 GCTCTAGAAAATGCGGTACAAAGACTGGC

地衣芽胞桿菌敲除載體引物：

Bl-phop-KF1 GCTCTAGACAGGTGCTCAGTTATTTGAGGG

Bl-phop-KR1 GCTTTTTGCGGAGTCTTTGAAATTCCTGAAGAACCGTTATTGAC

Bl-phop-KF2 GTCAATAACGGTTCTTCAGGAATTTCAAAGACTCCGCAAAAAGC

Bl-phop-KR2 CGGGATCCTGCCTACTTTTGTGCCTTCA

解淀粉芽胞桿菌敲除載體引物：

Ba-phop-KF1 GCCGAGCTC TTATCCCGAAAGACCGTC

Ba-phop-KR1 TTGGCTCCTCCAGTTTATCGCCCTCCGCTGTCTATT

Ba-phop-KF2 AATAGACAGCGGAGGGCGATAAACTGGAGGAGCCAA

Ba-phop-KR2 GCTCTAGA CGGGACGTCATGTTTGTAT

實(shí)施步驟二、芽胞桿菌中phop敲除菌株的構(gòu)建

地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)WX-02中phop敲除菌株的構(gòu)建，其方法和步驟與枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)168中phop敲除菌株類似。芽胞桿菌感受態(tài)的制備方法如下：首先在平板上活化菌種，然后挑菌至含有5mL LB的PA瓶中，37℃過夜培養(yǎng)，隨后以5％的接種量轉(zhuǎn)接至生長培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)至OD600到0.85左右，5500rpm離心6min收集菌體，用洗滌培養(yǎng)基重懸菌體，5500rpm離心6min，重復(fù)三次后加入1mL洗滌培養(yǎng)基重懸菌體，分裝至滅過菌的1.5mL EP管中，-80℃保存。

將吹干后的電轉(zhuǎn)杯在冰上預(yù)冷15min，然后將100μL的枯草芽胞桿菌168的感受態(tài)細(xì)胞與10μL重組載體混勻后加入電轉(zhuǎn)杯中，冰上預(yù)冷3-5min后，2.4kV條件下點(diǎn)擊，電擊時(shí)間4.8-5.2ms，隨后立即加入800μL恢復(fù)培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)移至1.5mLEP管中。37℃，100rpm培養(yǎng)3h后涂LB平板(20μg/mL卡納抗生素)。待長出轉(zhuǎn)化子后挑菌進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證和抽質(zhì)粒驗(yàn)證，驗(yàn)證正確后保存菌種。驗(yàn)證引物為T2-F/R。

再對其進(jìn)行單交換菌株的獲得及鑒定，以枯草芽胞桿菌(B.subtilis)168中phop基因敲除的方法為例：首先挑取陽性枯草芽胞桿菌轉(zhuǎn)化子接種于含20μg/mL卡納抗生素的液體LB中45℃培養(yǎng)，對液體培養(yǎng)物稀釋10⁶倍涂布含卡納抗性的平板，放置45℃培養(yǎng)箱直至長出單菌落；挑選單菌落在卡納抗性的平板劃線，進(jìn)行PCR的驗(yàn)證，此時(shí)所用引物為T2-F和雙交換的下游引物或T2-R和雙交換的上游引物。PCR結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

對上面所得到的單交換菌株進(jìn)行雙交換傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間每代8h，不加抗生素，將第6代培養(yǎng)物稀釋106倍涂布LB平板，放置37℃培養(yǎng)箱中直至長出單菌落，隨后將單菌落分別對應(yīng)點(diǎn)種于含卡納霉素和不含卡納霉素的LB平板上，對在LB上長，卡納不長的單菌落采用雙交換引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，篩選雙交換菌株，對于陽性克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證并進(jìn)行測序。

圖2為敲除載體轉(zhuǎn)化枯草芽胞桿菌168菌落PCR驗(yàn)證圖，泳道1為載體構(gòu)建中的菌落PCR驗(yàn)證膠圖，泳道2：5K marker(從上到下依次為：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)，所用引物為載體上的驗(yàn)證引物T₂-F/R；圖3為枯草芽胞桿菌168中phop的敲除驗(yàn)證膠圖。泳道2：野生菌的雙交換驗(yàn)證的菌落PCR膠圖，泳道3：缺失株的雙交換驗(yàn)證的菌落PCR膠圖，泳道1：5K marker(從上到下依次為：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)，泳道1和2所用引物為雙交換驗(yàn)證引物Bs-phop-KYF/KYR。從圖中可以看出，phop已經(jīng)從基因組中敲除。采用同樣的方法，成功的敲除了地衣芽胞桿菌和解淀粉芽胞桿菌中的phop，構(gòu)建了相關(guān)芽胞桿菌中的基因phop缺失株。

用于轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證的引物為：

T₂-F ATGTGATAACTCGGCGTA

T₂-R GCAAGCAGCA GATTA CGC

芽胞桿菌中用于phop敲除驗(yàn)證引物分別為：

枯草芽胞桿菌中驗(yàn)證引物：

Bs-phop-KYF TGATACGGCAAGATTCAGAACA

Bs-phop-KYR AATGGCAAGGCTGTTCATCGC

地衣芽胞桿菌中驗(yàn)證引物：

Bl-phop-KYF AAAAACATCGTCGATGCACACA

Bl-phop-KYR TCTTGACTTGTGAGGTGGCATCT

解淀粉芽胞桿菌中驗(yàn)證引物：

Ba-phop-KYF GTTCCTCTCGTCCGTTATTCC

Ba-phop-KYR TGCGTAACCGCTGTAGGA

實(shí)施步驟三：phop缺失對芽胞桿菌生物量的影響

檢測phop敲除后的芽胞桿菌的表達(dá)，主要是在相關(guān)菌株的液體發(fā)酵，其流程依次為：將枯草芽胞桿菌，地衣芽胞桿菌和解淀粉芽胞桿菌及其相應(yīng)的缺失株分別接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，檢測phop缺失對其生物量的影響，其測定步驟如下：

(1)種子培養(yǎng)：

種子培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基：10g/L蛋白胨；5g/L酵母浸出粉；10g/L氯化鈉；pH 7.0-7.2；固體培養(yǎng)基加瓊脂18g/L；

種子培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度為37℃，250mL三角瓶中裝液量為50mL，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，培養(yǎng)時(shí)間為10h；

(2)液體發(fā)酵培養(yǎng)：

所用的液體發(fā)酵培養(yǎng)基：

LB培養(yǎng)基：8-10g/L蛋白胨；3-5g/L酵母浸出粉；8-10g/L氯化鈉；pH7.0-7.2；

ME培養(yǎng)基：20-25g/L一水合谷氨酸鈉；10-12g/L二水和檸檬酸三鈉；5-7g/L氯化銨；0.5-0.8g/L磷酸氫二鉀；0.2-0.5g/L硫酸鎂；0.02-0.04g/L氯化亞鐵；0.05-0.15g/L氯化鈣；0.1-0.3g/L硫酸錳；pH7.0-7.2；

液體發(fā)酵培養(yǎng)條件：發(fā)酵溫度為25-45℃，250mL三角瓶中裝液量20-100mL，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，發(fā)酵周期48h。

以枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)168及其phop缺失株的液體發(fā)酵為例。在平板上活化野生菌及其缺失株，挑菌接至含有50mL液體LB的250mL三角瓶中，37℃，180rpm培養(yǎng)10h，隨后以1％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，180rpm培養(yǎng)48h。在此期間每4h取樣繪制菌株生長曲線，以此研究菌體生物量的生成情況。采用同樣的方法，測定phop缺失對地衣芽胞桿菌和解淀粉芽胞桿菌生物量的影響。

圖7-9分別為枯草芽胞桿菌168、地衣芽胞桿菌WX-02、解淀粉芽胞桿菌LX-12及其phop缺失株在液體發(fā)酵條件下的生物量。再對芽胞桿菌液體發(fā)酵進(jìn)行生長曲線的繪制，如圖4-6分別為枯草芽胞桿菌168、地衣芽胞桿菌WX-02、解淀粉芽胞桿菌LX-12及其phop缺失株在液體發(fā)酵條件下的生長曲線。其步驟為，取2mL發(fā)酵液于2mL EP管中，10000rpm離心5min后上清轉(zhuǎn)移至另外一個(gè)2mL EP管中，按照相應(yīng)的稀釋倍數(shù)測得OD₆₀₀數(shù)值。如下圖7-9所示：地衣芽胞桿菌，枯草芽胞桿菌和解淀粉芽胞桿菌phop缺失菌的生物量相比于野生菌分別提高了1.33倍，1.64倍和1.54倍，表明phop缺失后生物量顯著提高。

當(dāng)然，以上僅是本發(fā)明的具體應(yīng)用范例，對本發(fā)明的保護(hù)范圍不構(gòu)成任何限制。除上述實(shí)施例外，本發(fā)明還可以有其它實(shí)施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍之內(nèi)。